供应商管理库存 兽医国际 2042 - 0048 2090 - 8113 Hindawi出版公司 10.1155 / 2016/3086353 3086353 研究文章 昼夜节律和粪便的应激反应 Serinus加 Turriani 莫拉 1 http://orcid.org/0000 - 0001 - 5140 - 9656 Bernabo 尼古拉 1 http://orcid.org/0000 - 0003 - 0231 - 8066 Barboni 芭芭拉 1 Todisco 蒋禄卡 2 蒙提 路易吉 3 Berardinelli 保罗 1 Mancianti 弗朗西斯卡 1 单位的基础研究和应用生物科学 兽医学院 Teramo大学 通过雷纳托Balzarini 1 64100年Teramo 意大利 unite.it 2 通过每Mosciano 96号 Giulianova 64021年Teramo 意大利 3 通过Villafranca 11 72100年布林迪西 意大利 2016年 25 12 2016年 2016年 03 10 2016年 09年 11 2016年 2016年 版权©2016年莫拉Turriani et al。 这是一个开放的文章在知识共享归属许可下发布的,它允许无限制的使用,分布和繁殖在任何媒介,提供最初的工作是正确的引用。

Serinus加普遍国内装饰songbird,知识有限的生物学做出令人信服的研究旨在监控压力。在这里,一个商业采用酶免疫分析法测量免疫反应性的皮质酮(CORT)单身 Serinus加滴样本,来监控每日大便排泄CORT的鸟类繁殖单独或群体,检测效果提升鸟类饲养场或小运输笼克制。CORT被记录在一个健壮的日常节奏动物在白天短光周期,独立的饲养条件(单个或一组),坚持当空间可用性在单修改饲养动物(鸟类饲养场和运输笼转移)。相比之下,显著改变CORT排泄时记录组饲养动物被限制在一个小笼子里。CORT排泄的日常节奏应对操作显示光的最大响应初期,其次是缺乏高峰通常记录在黑暗的结束阶段。这些数据表明,环境影响评价可以作为一个可靠的无创性方法监测的应力约束条件引起的 Serinus加。

 公司Ornitologica Reggiana 1。介绍

的 Serinus加是一个小型国内songbird加群岛人通常保存在被用于装饰目的。尽管它的传播,越来越多的证据表明压力是有关的几个环境和社会条件和人为干扰,稀缺的生理学信息鸟仍然可用。压力起着重要的作用在维护身体体内平衡,调节健康和繁殖的结果。众所周知,CORT前线荷尔蒙来克服压力。在短期压力,他们通过能源动员提高健身 1, 2)和调节行为和抑制代谢过程不必要的生存。然而,严重或慢性压力可能会降低个体适应性免疫抑制和萎缩的组织( 3, 4和繁殖性能的降低 5, 6),也有思维定势的迹象( 7]。

在过去,CORT通常量化在血液 8- - - - - - 14],最近,非侵入性方法被开发和应用于几种鸟类物种,因为它们提供了一些优势( 15- - - - - - 25]。特别是,粪便类固醇激素化验现在被用于各种学科(例如,动物科学、行为生态学、保护生物学、鸟类学、和灵长类动物学)检查各种类群的生殖和肾上腺皮质状态( 12, 16, 21, 22, 26- - - - - - 39]。这些非侵入性方法允许容易收集的样本而不打扰动物。定期收集的样本可以通过时间,从而提供一个准确的评估压力没有capture-induced增加CORT的偏见 22, 31日, 40, 41]。不同于血液CORT、类固醇在粪便累积CORT随着时间的推移,从而提供一个衡量循环( 23, 31日, 42, 43]。

尽管使用非侵入性技术增加了许多物种,在使用前必须考虑几个混杂因素:CORT排泄的specie-specific形态,《每日 44, 45)和季节性模式( 11, 46, 47),生殖状态( 11, 48),性( 21),身体条件( 49, 50),光周期( 51, 52]。此外,类固醇CORT等在肝脏代谢,通过胆汁排泄到肠( 20., 22, 24)和存在于粪便为代谢物( 51, 52]或本地荷尔蒙。

在几个物种(CORT化验大便已经验证 16, 22, 53但只有较少的研究集中在鹦鹉[ 54, 55)或小(< 200克体重)鸟类 15, 56]。在这种情况下,任何信息关于CORT在分泌的正常价值 Serinus加现在是可用的,尽管这个繁殖的广泛扩散。

可能扩大使用粪便CORT测量检测鸟的幸福是有限的验证等(RIA),在斑点猫头鹰 57)和野鹟( 58]。

商业EIA试剂盒检测微量的粪便可以采用,由于他们的优势在成本方面,易用性和可用性。

粪便样本之间的负面关系质量和粪便CORT浓度被发现之前( 23, 40),导致的建议只分析大粪便样本(> 20毫克干质量)。这可能潜在地排除个别样本的分析很多较小的鸟类物种,通常产生一个粪便样本小于20毫克( 16]。这个问题可以通过组合多个克服粪便样本或收集他们在一个更大的窗户 31日, 40, 59, 60]。从这些前提,当前的研究被设计为了测试如果商业环境影响评价,以前用于测定CORT斑马雀( 61年),可以用来检测粪便CORT在个体水平。

一旦分析适应CORT的记录 Serinus加粪便和测试分析表演(并行性、内部和interassay变异和敏感性)和生物现实(口服皮质甾酮的挑战),环评是用来记录CORT的基底每日分泌成年女性(1岁)培育成传统的笼子,一个近视期间,在稳定20°C的环境温度和随意。

首先,社会影响评价在单独通过比较CORT排泄粪便 与群繁殖鸟类。然后,空间可用性决定了传输的影响鸟类繁殖单独或成更小的组(常规运输笼)或啤酒笼子(鸟)。

 2。材料和方法

所有研究是大学的伦理委员会批准Teramo即使实验再现了传统动物管理计划。

2.1。动物研究

成年人,女性孕育了 Serinus加在控制条件下被安置在笼子里单独55×60×90厘米或组(4鸟类)检测基底的CORT 24小时期间收集的分泌水平。他们给了水和商业种子饮食随意,安置在短一天光周期(10小时的光/暗周期14日)。动物们保持在稳定的温度20°C。

生物验证,10 Serinus加培育单独被随机分成两组:Ctr和口服皮质甾酮挑战鸟类根据之前验证协议( 58, 62年, 63年]。

为达此目的 Serinus加喂养与外源性皮质甾酮悬浮在花生油(1.0毫克/毫升)。皮质甾酮的解决方案是口服药物在一个早晨剂量0.1毫升,Ctr的饲料油。下降后被四次采样皮质甾酮政府执行7.00点(0:政府和前乘以3,6,9日和24小时后政府表示)。

试验中进行了单( n = 5 )或组( n = 5 每4鸟类)举行鸟类;他们被手放置单独或组,分别为更小的运输笼(15×60×30厘米)或鸟类饲养场(120×100×100厘米),然后又转移到控制笼子后的第二天。

实验期间所有由动物粪便排出收集每隔3 h(从10.00点的第一天第二天的凌晨10.00点)。为了方便滴收集,笼子的底部是内衬板塑型。整个排出样品只剥夺的羽毛/食品污染物立即存入cryotubes,标识,储存在−20°C。

然后鸟儿被转移到原来的繁殖条件。

删除存储冻结在−20°C到最后收集提取程序执行时。

 2.2。粪便的准备

在试验之前,粪便在室温下解冻,放在玻璃管和湿重。样本在90°C的压力炉干1 h摧毁细菌酶( 24, 25]。样本地面、均质和衡量。

糖皮质激素提取首先规范在每个实验的重量下降提取样品中获得的最低重量。这样,在每一个实验,类似数量的下降/样本提取75%甲醇和25%双蒸馏水正常化体积样品重量的基础上(马克斯2毫升)其次是有力的涡流5分钟,离心(2.300×g, 15分钟,4°C),和冷冻15分钟(−85°C)。

离心和冻结的凝固,导致样品管的底部需要轻轻倒出上层的甲醇在另一个草管(12×75毫米)。当时上层清液蒸发在空气流在90°C。最后,我们添加了0.01米磷酸缓冲盐0.1%明胶每管和涡积极为5分钟,然后进行分析。

 2.3。免疫测定程序和验证

在目前的研究中,恩佐酶免疫分析法工具包(恩佐生命科学;使用猫n°adi900 - 097)。第一步是一个标准的商业环境影响评价的分析验证CORT滴提取来自个人鸟意识到包括评估的并行度,intra-assay interassay精度和检测灵敏度。CORT下降这一目标,从样本中提取获得含有高浓度CORT的使用。

样品最初上升大约1 pg的氚化肾上腺酮类固醇提取和~ 84之前,获得了6%的复苏(3%)最大变异系数16日根据[结果描述 61年)采用相同的商业环境影响评价鸟类的血液样本。

并行性评估、曲线的百分比绑定环评标准皮质甾酮(% B / B 0 分析了) 与连续稀释高滴提取样本对数转换剂1:2(稀释1),1:10(稀释2),1:100稀释(3),和1:200稀释(4)。

最后,一个生物测试是由计量CORT滴样本收集的粪便口服皮质甾酮挑战的动物。

根据生产指令执行的环境影响评价分析。抗体特异性内部并不确定。然而,制造商声明皮质甾酮EIA抗体交叉反应,100% 28% desoxycorticosterone,醛固酮tetrahydrocorticosterone为0.3%,0.2%。

 2.4。统计分析

每个分析样本(标准曲线点和实验分)一式三份,每个实验数据分析的意思是至少五个不同的鸟类或动物群体的利益。报道激素值是根据平均至少最亲密的两个一式三份的值获得在每个试验中,除了这些变化大于10%的情况。在这种情况下,剩余样品在一个额外的再分析分析。执行所有的计算都考虑到数据不是正态分布(达和皮尔森综合测试),不通过参量的测试:Mann-Whitney U 测试两个样品或克鲁斯卡尔-沃利斯测试样品(过去3)。数据被表示为中值25°±-75°百分位。

 3所示。结果 3.1。环境影响评价验证

测定的质量控制是通过评估标准曲线(% B / B 0 与CORT含量和CORT含量与光密度(见图) 1(一))的质量符合总是> 0.99,而环境影响评价的能力实际上CORT浓度测量是评估并行性分析(见图 1 (b))。基于连续稀释的结果,粪便提取物通常被稀释至1:试验前10。

(一)标准曲线。(b)图显示在不同的稀释曲线斜率(稀释1 = 1:2,稀释2 = 1:10,稀释3 = 1/100,和稀释4 = 1/200)。 X 设在在对数刻度。

EIA敏感性~ 20 pg / mL。intra-assay和interassay变异系数分别为10.4%和16.9%,分别类似宣布制造指南。环评的现实应用协议期间收集的个人放弃CORT的间隔时间3小时考虑以下实验,因为它允许检测收集样本的~ 81.2%而不是47.4%的样品收集在1小时的时间间隔。

 3.2。粪便排泄

在鸟类数量的下降变化(从0.046克到0.121 g / 3 h),他们在天(早上并没有改变 0.064 ± 0.021 g / 3 h;下午 0.096 ± 0.049 gr / 3 h, p > 0.05 :数据未显示)在单一动物饲养在光周期短的一天。

 3.3。每日排泄CORT

四个时间点(10.00,13.00,16.00,7.00)分析通过重复措施记录每天的节奏在CORT排泄,无论是个人或群体繁殖鸟(图 2)。在光周期短一天,基底CORT记录通过低水平的光(积极)期显著增加后立即删除样本收集光了。模式和CORT排泄在24小时间隔的水平没有差异单身,在饲养动物(图组 2)。

图显示的日常节奏CORT排泄在单(蓝色)或分组(红色)繁殖鸟类。抽样进行了在不同的时间,报道 x 设在。统计分析,参考的结果部分的手稿。

 3.4。口服皮质甾酮挑战对日常CORT排泄的影响

鸟类粪便CORT的形象没有改变的控制(5)动物饲料与花生油(CTR图 3)。不同,鸟类( n = 5 )饲料清晨一剂肾上腺酮悬浮在0.1毫升的花生油(1毫克/毫升)显示CORT水平明显高于3和6小时后( p < 0.01 和 p < 0.05 分别图 3)。CORT排泄,然后获得一个模式和水平类似CTR条件下记录。

图显示CORT排泄的日常节奏控制动物(CTR)或鸟类饲料与一个剂量的肾上腺酮悬浮在0.1毫升的花生油(1毫克/毫升)(饲料)。3 h、6 h、9 h和24小时被称为CORT数小时后管理。统计分析,参考的结果部分的手稿。

 3.5。不同约束条件对CORT排泄的影响

CORT浓度保持不变,当粪便 Serinus加培育个人或组进入鸟类饲养场。鸟类转移在一个大笼子里从未修改日常模式和分泌的水平CORT(数据如图所示)。

相反,每日滴CORT水平测量在小笼子里,鸟转移后,总结了图 4条件初步培育条件。

图显示的日常节奏CORT排泄后测量鸟转移单(蓝色)在小笼子里或分组动物(红色)。抽样进行了在不同的时间,报道 x 设在。统计分析,参考的结果部分的手稿。

水平的每日生理排泄CORT保持不变 Serinus加单独饲养,搬到小运输笼(图 4)。不同,当CORT排泄的模式修改 Serinus加在集团培育初步。在本实验条件下,较高的CORT水平下降记录在13.00和16.00 ( p < 0.01 与单一的饲养动物)。此外,清晨高峰通常记录在样品收集光后立即出现在(7.00: p < 0.01 与单一繁殖鸟类,图 4)没有被观察到。

鸟儿又获得每日CORT节奏后第二天他们转移组在正常的笼子里(数据没有显示)。

 4所示。讨论 4.1。环境影响评价验证

目前的数据表明,第一次,一个商业的有效性双抗体环评工具检测CORT的排泄 Serinus加,可能最广泛songbird驯养的鸟类物种。

EIA的特异性是证实通过平行实验和检测增加鸟类粪便CORT水平与皮质甾酮口服治疗。不幸的是,小尺寸的 Serinus加不允许我们设计、并行实验旨在药物引入CORT的循环变化,作为提出的年轻和Hallford 58]。

类似地,每日节律中记录单和组繁殖鸟代表,间接地进一步验证这个商业工具的使用方法监测压力条件对少量的下降从单一的培育 Serinus加。

在这种背景下,一些技术(没有放射性,最小的设备要求,等)和生物的优势商业环境影响评价分析时不可低估可以采用,尤其是在实际的目标。翻译的高影响压力检测的临床和育种实践广泛的物种 Serinus加可以证明一个定性的分析(例如,CORT值在基底日常水平)因此低估限制由一个精确的定量剂量。

 4.2。每天的节奏

环境影响评价分析使我们能够描述,首次CORT的日常节奏 Serinus加,评估单滴样本收集的动物饲养在短一天光周期控制饲养条件下和维护。

的 Serinus加显示,实际上,24小时循环CORT排泄。CORT数据的重复构成本身作为一个强烈的环境影响评价验证试验被认为是不受饲养条件(单 与组)。

下短天(10 l / 14 d),基础水平仍低整个光时期(一个示例3 h从10.00点到16.00)在灯光来之前达到峰值(7.00)。考虑到延迟的粪便,可能还在 Serinus加CORT高峰时等离子体发生期间或结束时黑暗的小时。

3h间隔期间CORT水平双光之前,即使鸟儿不吃这个不活跃的时期。这需要CORT的增加率不能归咎于微分灯是在食物摄取但preactive CORT的峰值,同样观察到在其他鸟类类群( 44, 51, 52, 64年- - - - - - 67年]。preactive峰值可能需要准备一个适当的生理状态满足能量需求活跃时期就开始了。在哺乳动物CORT的日常节奏被认为调节整体代谢( 9, 68年一起),胰岛素,调节能源收购、沉积和动员 69年, 70年]。类似的假设已被翻译一些鸟类(如鸽子和鸡),显示CORT节奏与哺乳动物相似( 8, 10, 71年]。研究相对较少,相反,评估CORT节奏white-throated等雀形目的麻雀, Zonotrichia albicollis( 66年),Gambel白冠的麻雀 (Zonotrichia leucophrys gambelii)( 44),欧洲野鹟(CORT)粪便 (Saxicola torquata rubicola)( 30.),麻雀 (家)( 45燕八哥), Sturnus寻常的( 45)、大山雀、 大山雀( 51, 52最近在斑马雀[], 72年]。

粪便CORT昼夜节律的基础上两个有趣的推测可能提出。首先,因为两种不同饲养条件下CORT达成类似的日常水平下降样本活跃时期,这个发现似乎在暗示一个潜在的生物相关性的峰值preactive期间驾驶行为和生理过程。第二,与其他雀形目的物种一样,排出CORT水平 Serinus加非常低在活动期间,由于CORT代谢物发生急剧下降后的第一个小时。这种特点表明avian-specific监管机制。这个假设是首先从”布鲁纳等。 44]记录CORT等离子体水平迅速下降过程中最活跃的一天在Gambel white-crowed麻雀(不同于哺乳动物 44])。这不能归结于高质量的特定代谢率也因为在较小的哺乳动物,如小鼠或大鼠,血液CORT基底水平在麻雀[5 - 10倍 69年, 73年, 74年]。此外,低活性CORT鸟类的血液水平不能由于肠间隙更大,因为作为摘要记录,CORT水平低和稳定的粪便也至少在记录 Serinus加。即使进一步的实验调查CORT分泌的变化和许可要求建立快速下降的原因,可以假设雀形目的特异性。

 4.3。对修改后的约束条件

至于应激水平之间的关系和节奏,似乎,在大多数的鸟类物种,CORT应对压力的强度依赖于刺激的一天。应激反应的日常节奏,近似模拟基底波动的模式,至少在冬天光周期( 44, 45, 51, 52]。一定程度上,这是确认的 Serinus加。-肾上腺轴(HPA)对特定的压力似乎敏感光出现在刚过,但《每日持续压力条件下基底节奏略受损。此外,刺激的知觉压力似乎严格条件的初步培育条件。的确,而单一的饲养动物没有修改CORT基底的水平,当它们转移在笼子里不同的大小(鸟类饲养场和运输笼)。相比之下,转移在运输笼组应用于鸟类繁殖成为CORT分泌能够增加几个小时在清晨。

这种不同行为的解释在类固醇激素分泌不容易解释完全基于粪便CORT剂量。首先,因为一些证据表明CORT分泌的整合中扮演着重要角色压力事件的记忆,这个主题可以更有效地回应当事件再次发生在未来 75年, 76年]。如果是这种情况,低灵敏度运输克制,在单一的饲养动物可以被解释为他们更多的练习能忍受压力条件相比,集团培育那些可能经历了更大的压力生活条件(例如层次内鸟类)。基于这一假设,就可以解释,例如,不同级别的CORT记录在孟加拉的雀( Lonchura striatavar。 有明显白背munia)驯化菌株(Lonchura striata)。驯化鸣禽CORT水平降低,因为减少环境压力水平(相对于野生相关物种)和减少CORT的角色,这是必要的生存在野外。

此外,另一个CORT个人可以被认为是调节机制。事实上,它最近被证实在小鼠的影响强调自由CORT压力具体关于大小和响应的时间,他们是由循环类固醇结合球蛋白(cbre)。cbre似乎从肝脏释放在高水平只有在中等强度强劲的压力。因此,增加循环后cbre水平应力约束自由CORT含量上升,面对越来越多的总循环激素水平。这种高度动态的机制参与了糖皮质激素激素生理调节复杂的解释CORT粪便急性应激后分泌水平。

然而,即使是很难解释的机制参与CORT反应,这些不同的组合集团培育和运输限制条件能够唤起在基底CORT水平显著增加,然而,决定暂时减少的日常节奏。后的第二天,事实上,早上preactive CORT峰值显著抑制。有趣,不修改的空间本身条件足以唤起的压力 Serinus加由于克制在较大的笼子里,没有修改CORT分泌。专门的限制空间可能决定CORT响应时,然而,它是用于繁殖鸟类。

CORT水平的迅速减少粪便可以提供保护性反应,能够限制长期慢性海拔对大脑的负面影响,如海马萎缩、摄食率增加,和免疫功能 4]。

相反,长期低浓度的有害影响的系统性CORT水平尚未研究鸟类物种即使疲惫的糖皮质激素响应可能代表一个非常关键的情况下对动物体内平衡,然而,应该发生在病理条件下(内分泌综合征)或经过长时间接触压力。

 5。结论

商业环评的可用性的无创监测压力被广泛的鸟类 Serinus加有一个大型临床和饲养管理的影响。内源性CORT变化的识别在24小时是必不可少的解释和接近未来集中实验压力影响。基线的描述循环CORT波动在一昼夜的基础上,允许研究人员删除,变异来源计划实验在适当的时间。

实验结果表明,此外,驯化 Serinus加不经历压力修改单独饲养约束条件(鸟类饲养场或运输笼转移)。相反,更高的注意力必须解决的管理 Serinus加饲养组为了防止应激反应取决于笼子空间的减少。

 相互竞争的利益

作者宣称没有利益冲突。

 确认

作者感谢弗朗西斯卡Pettinella她技术支持。这项研究是由公司支持Ornitologica Reggiana (SOR)。

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