CXCR4基因多态性与乳腺癌的表达

摘要

趋化因子受体CXCR4基因多态性及其表达水平与癌症的发展和预后有关。本研究旨在探讨趋化因子受体CXCR4乳腺癌标本中rs2228014 mRNA和蛋白表达的多态性。据观察，患者的表现更高趋化因子受体CXCR4mRNA相对表达量为正常乳腺的5.7倍，但与患者临床病理特征(核级别、淋巴结状态、ER状态、PR状态、p53染色、Ki67指数、HER-2状态)无相关性。此外,趋化因子受体CXCR4对于T等位基因的存在与否，mRNA的相对表达也没有差异()在免疫组化分析中，不同基因型的CXCR4细胞质蛋白染色无差异(）;然而，在浸润性乳腺癌中证实了高胞浆CXCR4染色()总之，本研究的结果表明rs2228014基因变异不会改变趋化因子受体CXCR4mRNA或蛋白质表达。然而，与正常组织相比，该受体在RNA和蛋白质水平上在肿瘤中的表达更高，表明其在乳腺癌发生的一般背景下具有良好的适用性。

1.导言

趋化因子是根据其诱导趋化性的能力而确定的，它不仅在炎症和免疫监测中，而且在癌症的进展中都具有重要作用[1.]由原发性肿瘤或转移部位的肿瘤细胞或被招募和/或局部激活的基质细胞分泌的趋化因子可作为生长因子[2.]，增加转移形成和血管生成[3.]或诱导免疫抑制微环境的形成。

趋化因子受体4（CXCR4）是一种跨膜受体，属于CXC趋化因子受体家族，最初被报道介导白细胞归巢到产生SDF1/CXCL12的组织中[4.］．此外，据报道该受体可由癌细胞表达[5.,6.]许多回顾性研究证明，各种趋化因子受体，特别是CXCR4的表达与黑色素瘤患者的不良预后相关[7.]和乳腺癌[8.］．

这个趋化因子受体CXCR4该基因位于染色体2q2上，其中在密码子138处发现单核苷酸多态性rs2228014（C/T）[9,10］．Teng等人[11]研究表明，这种多态性与口腔癌的III期和IV期以及淋巴结转移有关[12尚未发现CXCR4多态性与子宫内膜癌易感性之间存在显著关联。

Jin等人[13显示内皮细胞分泌的CXCL12与表达cxcr4的肿瘤细胞相互作用足以刺激跨内皮细胞迁移。这些结果提示CXCL12/CXCR4轴在血管生成和肿瘤细胞传播中起重要作用。由于这两种蛋白都很容易通过免疫组化在人类乳腺癌样本的很大一部分中被识别，CXCR4可能构成治疗的分子靶点。

CXCR4可能在乳腺癌中过度表达[14]CXCR4/CXCL12轴可能参与乳腺癌细胞的迁移，进而参与乳腺癌细胞的侵袭和转移[15]Kang等人[16]研究表明，在人类乳腺癌组织中，CXCR4表达水平与淋巴结转移显著相关，提示该受体可能是乳腺癌治疗中有用的预后指标和潜在的治疗靶点。

在此背景下，本研究的目的是研究CXCR4 rs2228014基因多态性对乳腺肿瘤样本中其基因和蛋白表达的影响。

2.材料和方法

经LunDelina州立大学人文伦理委员会批准（CEP/UEL 189 /2013-CAAE 17123113400005231），从乳腺癌患者身上采集组织样本。在收集生物材料之前，所有样本捐赠者和相关医生签署了自由知情同意条款。临床分期根据国际癌症控制联盟分类标准确定[17］．侵袭性乳腺癌组织样本来自74名未接受辅助或新辅助化疗的女性患者，她们在巴西Londrina癌症医院(Paraná， Brazil)接受了手术。tumor-node-metastasis (TNM)系统是用于分类的疾病状态基于恶性肿瘤的主要形态属性被认为影响疾病预后:原发肿瘤的大小(T)区域淋巴结的存在和程度(N),和远处转移的存在(M)。

2．1．从乳房组织中提取DNA

采用盐析法从浸润性乳腺癌组织标本中提取基因组DNA[18，并采用NanoDrop 2000c分光光度计(Thermo Scientific Inc.， Wilmington, USA)在260 nm和280 nm波长下进行定量。

2.2.聚合酶链反应（PCR）：CXCR4

DNA (100 ng)用特异性引物分析趋化因子受体CXCR4PCR反应(GenBank登录号NM_003467.2)。引物序列如下:Forward 5 ' -AACTTCCTATGCAAGGCAGT-3 '和Reverse 5 ' -TATCTGTCAT ctgcctact -3 '。使用缓冲试剂盒和1.25单位Taq聚合酶(Invitrogen公司，Carlsbad, California, USA)扩增样品。在Hybaid PCR Sprint热循环仪(Biosystems, Guelph, Ontario, Canada)中，PCR条件为94°C变性5分钟，94°C 45秒35个循环，60°C 1分钟，72°C 1分钟和15秒，72°C延伸10分钟。236个碱基对的扩增片段在2%琼脂糖凝胶中进行电泳分析，蓝绿试剂(LGC Biotecnologia, Sao Paulo, Brazil)染色后使用紫外荧光可视化。所有反应都进行了阴性控制，以确保没有污染。

2.3.CXCR4基因分型

PCR产物经酶切酶切BccI（英国新英格兰生物实验室）4天 在37°C下，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析酶切产物，并通过银染色的非放射性同位素技术进行检测。当存在等位基因变体时，起始密码子138第3952位的胸腺嘧啶（T）改变胞嘧啶（C）可消除限制位点[19］．C等位基因的产物为103和133个碱基对，T等位基因的产物为236个碱基对，从而表征出三种可能的基因型:TT(突变等位基因纯合)，CT(杂合)，CC(野生型等位基因纯合)。

2.4.RNA分离和逆转录酶反应

根据制造商的说明，使用TRIzol LS试剂（Invitrogen）提取细胞总RNA，并使用NanoDrop 2000c分光光度计（美国威尔明顿热电科学公司）进行定量。使用500 在以下条件下，将RNA、20单位克隆的莫罗尼小鼠白血病病毒逆转录酶（M-MLV RT，Invitrogen）和4单位重组核糖核酸酶抑制剂（RNaseOUT，Invitrogen）的RNA、RNA、RNA、RNA、RNA和RNA分别转化为：2.5 μM寡糖dT，50 mM-Tris-HCl pH值8.3，75 毫米KCl，1.5 mMgCl_2.，及1.25 dNTP的毫米，在42°C下持续60 热循环器中的最小值。

2．5．实时荧光定量PCR检测CXCR4

在第一步实时PCR热循环仪（美国福斯特市Applied Biosystems）上使用铂SYBR Green qPCR SuperMix UDG（Invitrogen）进行定量实时PCR（qPCR）。用于扩增CXCR4和GAPDH的引物如表所示1.．qPCR反应分为95℃30秒、54℃30秒、72℃30秒共40个循环，每次升温检测荧光，确认特异性扩增。在反应结束时始终进行熔化曲线分析，以检查引物-二聚体的人为因素和污染。此外，在所有实验中，适当的不含模板的阴性对照均采用相同的程序，以排除或检测任何可能的污染。

相对mRNA表达水平趋化因子受体CXCR4是根据方法[20.]并通过先前特征化的家政基因正常化GAPDH．除了邻近的正常乳腺肿瘤RNA组织，人类正常乳腺RNA的商业库(Clontech Laboratories Inc.， Mountain View, CA, USA)也被用作非肿瘤样本。

2.6。免疫组织化学染色

免疫组化分析，5μ组织切片取自乳腺肿瘤标本。样品在56°C下加热，在二甲苯中脱蜡，并在分级乙醇系列中再水化。用柠檬酸盐缓冲液和针对人CXCR4（1）的小鼠抗体进行抗原回收 : 使用100稀释度（美国加利福尼亚州圣地亚哥市eBioscience）。切片在室温下稳定30分钟 第二步使用PBS（磷酸盐缓冲盐水）和抗小鼠/兔HRP二级抗体（美国加利福尼亚州圣巴巴拉市Bio SB公司）清洗。使用二氨基联苯胺（DAB）显色剂系统（Sigma-Aldrich，美国），用吉尔苏木精和玻片在加拿大香脂中进行反染色。在肿瘤和邻近正常组织中评估CXCR4的标记。由合格的病理学家在光学显微镜（Eclipse-E200，日本尼康）下进行读数。该标记物的分析方案是在研究实验室制定的。

我们采用德国半定量评分系统，考虑到IHC染色强度和面积范围，这在以往的研究中被广泛接受和使用[21,22］．根据染色强度对每个病变进行评分:弱染色= 1，中等染色= 2，强染色= 3。进行对照以验证一抗的特异性，所有分析均由至少两名病理学家独立进行。然而，如果个别评分存在差异，两名病理学家在合并个别评分前通过达成一致意见重新评估免疫组化切片。

2.7。统计分析

一个样本使用GraphPad Prism version 6.00 for Windows (GraphPad Software, La Jolla, California USA)进行-test分析mRNA CXCR4的相对表达。采用spss22.0软件(SPSS Inc.， Chicago, Illinois, USA)分析mRNA表达、蛋白表达和rs2228014多态性与乳腺癌临床结局的关系。一个值< 0.05认为有统计学意义。

3.结果

本研究对74例女性乳腺癌患者进行CXCR4 rs2228014 (C/T)基因多态性及mRNA表达检测。患者的中位年龄为58岁(从31岁到86岁不等)，在巴西巴拉那的Londrina癌症医院确诊。

根据国际癌症控制联盟确定的临床标准，大多数患者(90.7%，68/74)诊断为浸润性导管癌[17］．肿瘤平均大小为2.7 cm±1.6 cm，中位大小为2.2 cm。

对于遗传多态性分析，采用PCR-RFLP方法，使用BccI限制性内切酶趋化因子受体CXCR4rs2228014基因型（图1（a）)．频率显示，58例(84.1%)患者为CC基因型，11例(15.9%)患者为CT基因型，无TT纯合子(0.0%)(图)1（b）).我们样本中的基因型分布与Hardy-Weinberg平衡（HWE）给出的理论分布没有差异。

无显著性差异趋化因子受体CXCR4根据临床病理特征（如肿瘤组织学）观察基因型分布()，核级()，节点状态()、雌激素受体状况()、孕激素受体状态()、p53 (), Ki67 ()，以及HER-2状态()(表2.)．

的表达趋化因子受体CXCR4用qPCR检测乳腺肿瘤组织和正常乳腺组织中mRNA的表达。据观察，乳腺癌患者的死亡率较高趋化因子受体CXCR4mRNA相对表达（5.7倍）比正常乳腺的mRNA高（图2.)．

CXCR4 mRNA的相对表达也根据临床病理特征进行评估，如核分级(；Rho = 0.079)，节点状态(；rho=−0.161），ER状态(；rho=0.042），PR状态(；Rho = 0.169)， p53 (；rho=0.011），Ki67(；rho=−0.034）和HER-2状态(; rho=0.073）；然而，没有观察到统计差异。

CXCR4 mRNA的相对表达与rs2228014基因型相关，Mann-Whitney检验显示，T变异等位基因的存在与否没有显著差异()（图3.)．

在免疫组化分析中，尽管CXCR4细胞质蛋白水平与rs2228014基因型相比无差异()，在浸润性乳腺样本中证实了高细胞质CXCR4染色（图4.)．

根据乳腺癌淋巴结状态验证CXCR4细胞质表达时，未观察到显著相关性(；rho=−此外，尽管CXCR4蛋白的表达没有因rs2228014基因型分布而改变()(表3.)，肿瘤微环境中蛋白表达高于相邻正常乳腺组织()验证。

趋化因子受体CXCR4根据其免疫组化蛋白表达情况检测mRNA水平，但无显著差异()（图5.)．

4.讨论

多种临床、病理和组织学特征与乳腺癌相关。幸运的是，临床病理参数已得到验证，并可作为乳腺癌全身治疗和预后的指导。包括肿瘤大小、淋巴结受累、组织学类型、分级和患者年龄[23]此外，雌激素是一种刺激细胞增殖的生长因子，雌激素受体（ER）介导其作用[24］．大约70%的乳腺癌表达ER alpha并且是激素依赖的[25］．根据这个频率，67.1%的样本表达了雌激素和孕酮受体。在组织学分类方面，90.0%的患者为浸润性导管癌(invasive duckcarcinoma, IDC)，这与Harris和Solin的观点一致[26研究发现，乳腺癌患者IDC的发生率为47-79%，浸润性小叶癌(ILC)的发生率为2-15%。

此外，我们还研究了趋化因子受体CXCR4基因多态性与乳腺癌临床病理发展的关系。分析CC基因型58例(84.1%)，CT基因型11例(15.9%)。根据临床病理特征，CXCR4基因型分布无明显差异。

Kucukgergin等[27报道说趋化因子受体CXCR4多态性可能有助于肌肉浸润性乳腺癌在土耳其人口。此外，Lee等人[28]已经证实肺癌患者携带纯合子TT基因型rs2228014趋化因子受体CXCR4与不同基因型相比，多态性有发展为晚期疾病和较差预后的趋势。纯合TT和杂合CT基因型也与肾细胞癌发生的高风险显著相关[29］．

本研究分别采用real-time PCR和免疫组化方法对CXCR4基因表达和蛋白检测进行评价。我们观察到，大多数乳腺癌患者CXCR4 mRNA相对表达量高于正常乳腺mRNA(5.7倍)，肿瘤微环境中CXCR4蛋白表达量高于肿瘤旁组织。然而，CXCR4 mRNA的平均水平与CXCR4免疫组化状态没有差异。

在这种情况下，据报道基底样和HER2富集型乳腺癌亚型比其他亚型更常表达CXCR4染色。此外，淋巴结受累与这些亚型的CXCR4染色之间也存在正相关关系[30.］．此外，腋窝淋巴结阳性一直是乳腺癌诊断、治疗及后续研究的重要组成部分。希勒等[31]分析了有关CXCR4在乳腺癌淋巴结转移中的表达以及CXCR4升高对淋巴结转移的预后和/或预测意义的文献。他们得出结论，CXCR4水平是局部晚期乳腺癌患者的一个预测指标。

我们的结果显示，通过免疫组化分析，浸润性乳腺癌组织中的细胞质CXCR4表达较高，尽管CXCR4基因型之间没有差异()．

有令人信服的证据表明，被称为癌干细胞的癌细胞亚群在肿瘤发生、转移定植和治疗抵抗中起着关键作用。尽管调控癌干细胞的转移生态位所产生的信号尚未完全被理解，但越来越多的证据表明CXCL12/CXCR4轴的y作用[32]指出了靶向CXCL12/CXCR4信号通路在癌症管理中的潜力，重点研究了该通路在癌症和癌症干细胞中的生理功能。

在这方面，Sobolik等人[33]通过对表达CXCR4的MCF-7细胞的活体成像显示，肿瘤细胞向血管迁移并转移至淋巴结。因此，CXCR4可以促进上皮细胞向间充质细胞的转化，同时上调对细胞迁移、淋巴侵袭和肿瘤转移具有重要作用的趋化因子受体和细胞因子。

虽然这项研究没有确定治疗后的远处转移和复发，但已经有相当多的关于CXCR4在乳腺癌向CXCL12产生器官转移中的作用的知识[33–36］．鉴于这一功能，我们可以合理地假设CXCR4的表达，无论是在mRNA水平还是在蛋白水平上，都可能是一个有用的指标，表明转移风险较高。此外，应考虑CXCR4用于识别可能发生或防止远处转移的患者。在这方面，评估CXCR4作为乳腺癌分子生物标志物的表达是非常必要的，这可能需要一个标准化的评分系统来完成。

最后，这项工作显示CXCR4在乳腺肿瘤组织中的mRNA和蛋白水平表达增加，但这种增加不受rs2228014基因多态性的影响。总而言之，总的来说，目前的研究结果表明CXCR4受体在乳腺癌发生的一般情况下是一个有希望的标志物。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

致谢

作者要感谢使这项研究成为可能的志愿者和巴西隆德里纳隆德里纳癌症医院。这项研究得到了国家环境保护科学技术委员会（CNPq）、高等教育技术合作组织（CAPES）、阿拉伯基金会（Fundaço Araucária）、中央秘书处（Secretia da Ciència）、高等教育技术合作组织（SETI）和隆德里纳州立大学研究生协作组织（PROPPG-UEL）的支持。

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