抗体的分化与哈佛商学院从nRBCs HbA使用集群 在活的有机体内PAFC被激光脉冲辐照的基础上选择血管(图 1其次是线性的检测(图 1 (b)),特别是非线性(图 1 (c))声波和超声波传感器放置在附近的皮肤激光( 22]。镰状细胞可能形成HbS集群密度足以引起局部过热和纳米气泡的形成。PA非线性增强的信号从这些细胞,出现瞬态高振幅PA信号,甚至可能允许镰状细胞检测的其他抗体生成同质细胞内HbS分布。PT显微镜方法实现高分辨率成像的胞内Hb分布和两个激光器(pump-probe)用于探测单个细胞。探针梁传感泵beam-induced介质折射率的变化(热透镜模式)( 12, 17, 18]。

光谱的集成天车与PAM进行一个奥林巴斯IX81倒置显微镜平台(奥林巴斯美国,中心谷,PA)。PT和PA光谱获得可调谐光参量振荡器(详细、Opolette HR 355 LD OPOTEK, Inc .,卡尔斯巴德,CA) ( 17]。成像系统是基于激光由一对XY转向检流计镜子(6215 h,剑桥技术,列克星敦,MA)从脉冲激光(532 nm波长;5纳秒脉冲宽度;脉冲重复率,1 - 10千赫;卢斯,明亮的解决方案、意大利)。连续波(CW)与波长660纳米的激光二极管(电力技术、亚历山大、AR)是用于PT模式作为探针光束控制泵引起的折射率的变化(图 2(一个))。两个激光束聚焦到样品使用60 x客观(DPlan 60,奥林巴斯,Inc .)。探针光束被第二个沉浸收集样本后100 x客观(NA 1.00 LUMPlanFl 100年,奥林巴斯,Inc .)。探测器的散焦梁检测使用一个快速的光电二极管(PDA10A Thorlabs Inc .)。探测光束强度变化测量获得传输图像。吸收剖面的三维重建是用ImageJ软件使用一堆PT图像获得 z 设在取代聚焦目标在0.1 μ米的步骤。在PA光谱和成像模式下激光聚焦了10倍的目标(0.25计划消色差透镜,NA,奥林巴斯,Inc .)和声波探测到聚焦超声换能器(V316-SM 20 MHz;焦距:12毫米,奥林巴斯无损检测,沃尔瑟姆,MA)放在显微镜幻灯片 在体外或鼠标耳朵 在活的有机体内(图 2 (b))。PA信号preamplified(放大器模型,ag - 2010,昂达Corp .)、桑尼维尔CA)和记录。PA信号脉冲能量来计算其可能被规范化的PA图像和光谱样本。高速模拟-数字转换器董事会(pci - 5124,国家仪器公司)和定制软件(虚拟仪器、民族乐器)被用来获得信号在PA和PT模式。

PAFC是其他地方的详细描述 22]。PAFC系统配备了高重复率脉冲激光波长为532 nm和820 nm(卢斯532年和820年卢斯,明亮的解决方案)。声波检测使用3.5 MHz超声换能器(法国贝桑松Imasonic Inc .)。电子信号被放大并记录如上所述。

在体外PA检测红细胞单流都使用波长532纳米的激光在柠檬酸钠稳定血液样本,PBS稀释1:10⁴确保存在检测单个细胞的体积,以避免时间信号重叠。通过50个样本注入 μ(证件)石英毛细管1 mm / s的流速声波检测通过毛细血管壁紧随其后。 在活的有机体内直接在40 - PAFC执行 μ米耳静脉麻醉小鼠使用波长820纳米的激光。

在活的有机体内实验涉及裸体小鼠(ν/ν),黑色的C57BL / 6小鼠,和转基因小鼠表达人类镰状血红蛋白(股票Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA-HBBs) 41巴斯/ J小鼠[伯克利老鼠]),进一步被称为“SCD老鼠。“所有的研究都是按照协议执行机构批准的动物保健和使用委员会,阿肯色大学医学科学。动物与异氟烷麻醉在纯氧(1.5%),和放置在一个温控阶段(37°C)。对于每个动物我们选择合适的血管(50 - 70 μm-in-diameter耳静脉)。激光束是定位在船和PA信号跟踪记录至少10分钟。非线性功放信号获得船只通过增加激光能量的步骤。信号跟踪记录1分钟每一层的激光能量。为了证明PA的可行性检测哈佛商学院,100 ~ μ静脉注射L从SCD小鼠全血注射到裸鼠和PA的变化信号跟踪记录20分钟。增强抗体的存在通过哈佛商学院聚合在缺氧红血球SCD老鼠,我们在选择引发了缺氧小鼠通过异氟烷浓度从1.5%逐渐增加到4 - 5%的水平。高麻醉浓度降低血压( 24]。2 - 3分钟后异氟烷浓度5%,血流速度通常下降到一个句号。观察小鼠的非线性功放信号后,异氟烷的浓度是返回到正常水平恢复血液流动。

全血样品捐献者SCD老鼠从尾静脉收集并与3.2%柠檬酸钠稳定。血涂片固定与甲醇进行了研究使用35毫米的玻璃盘。紫外可见光谱分析,Hb与生理相关解决方案总Hb浓度(110 - 160 g / L)是由溶解Hb粉(H0392和H0267镰刀和正常Hb,分别Sigma-Aldrich,有限公司,圣路易斯,密苏里州)。对于光谱分析,所有血液样本被温柔的反演含氧10分钟的样品管。血液氧合验证了使用光学吸收谱和现有参考光谱( 25]。为了证明意义或无意义的光谱变化,每个样本的测试光谱的差异比较与错误在这些条件下的总和。

人类血液样本稳定与3.2%柠檬酸钠是获得健康的志愿者的基本医学部门莫斯科国立大学(密歇根州立大学),俄罗斯。所有的实验都是密歇根州立大学IRB委员会的批准。

我们进行了传统的光学光度为Hb /吸收测量解决方案和血液健康控制和转基因SCD老鼠表达人类的哈佛商学院。比较与参考光谱的含氧Hb (HbO₂)表明,在所有的样品中,HbO的内容₂增长了90%。实验数据(图 3(一个))展示了一个非常好的协议之间的光谱裸小鼠血液,哈佛商学院含有血液,和人类血液不足2%平均偏离人类血液频谱选为参考。样本的总光吸收的差异与不同的血细胞比容水平相关的健康和SCD血 26];因此,吸收光谱被规范化为进一步比较。此外,我们收购了PA光谱线性PAM模式以相对较低的能量量(20 mJ /厘米²)从一个小卷(单个细胞层面)的镰状和正常细胞,避免平均HbA和哈佛商学院的一个更大的样本,以减少光散射进入细胞的影响。PA正常和SCD血红蛋白的光谱匹配与HbO的吸收光谱测量₂解决方案和氧合血红蛋白谱(图 3 (b))按照以前公布的HbA和哈佛商学院的光谱 25]。因此,在传统的HbA吸收光谱没有显著差异,哈佛商学院,PA单细胞光谱观察除了轻微的光谱范围的差异在某些测量590 - 660海里。然而,这个特性是不够的在当前阶段的光谱识别抗体生成,需要额外的验证。

共焦天车成像( 17)是唯一适合映射细胞Hb住红细胞表面的分布。像我们展示了以前,传统的由光散射透射显微镜可能阻碍工件和低吸收灵敏度( 12, 17由于单个细胞的短光通路。PT(数字图像没有光散射的影响 4(一)和 4 (b))。高分辨率共焦天车演示的能力高分辨率(0.3 - -0.5 μ米)成像的住在玻璃表面抗体 在体外不使用任何捕获或细胞的固定化技术。PT数据显示存在的细长的哈佛商学院面向集群的主要沿着主轴的细胞(图 4 (b))。3 d重建PT信号nRBCs和抗体(图 4 (c))证实,哈佛商学院与哈佛商学院的外观紧密凝聚在抗体群与更高的地方吸收相比,细胞内的背景。因为PT信号振幅成正比细胞吸收,提出了3 d图像(图 4 (c))反映了细胞吸收分布。因此,PT的映射细胞内吸收分布显示出更深刻的异构在吸收抗体尤其是在镰状细胞的形状。然而,PT信号平均在整个细胞内线性模式较低的激光能量显著影响证明(2-4-fold)低振幅比从nRBC(图素抗体 4 (d))建议降低乙肝抗体生成的内容。PT信号振幅的差异从圆和镰状抗体不显著;然而,在某些情况下,信号振幅从镰状抗体有点低。

哈佛商学院的发现具有高的吸收当地的集群在抗体导致我们假设空间选择性激光过热哈佛商学院的集群可以生成nanobubbles作为PA信号放大器( 27]在哈佛商学院集群。因此,尽管素抗体较低的平均吸收,nanobubbles可显著提高PA信号幅度高于nRBCs背景,从而使选择性PA检测抗体生成的非线性模式成为可能。来验证这个假设,我们最初获得线性PA nRBCs和抗体生成的图像(数字 5(一个)和 5 (b)),非常类似于线性PT(数字图像 4(一)和 4 (b))。他们表现出许多与异常镰状细胞形状。估计在非线性模式下激光能量的影响,我们从单个细胞测定PA信号振幅的函数为nRBCs激光能量影响,圆和镰状抗体(图 5 (c))。所有nRBCs和一些圆形的镰状抗体提供了线性PA信号能量影响的600 - 800 mJ /厘米²在波长532 nm和PA信号振幅从抗体低于从nRBCs符合PT数据(图 4 (d))。然而,一些抗体与不对称sickle-like形状提供了一个戏剧性的PA非线性增加信号振幅能量量超过200 mJ /厘米²(图 5 (c))。平均而言,镰刀型抗体生成演示3-5-fold信号增强,可使他们在附近的圆素抗体和nRBCs(图 5 (d))。是很重要的细胞保持视觉检测后完好无损。非线性PA效果没有造成损害细胞膜在实验期间或之后30分钟。

确认上面的发现与细胞流,正常和SCD老鼠的血液样本进行了分析 在体外PAFC的流速1毫米/秒50的毛细管 μ米直径。由于考评的时间重叠信号从单个红细胞表面正常的血药浓度,血液样本顺序稀释导致减少PA信号平均背景和增加背景波动由于低数量的细胞检测体积(图 6(a))。在高度稀释血液样本,我们观察到瞬态PA以上噪声信号对应于单个细胞通过检测区域。稀释的样本在10⁴减少PA背景和数量的峰值,但不是峰值振幅,确认单个细胞的检测。在这些条件下,PA信号振幅从单一nRBC健康小鼠(数字 6(b)和 6(c))高出2 - 3倍比SCD老鼠(数字 6(d)和 6(c)),证实了先前的PT(图 4 (d))和PA(图 5 (c))图像数据。这一发现表明,有一个更高的总Hb内容每个细胞在健康小鼠和至少抗体识别的可能性 在体外基于信号振幅的分析。

PAFC的比较数据 在体外和 在活的有机体内,我们从耳朵PA信号监测静脉(50 - 70 μ米直径)在健康和SCD老鼠。增加激光能量和类似血管参数,我们观察到三个现象:(1)降低PA SCD小鼠血管的背景信号,(2)更强的PA背景信号波动SCD老鼠,和(3)的瞬态信号的峰值在SCD的老鼠相对较高的激光能量(图 7(一))。这些发现符合我们PT和PA数据 在体外显示较低的PA信号振幅从个体素抗体,异种的PA信号幅度分布,分别从镰状红细胞表面和非线性PA信号放大,(数字 4 (d), 5 (c), 5 (d), 6(b), 6(d) 6(c))。高脉冲重复率(10 kHz)在波长820纳米的激光操作被用来估计近红外(NIR)激光的临床角度深入皮肤渗透相比在532 nm激光。此外,在近红外光谱范围在820 nm,血氧不影响PA信号,Hb和HbO₂有类似的吸收水平。尽管PA背景可能会增加由于SCD小鼠皮肤色素与裸体小鼠相比,PA信号从类似的船只被高于皮肤使vessel-related现象的观察没有强大的皮肤色素的影响。我们强调,在相对较高的能量影响300 - 400 mJ /厘米²,我们观察到增强的PA背景波动和瞬态PA山峰SCD老鼠(图 7(一)右),没有健康小鼠(图中观察到 7(一)(左)。这些信号可能与之前发现的PA信号的非线性放大HbS集群。没有观察到的组织或血管损伤甚至30 - 40分钟后长期监测。

为了验证这些发现,在同等条件下在较早的研究中,100年 μL血液样本收集从SCD鼠标直接注入健康老鼠的血液循环。我们观察到瞬态PA山峰上面噪音以前没有在PA信号跟踪(图 7 (b))。这些PA山峰只持续了3 - 10分钟后注入暗示他们在健康小鼠快速清关。我们还测试了PA检测控制C57BL / 6小鼠也有色素的皮肤和类似的遗传组成SCD老鼠但没有表达哈佛商学院。PA C57BL / 6小鼠(图的痕迹 7 (c))从控制获得的类似裸小鼠(图 7(一))和特色没有瞬态信号。

证明PA监测的可行性SCD疾病的早期表现,我们降低小鼠血氧增强聚合用更高浓度的哈佛商学院的麻醉药物(异氟烷)导致额外数量的镰状抗体和哈佛商学院的集群。从典型的1.5%异氟烷浓度增加到(图4 - 5%的水平 7 (c)和 7 (d)),足以显著降低呼吸频率和血液流动压力。5%异氟烷的使用超过5分钟被避免,因为它可能会放缓呼吸足以通过缺氧导致死亡。瞬态PA信号观察只对SCD的老鼠~麻醉浓度4%,虽然没有峰出现健康老鼠甚至在5%的水平(保持直到完成终止血流通过静脉)。PA非线性瞬态信号检测在SCD老鼠长达10分钟后减少异氟烷浓度降到正常水平(1.1 -1.5%)确认后的一些细胞解聚的哈佛商学院缓慢甚至恢复氧气供应。健康和SCD老鼠,麻醉浓度超过3.5%的增加导致血流速度降低,减少血管直径。减少容器直径与血液中脱氧作用导致减少船的PA信号在高异氟烷的浓度。在许多情况下波动考评的信号跟踪高SCD小鼠与正常小鼠相比,从而确认“波动”的能力PAFC区分SCD的疾病。