昼夜节律和压力反应的粪便塞洛素犬

摘要

塞洛素犬是一种广泛分布的家养观赏鸣禽，其有限的生物学知识使得旨在监测应激的令人信服的研究成为可能。在这里，采用商业化酶免疫分析法来测量单细胞中的免疫反应性皮质酮（CORT）塞洛素犬监测单、群饲养禽鸟的皮质醇排泄量，检测鸟舍或小型运输笼饲养对皮质醇的促进作用。在短日照周期下，独立于饲养条件(单个或组)的动物的CORT日节律被记录下来，当单个饲养动物的空间可用性被改变时(在鸟舍和运输笼中转移)，CORT日节律持续存在。相比之下，当群居饲养的动物被限制在一个较小的笼子里时，记录了皮质酮排泄的显著变化。在光照期的开始，皮质激素排泄的日常节律表现出最大的反应，其次是在黑暗期结束时记录的峰值消失。这些数据表明，EIA可以作为一种可靠的无创监测方法来监测约束条件引起的应力塞洛素犬。

1.介绍

这塞洛素犬是一种原产于加那利群岛的小型家养鸣禽，通常被圈养用于观赏目的。尽管它的传播和越来越多的证据表明，压力与多种环境和社会条件以及人为干扰有关，但有关这种鸟的生理学的信息仍然很少l可用。压力在维持体内平衡、调节健康和繁殖结果方面起着重要作用。众所周知，CORT是克服压力状况的一线激素。在短期压力期间，它们通过能量动员改善健康状况[1那2]然而，严重或慢性应激可能通过免疫抑制和组织萎缩而降低个体的适应性[3.那4.]及繁殖能力下降[5.那6.]而且也有刻板印象的迹象[7.］．

在过去，CORT通常在血液中被量化[8.-14]然而，最近，非侵入性方法正在开发并应用于几种鸟类物种，因为它们提供了一些优势[15-25］．特别是，粪便类固醇激素检测现在被用于各种学科(如动物科学、行为生态学、保护生物学、鸟类学和灵长类动物学)，以检查各种类群的生殖和肾上腺皮质状态[12那16那21那22那26-39]。这些非侵入性方法可在不干扰动物的情况下轻松采集样本。样本可随时间定期采集，从而提供准确的压力评估，而不会因捕获导致CORT增加而产生偏差[22那31那40那41］．与血液皮质激素不同，粪便中的类固醇是累积的，因此提供了一种随时间循环的皮质激素[23那31那42那43］．

虽然许多物种的使用增加了非侵入性技术，但在使用之前必须考虑几种混淆因素：每日CORT排泄的特定特定形式44那45]和季节模式[11那46那47]，生殖状况[11那48]性别[21，身体状况[49那50]，以及光周期[51那52]此外，皮质醇等类固醇在肝脏代谢，并通过胆汁排泄到肠道[20.那22那24]，并以代谢物的形式存在于粪便中[51那52或天然激素。

粪便CORT分析已在几个物种中得到验证[16那22那53但只有很少的研究关注鹦鹉[54那55]或小（<200 g体重）鸟类[15那56］．在这种情况下，没有关于排泄的皮层的正常值的信息塞洛素犬尽管这种繁殖方式广泛传播，但现在仍然可以获得。

由于斑点猫头鹰的放射免疫分析法（RIA）的验证，扩大使用粪便CORT测量来检测鸟类健康状况的可能性受到限制[57]和在stonechats [58］．

为了检测微量粪便，可以采用商业EIA试剂盒，因为它们在成本、易用性和可用性方面具有优势。

粪便样本质量和粪便CORT浓度之间存在负相关关系[23那40]，因此建议只分析较大的粪便样本(>20 mg干质量)。这可能会妨碍对许多小型鸟类的个体样本进行分析，这些鸟类的粪便样本通常小于20毫克[16]。这个问题可以通过合并多个粪便样本或在更大的时间窗内收集来克服[31那40那59那60］．从这些前提出发，目前的研究是为了测试先前用于检测斑胸草雀CORT的商业EIA [61]，可用于检测个人水平的粪便CORT。

一旦实验被用于记录CORT塞洛素犬利用环境影响评价(EIA)记录了饲养在传统笼子中的成年雌性(1岁)在短光照时间内、在稳定的20°C环境温度和饲料自由。

首先，通过比较个体粪便皮质酮排泄量来评估社会效应与群繁殖鸟类。然后，通过将个体或群体饲养的鸟类转移到更小的(传统运输笼)或更大的笼(鸟舍)来确定空间可用性的影响。

2.材料和方法

所有的研究都得到了Teramo大学伦理委员会的批准，即使实验计划复制了传统的动物管理。

2．1.动物研究

成年人,女性孕育了塞洛素犬分别饲养于55 × 60 × 90 cm的笼舍或4只鸡(组)，检测24 h内粪便中皮质醇的基础水平。它们被随意喂食水和商业种子，并在短的白天光照周期(10小时光照/14小时黑暗周期)下饲养。动物维持在20°C的稳定温度下。

对于生物验证，10塞洛素犬根据先前验证的协议，将单独繁殖的鸟类随机分为两个实验组：Ctr和口服皮质酮激发的鸟类[58那62那63］．

对此目的塞洛素犬外源性皮质酮悬浮在花生油中(1.0 mg/mL)。皮质酮溶液0.1 mL，单次晨服，Ctr单独用油。上午7点给皮质酮后取样4次(时间0:给药前，3、6、9和24次表示给药后小时)。

试验是单独进行的()或分组(每只4只)持鸟;用手捕获，分别放置在较小的运输笼(15 × 60 × 30厘米)或鸟舍(120 × 100 × 100厘米)中，然后在第二天再次转移到对照笼中。

在试验期间，每隔3 h(从第1天上午10时至第二天上午10时)收集动物的粪便。为了便于收集鸟粪，笼子的底部内衬了塑化板。只去除羽毛/食物污染物的全部排泄样本立即保存在低温管中，经过鉴定，并在−20℃下保存。

然后这些鸟被转移到它们原来的繁殖环境中。

滴落物被冷冻储存在冰箱里−20°C，直到执行提取程序时的最后一次采集。

2.2.粪便的制备

在试验前，粪便在室温下解冻，置于玻璃管中，并进行湿称重。样品在90°C的强制通风烘箱中干燥1小时 h破坏细菌酶[24那25].对样品进行研磨、均质和称重。

糖皮质激素的提取是在每次实验中首先进行归一化，以样品中获得的最小重量为提取重量。这样,在每一个实验,类似数量的下降/样本提取75%甲醇和25%双蒸馏水正常化体积样品重量的基础上(马克斯2毫升)其次是有力的涡流5分钟,离心(2.300×g, 15分钟,4°C),和冷冻15分钟(−85°C)。

导致管底部的样品固化的离心和冷冻是需要在另一个草管（12×75mm）中的上清液甲醇滗析。然后将上清液在90℃下在空气流下蒸发。最后，我们将0.01M磷酸盐缓冲盐水加入0.1％明胶到每个管中并剧烈涡旋5分钟，然后进行测定。

2．3.免疫分析程序和验证

在本研究中，使用烯佐酶免疫测定试剂盒（Enzo寿命;猫N°ADI900-097）。第一步是从所实现的单个鸟类收集的Cort滴剂提取物的商业环境影响剧程的标准分析验证，包括对并行性评估，分析和绕组精度和测定敏感性。为此目的，使用从含有高水平皮质水滴的样品获得的皮质滴提取物。

在类固醇提取之前，样品初始添加约1 pg的氚化皮质酮，回收率为84.6%(最大变异系数16,3%)，根据[61]通过对鸟类血液样本采用相同的商业EIA。

对于平行度评估，EIA标准皮质酮的结合百分比曲线（%）)进行了分析与连续稀释高滴度提取物样品记录转换剂量1 : 2（稀释1），1 : 10（稀释2），1 : 100（稀释3）和1 : 200（稀释4）。

最后，通过给口服皮质酮刺激动物粪便中的皮质酮滴剂样本进行生物试验。

EIA分析是根据生产说明书进行的。抗体特异性不是内部确定的。但是，厂家宣称皮质酮EIA抗体交叉反应率为100%，去氧皮质酮为28%，四氢皮质酮为0.3%，醛酮为0.2%。

２.４.统计分析

每个分析样本(标准曲线点和实验点)进行三次重复分析，每个实验数据为至少5种不同鸟类或动物组的平均值。报告的激素值是基于每次检测中获得的三个重复值中至少最接近两个的平均值，除非这些值的变异大于10%。在这种情况下，剩余的样品在额外的分析中被重新分析。所有计算都考虑到数据不是正态分布(达戈斯蒂诺和皮尔逊综合检验)，采用非参数检验:曼-惠特尼检验两个样本的测试或更多样本的Kruskal-Wallis测试（过去3个）。数据表示为中位数±25°–75°。

3.结果

３．１．环境影响评价验证

通过评估标准曲线（%）获得分析的质量控制与CORT浓度和CORT浓度与光密度的关系)(见图1（a）)，其中拟合质量总是>0.99，而EIA实际测量CORT浓度的能力是通过平行度分析评估的(见图)1（b）).根据连续稀释的结果，粪便提取物通常稀释至1 : 10在分析之前。

EIA灵敏度为~20 pg/mL。试验内和试验间的变异系数分别为10.4%和16.9%，与生产指南声明的相似。在后续实验中考虑了采用间隔3小时采集的个体下降CORT的EIA协议的现实，因为它可以检测到~81.2%的采集样本，而不是47.4%的采集样本间隔1小时。

3.2.粪便排泄

不同鸟类的滴落量不同（从0.046 g至0.121 g/3 h） 白天（清晨）它们没有变化g / 3 h;下午 gr/3 H:数据未显示)在短昼光周期下饲养的单个动物中。

3.3.皮质醇的每日排泄量

通过重复测量分析的四个时间点(10.00、13.00、16.00和7.00)记录了个体或群体饲养鸟类的皮质醇排泄的每日节律(图)2)。在短日光照期间，在整个光照（活跃）期间记录到基础低水平的CORT，在光照后立即采集的滴落样本中显著增加。24小时内的CORT排泄模式和水平 单个和组内繁殖动物之间的h间隔没有差异（图2）．

3.4.口服皮质酮激发对每日CORT排泄的影响

对照组(5只)仅饲喂花生油的禽鸟的粪便皮质水平没有变化(CTR见图)3.）．不同的是，鸟类()， 0.1 mL花生油(1 mg/mL)中悬浮一剂量皮质酮，3和6小时后，皮质酮水平显著升高(和，分别为3.）．因此，皮质激素排泄的模式和水平与在CTR条件下记录的相似。

3．5．不同抑制条件对皮质激素排泄的影响

粪便中皮质醇浓度保持不变塞洛素犬单独繁殖或集体繁殖的动物被移入鸟舍。鸟类在一个更大的笼子里迁徙，从未改变过每天的模式和排泄的CORT水平（数据显示）。

相反，如图1所示，在较小笼子中转移鸟类后测得的CORT每日下降水平4.，都适应了初步繁殖条件。

这些水平以及每天的昼夜节律分泌的皮质醇在两组中保持不变塞洛素犬单独饲养，并搬进小型运输笼子(图4.）．不同的是，当塞洛素犬已在群体中初步繁殖。在本试验条件下，在13.00和16.00 (与单一的饲养动物)。此外，破晓后立即采集的样本通常记录了清晨的高峰(7.00:与单身繁殖的鸟类，图4.)未被发现。

鸟类再次在正常笼子中转移组（数据未显示的数据）后一天再次获得日常皮质节奏。

4.讨论

4．1.环境影响评价验证

目前的数据首次证明了商业双抗体EIA试剂盒用于检测排泄的CORT的有效性塞洛素犬，可能是最广泛的鸣禽驯养鸟类。

通过平行实验和检测口服皮质酮的鸟类粪便中皮质醇水平的增加，证实了EIA的特异性。不幸的是，体积小塞洛素犬不允许我们设计，同时，旨在药理学诱导CORT的循环变化的实验，正如Young和Hallford提出的[58］．

类似地，记录在单个和组饲养鸟日常节律已表示，间接地，另一种方法来验证使用该市售试剂盒的用于对从单个饲养滴收集的少量监测压力条件塞洛素犬。

在这种情况下，几个技术问题（无放射性、最低设备要求等）商业环境影响评估的生物学优势不可低估，尤其是在实际应用中。将压力检测转化为广泛物种的临床和繁殖实践，如塞洛素犬可以证明该分析方法的定性使用(例如，CORT值高于基础日水平)，从而低估了精确定量剂量施加的限制。

4．2．每天的节奏

EIA分析使我们第一次描述了CORT的日常节律塞洛素犬，对在短日光周期下饲养并在控制饲养条件下饲养的动物采集的单滴样本进行评估。

这塞洛素犬事实上，显示了24小时循环的CORT排泄。构成EIA分析有力验证的CORT数据的重复性不受所考虑的繁殖条件的影响（单个与组）。

在短日（10L/14D）下，整个光照期的基础水平保持较低（每3天一个样本） h从上午10:00到下午16:00）到开灯前（7:00）的峰值。考虑到粪便的延迟，可以推测塞洛素犬血浆中的CORT峰值出现在黑暗时间期间或结束时。

在光照前3小时的间隔时间内，即使鸟儿在这段不活动的时间内没有进食，皮质醇水平也会翻倍。这意味着，CORT率的增加不能归因于在关灯时不同的食物摄入量，而是归因于在其他鸟类类群中类似观察到的CORT的提前峰值[44那51那52那64-67］．活动前高峰可能是必要的，以准备一个适当的生理状态，以满足活力期开始时的能量需求。在哺乳动物中，CORT日节律被认为是调节整体新陈代谢的[9.那68和胰岛素一起调节能量的获取、沉积和调动[69那70］．类似的假设已被翻译到一些鸟类(如鸽子和鸡)，它们的皮质节律与哺乳动物相似[8.那10那71］．相反，很少有研究评估雀形目动物的皮质激素节律，如白喉麻雀，白颈条带菌[66甘贝尔的白冠麻雀(Zonotrichia leucophrys gambelii)[44)，即欧洲粪皮质(粪皮质)（虎耳草）[30.),麻雀（通过Domesticus）[45燕八哥),欧洲八哥[45]，大山雀，大山雀[51那52]，最近又出现在斑马雀身上[72］．

基于粪便皮质昼夜节律，可能会提出两个有趣的假设。首先，由于在两种不同的饲养条件下，在活动期之前，CORT在下降样本中达到了相似的每日水平，这一发现似乎表明了一个潜在的生物学相关性，即在活动期前的峰值驱动行为和生理过程。第二，像其他雀形目物种一样，排出的皮质醇水平塞洛素犬在活动期间非常低，由于在一天的第一小时后立即发生皮屑代谢物的急剧下降。这种特殊性提出了禽流的规定机制。这个假设是从Breuner等人提出的。[44研究结果显示，在甘贝尔氏白鸦(与哺乳动物不同)活动的大部分日子里，其皮质激素血浆水平迅速下降。44]). 这不能归因于高质量特定代谢率，因为在较小的哺乳动物中，如小鼠或大鼠，血液CORT基础水平比麻雀高5-10倍[69那73那74］．此外，禽的低活性CORT血液水平不能归因于更大的肠道清除率，因为正如本文所记载的，至少在粪便中也同样记录了低而稳定的CORT水平塞洛素犬.即使需要进一步的实验来研究CORT分泌和清除的变化，以确定这种快速下降的原因，也可以假设雀形目鸟类的特异性。

4.3.对改进约束条件的响应

关于应激水平和节律之间的关系，似乎在大多数鸟类中，CORT对应激源的反应强度取决于刺激出现的时间。至少在冬季的光周期中，压力反应有一个每日的节律，大致模拟了基本波动的模式[44那45那51那52].这在一定程度上已在报告中得到证实塞洛素犬。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）axis似乎在光线照射后对特定的应激源敏感，但在持续的应激源条件下，每天的基础节律稍有受损。此外，将刺激视为应激源的感觉似乎受到初步繁殖条件的严格限制。事实上，而单繁殖动物并没有改变CORT基础节律水平，当它们被转移到不同大小的笼子（鸟笼和运输笼）中时。相比之下，转移到运输笼中应用于集体饲养的鸟类能够在清晨几个小时内增加CORT分泌。

对类固醇分泌中这种不同行为的解释不能简单地仅仅基于粪便皮质激素的剂量。首先，由于有证据表明皮质激素的分泌在应激事件的记忆巩固中起着关键作用，当事件在未来再次发生时，被试可以更有效地做出反应[75那76］．如果是这样的话，在单个繁殖的动物中观察到的对运输约束的较低敏感性可以解释为，与经历了更大的应激条件的群体繁殖的动物相比，它们有更多的实践来忍受应激条件(例如鸟类中的等级制度)。基于这一假设，有可能解释，例如，孟加拉雀(Lonchura striata变种。家蝇)，一种白背文鸟（Lonchura striata）的驯化品系。驯化的鸣禽由于环境压力的降低（与野生相关物种相比）以及在野外生存所必需的CORT作用的降低而降低了CORT水平。

此外，可以考虑调节皮上片性器的另一种机制。事实上，最近被证实在小鼠中应力对自由CORT的影响是应激具体，既有的幅度和响应的时间，他们被循环皮质类固醇结合球蛋白（CBG）介导的尊重。CBG似乎仅在高水平的高水平下从肝脏释放，响应于中度至强强度的压力。因此，在应力循环之后CBG水平的增加抑制在自由CORT浓度的上升在循环安装总激素水平的面。这种高度动态的机制涉及糖皮质激素的调节，使急性胁迫后的皮质粪便分泌水平的解释使得解释。

然而，即使很难解释这些不同的皮质激素反应所涉及的机制，分组饲养和运输约束条件的结合能够引起皮质激素在基础水平上的显著增加，然而，决定了日常节律的暂时降低。第二天，确实，早晨活跃前的皮质酮峰值被明显抑制。有趣的是，空间的改变本身并不是一种足以引起压力的条件塞洛素犬因为在较大的笼子中进行的限制不会改变CORT的分泌。但是，当将其应用于群育鸟类时，空间的限制可能会决定CORT的反应。

粪便CORT水平的快速降低可以提供保护性反应，能够限制慢性升高对大脑的长期不良影响，如海马萎缩、喂养率增加和免疫功能[4.］．

相反，长期低浓度的全身皮质激素水平的有害影响还没有在鸟类中进行研究，即使糖皮质激素反应的衰竭可能是动物稳态的一个非常关键的情况，然而，应该发生在病理条件下(内分泌综合征)或更长时间的应激源暴露后。

5.结论

商业EIA对圈养广泛分布的鸟类（如鸟类）压力的无创监测的可用性塞洛素犬具有很大的临床和育种管理影响。鉴定24小时内的内源性皮质激素变异对解释应激源效应和接近未来重点实验至关重要。对循环皮质醇基线日波动的描述，确实可以让研究人员通过计划在一天中适当的时间进行实验，消除这种变化的来源。

此外，实验结果表明，驯化塞洛素犬单独繁殖不经历应激源改良的约束条件(鸟舍或运输笼转移)。相反，必须更加注意管理塞洛素犬为了防止因笼间空间减少而引起的应激反应，采用群体饲养。

相互竞争的利益

作者声明他们没有相互竞争的利益。

致谢

作者感谢Francesca Pettinella的技术支持。这项研究得到了Società ornitidae Reggiana (SOR)的资助。

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