的识别bapA在菌株沙门氏菌血清无性系种群。肠与墨西哥锡那罗亚圈养的野生动物隔离

摘要

bapA、 先前命名stm2689，编码BapA蛋白，它与纤维素和毛一起构成生物膜。生物膜是在胞外多糖基质中生长的微生物群落，可粘附在活组织或惰性表面。生物膜的形成与在不同环境中持续存在的能力有关，这有助于多种物种的致病性。我们分析了bap共83株，17种血清沙门氏菌血清无性系种群。肠库利亚坎动物园和Mazatlán水族馆的圈养野生动物。每个分离物扩增产物667 bp，与预期大小一致bap一个启动器，在不同血清分析中没有观察到差异。bap一个基因被发现在人类中高度保守沙门氏菌可以针对不同来源的这种生物进行属特异性检测。自bap表达提高了宿主外的细菌增殖，促进了对消毒剂和干燥的抗性，提高了宿主的存活率沙门氏菌在自然环境中可能更受青睐。因此，来自这些动物的细菌污染的风险增加了。

1.介绍

生物膜，由纤维素、毛和生物膜相关蛋白A (BapA，编码bapA） 是在胞外多糖基质中生长的微生物群落，可粘附在惰性表面或活组织上[1.］．生物膜的形成与在不同环境中持续存在的能力有关[2.]，这有助于几个物种的致病性[3.]研究表明，由于其物理结构和多层生物膜的形成，在生物膜中生长的细菌比在浮游培养物中生长的细菌更耐抗菌剂[4.]。虽然急性细菌感染可在短暂的抗生素治疗后消除，但生物膜产生菌的感染通常无法完全消除，并导致反复感染，这只能通过更换最初的抗生素治疗来解决[3.］．

沙门氏菌是杆状细菌，通常存在于生物膜中[5.］．这个属包括有鞭毛，没有孢子的革兰氏阴性细菌，它们在动物的消化道和有利于长时间生存的环境中大量繁殖，这使得消灭它们很困难[6.］．

毛对生物膜的形成有重要作用沙门氏菌[7.］．这些蛋白质结构识别广泛的分子目标，允许细菌与不同的表面相互作用，并附着在宿主的特定组织上[8.]例如，1型菌毛是薄而坚硬的粘附结构，表达FimH粘附素，促进细菌粘附到上皮细胞并侵入上皮细胞[9]1型菌毛也介导与非生物表面的相互作用[9］．

沙门氏菌生物膜基质由纤维素、毛和BapA组成。胞外多糖纤维素是这些基质的主要组成部分，在抗干燥、消毒剂和紫外线方面发挥着重要作用。纤维素的生产是由环核苷酸c-di-GMP的结合调节的，其合成依赖于一个含GGDEF结构域的蛋白家族[10］．

后沙门氏菌感染后，粪便中的细菌继续清除，导致慢性无症状携带者。一旦排泄到环境中，沙门氏菌能够抵抗人类或动物食用的粪便和食物长期脱水[11,12］．由于这种细菌能附着在许多表面上，并能抵抗常见消毒剂的作用，因此环境中出现这种细菌是一个公共卫生问题，因为沙门氏菌病是一种人畜共患疾病[13]。此外，由于多种因素，生物膜中的细菌对抗生素具有更大的耐药性。例如，这些细菌存在复制和代谢异质性，从而影响抗生素的作用和生物膜的结构，从而阻碍抗菌剂的作用[10］．

了解这一细菌属生物膜形成的能力将使我们能够建立预防措施，防止动物和人类，特别是那些与受感染动物密切接触的人爆发疾病。确定与细菌耐药性有关的基因将决定治疗动物健康问题所需的抗生素治疗类型。因此，本研究的目的是检测是否存在bap一个在沙门氏菌从圈养的野生动物中分离出来的菌株。

2.材料和方法

2.1.菌株

83株沙门氏菌属于17种不同的浆液(表1.)研究中使用了从墨西哥锡那罗亚库利亚坎和马萨特兰动物园和水族馆圈养动物的围栏、食物和粪便中获取的数据。所有分离物均由墨西哥DF流行病学诊断和参考研究所（InDRE）肠道细菌学实验室通过生化和血清学方法确认，并保存在营养冷冻培养基上，直到进行测试。沙门氏菌以美国型培养物(ATCC)中的鼠伤寒菌14028S作为对照菌株。

2．2．菌株的回收和纯度验证

沙门氏菌从含有大豆肉汤甘油（冷冻培养基）的保存培养基中回收菌株，转移到胰蛋白酶大豆肉汤中，并在37℃下培养18天 h、 将获得的细菌悬浮液接种在MacConkey和XLT4琼脂上，以确认沙门氏菌将菌株转化为乳糖，并目视分析在37°C下培养24小时的菌株纯度 h、 在含有血琼脂基（BAB）的倾斜管中接种确认菌株，直到进一步使用。

2．3.细菌的DNA提取

用商业基质(InstaGene matrix, Bio-Rad®)从分离的菌株中提取DNA。

2.4.DNA的PCR鉴定bapA.

根据已发表的DNA序列，合成了用于PCR的寡核苷酸引物bap基因[10]分别具有以下核苷酸序列：正向，5′-GCCATGGTGCTGGAAGGCCTGGCGGTT-3′；反向，5′-GGTCGACGGGAAGGGTAATGAATGACCTTC-3′。扩增在一个热循环器（Bio-Rad，MJ微型个人热循环器）中进行，反应混合物为25 μ五十、 里面有5个 μ模板DNA的L, 1μ10pmol L^−1.)在每个正向和反向引物中，12.5 μL PCR SuperMix（22 mM-Tris-HCl，55 嗯 氯化钾，1.65 mMgCl_2., 220年μdGTP, 220μdATP, 220μdTTP, 220μM dCTP和22 U/mL重组Taq DNA聚合酶)μ氯化镁_2.(50毫米)。最终体积是用无核酸酶水制备的。PCR程序包括在94°C初始变性5分钟，接着是变性(94°C 1分钟)、退火(50°C 45 s)和延伸(72°C 1分钟)30个循环。最后在72°C下伸展5分钟。扩增产物在0.5x Tris-EDTA电泳缓冲液中，用1.5%琼脂糖凝胶预染色GelRed(溶液为1:10 000)进行海底凝胶电泳分离。采用100 bp的DNA ladder (Bio-Rad)作为分子量标记。凝胶文件系统显示凝胶™EZ GelDoc，并拍照进行分析。

2.5.统计分析

出现的频率bapA根据先前报告的公式确定[14］．采用流行病学资料分析程序Epidat 3.1进行卡方检验，以确定不同血清组间是否存在显著统计学差异。

3.结果与讨论

对来自17个不同血清的83株菌株进行了PCR反应bap一个放大了667的乘积 bp，它对应于bap引发剂(图1.)．重要的是，在测试的不同血清中，没有发现该启动元件的差异。其中65株从动物粪便(哺乳动物、鸟类和爬行动物)中分离得到，6株从动物粪便中分离得到美洲蟑螂和家蝇从食物中分离出2株，从生物过滤器中分离出1株，分别从水和土壤中分离出4株和5株。

所有血清型均扩增bapA、 与以前的结果一致[10],这表明bapA在不同血清之间和不同血清内都是一个非常保守的基因，具有很高的同一性(99%)[15］．这种保存提供了诊断的优势，因为存在bapA可以用来识别沙门氏菌在不同环境中的属[16］．

BapA属于一个大的表面蛋白家族，参与细菌粘附到各种表面和生物膜的成熟[17]这种蛋白质以前被命名为Stm2689，在小鼠肠道定植以及细菌向其他器官传播的模型中起着重要作用[18］．在这项研究中，从没有胃肠疾病的野生动物的粪便中分离出菌株，这表明这些动物的肠道定植部分与大肠杆菌的存在有关bap一个基因。支持这一观点的是，之前的研究比较了沙门氏菌带或不带的菌株bap结果表明，突变菌株的定殖率低于野生型菌株bapA[19］．

让这些病原体在动物消化道中持续存在的机制尚不清楚。然而，肠道的持久性沙门氏菌在临床健康动物中观察到的spp会增加细菌污染的风险，因为bap表达可确保更多的细菌在宿主之外存活并保持其感染能力。这使细菌能够抵抗干燥和消毒剂的作用；因此沙门氏菌在自然环境中可能更受青睐[20,21]。进一步了解细菌肠道持久性的相关机制将有助于制定创新策略，保护公众免受沙门氏菌病（一种自然人畜共患病）的影响。

4.结论

bap从圈养野生动物中分离出的属于17个不同血清型的83个菌株中均鉴定出A，这表明该基因在野生动物中是高度保守的基因沙门氏菌并且可以从不同来源和诊断潜力针对该生物体进行属特异性检测，这需要加以探索。此外，大多数检测呈阳性的动物都是无症状携带者。这对卫生保健领域的专业人员提出了挑战，因为沙门氏菌在许多环境中生存表明，它的传播在未来可能会继续增加。

相互竞争的利益

作者声明，本论文的发表不存在任何利益冲突。

致谢

作者感谢2011年的《研究项目激励和支持计划》(PROFAPI，翻译为研究项目激励和支持计划)提供的资金。

参考文献

1. A.P.White，D.L.Gibson，G.A.Grassl等人，“通过红色、干燥和粗糙的形态类型聚集在细胞中不是一种毒力适应沙门氏菌血清血清型鼠伤寒，“感染与免疫，第76卷，第3期，第1048-1058页，2008年。视图:出版商网站|谷歌学者
2. N.Gruzdev，R.Pinto和S.Sela，“干燥对植物耐性的影响”沙门氏菌血清面对多重压力，”应用与环境微生物学，第77卷，第5期，第1667-1673页，2011年。视图:出版商网站|谷歌学者
3. T.-F.C.Mah和G.A.O'Toole，“生物膜抗抗菌剂的机制，”微生物学进展，第9卷，第1期，第34-39页，2001年。视图:出版商网站|谷歌学者
4. R.M.Donlan和J.W.Costerton，“生物膜：临床相关微生物的生存机制，”临床微生物学综述，第15卷，第5期。2，页167-193,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
5. M.Malcova，H.Hradeca，R.Karpiskova和I.Rychlik，“生物膜的形成沙门氏菌血清鼠伤寒血清型：一种新菌落形态类型的鉴定和SGI1在生物膜形成中的作用，”兽医微生物学，第129卷，第3-4号，第360-3662008页。视图:出版商网站|谷歌学者
6. E. B. Solomon, B. A. Niemira, G. M. Sapers, and B. A. Annous，“生物膜的形成，纤维素的生产，和卷曲的生物合成沙门氏菌源自农产品、动物和临床来源，”食品保护杂志，第68卷，第5期，第906-9122005页。视图:谷歌学者
7. J.W.Austin、G.Sanders、W.W.Kay和S.K.Collinson，“薄聚集菌毛增强沙门氏菌肠炎生物膜的形成,”《微生物学字母，第162卷，第2期，第295-301页，1998年。视图:出版商网站|谷歌学者
8. P.Klemm和M.A.Schembri，“细菌粘附素：功能和结构，”国际医学微生物学杂志第290期1，页27-35,2000。视图:出版商网站|谷歌学者
9. C. Solano, B. García, J. Valle et al， "遗传分析肠炎沙门菌生物膜形成：纤维素的关键作用，”分子微生物学号，第43卷。3，页793-808,2002。视图:出版商网站|谷歌学者
10. R.Biswas，R.K.Agarwal，K.N.Bhilegaonkar等人，“生物膜相关蛋白（BapA）基因的克隆和测序及其在不同血清型的细菌中的发生。”沙门氏菌”,应用微生物学书信号，第52卷。2, pp. 138-143, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
11. 皮格检察官，欧尔检察官和米勒检察官，"沙门氏菌,包括沙门氏菌伤寒”,胃肠道感染，第669-697页，Lippincott Williams & Wilkins，费城，宾夕法尼亚州，美国，第二版，2002。视图:谷歌学者
12. H. Steenackers, K. Hermans, J. Vanderleyden, and S. C. J. De Keersmaecker， "沙门氏菌生物膜:发生、结构、调控和根除的概述国际食品研究第45卷第5期2，页502-531,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
13. 哈比马纳，斯廷凯斯特，m.p。Fontaine-Aupart M.-N。Bellon-Fontaine, S. Kulakauskas，和R. Briandet，“纳米颗粒在生物膜中的扩散被细菌细胞壁疏水性改变”，应用与环境微生物学第77期1, pp. 367-368, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
14. M. Thursfield， <疾病发生的方法>，刊于兽医流行病学，第53-55页，Wiley-Blackwell，霍博肯，新泽西州，美国，第三版，2007。视图:谷歌学者
15. C.Latasa，A.Roux，A.Toledo Arana等人，“BapA，一种细菌生物膜形成和宿主定殖所需的大型分泌蛋白沙门氏菌血清血清型肠炎，”分子微生物学，第58卷，第5期，第1322-1339页，2005年。视图:出版商网站|谷歌学者
16. M.Díez García，R.Capita和C.Alonso Calleja，“血清型对细菌生长动力学和形成生物膜能力的影响沙门氏菌从家禽隔离。”食品微生物学第31卷第1期2，页173-180,2012。视图:出版商网站|谷歌学者
17. C. Latasa, C. Solano, J. R. Penadés，和I. Lasa，“生物膜相关蛋白”，Comptes Rendus生物学第329卷第2期11，页849-857,2006。视图:出版商网站|谷歌学者
18. C.B.García-Calderón，J.Casadesús和F.Ramos Morales，“Rcs和PhoPQ在控制沙门氏菌血清毒力，”细菌学杂志，第189卷，第18号，第6635-6644页，2007年。视图:出版商网站|谷歌学者
19. C.拉塔萨，B.加西亚，M.埃切维兹等人，”沙门氏菌生物膜的形成依赖于RcsB的磷酸化状态。”细菌学杂志第194卷。14, pp. 3708-3722, 2012。视图:出版商网站|谷歌学者
20. A.Bridier、R.Briandet、V.Thomas和F.Dubois Brissonnet，“细菌生物膜对消毒剂的耐药性：综述，”生物淤积第27卷第2期9, pp. 1017-1032, 2011。视图:出版商网站|谷歌学者
21. A. P. White和M. G. Surette，“rdar形态型的比较遗传学”沙门氏菌”,细菌学杂志第188卷第1期24, pp. 8395-8406, 2006。视图:出版商网站|谷歌学者

版权

版权所有©2016 Gabriela Silva Hidalgo等人。这是一篇根据知识共享署名许可协议，允许在任何媒介上不受限制地使用、传播和复制，但必须正确引用原作。