贮藏温度和时间对牛血清淀粉样蛋白A及其乳腺相关亚型浓度的影响

摘要

本研究的目的是评估在不同条件下储存对牛急性期蛋白-血清淀粉样蛋白A及其乳腺亚型浓度的影响。我们从7头临床健康的小牛身上采集血液样本，从6头临床健康的奶牛身上采集牛奶样本。收集的血清和牛奶样本被分成等份。其中一个分录是在收集当天分析的，没有存储。第二份等分在4°C下保存1天，其余等分在−18°C下冷冻2、7、14、21天，然后进行分析。血清检测血清淀粉样蛋白A (SAA)。测定乳样中乳腺SAA亚型(M-SAA)的浓度。随着时间的推移，血清SAA浓度在−18°C保存期间呈现显著下降趋势(）.同样，M-SAA值在冷冻温度(）.在冷冻样品中，我们发现SAA和M-SAA值都没有显著降低。结果表明，贮藏温度和时间对牛SAA和M-SAA的浓度有显著影响。

1.介绍

生化研究在临床化学中具有重要的作用，为临床医生在疾病的诊断、预后、监测和筛查中提供主要的生化信息。人们普遍认为，大多数医疗决定是根据实验室数据作出的[1]．只有当这些信息是准确和相关的，且其重要性得到临床医生的认可，以便能够适当地用于指导临床决策时，这些信息才有价值[2]．需要分析的标本必须按照规定的程序采集和运送到实验室，如果要使数据具有临床价值，需要仔细注意样品处理和分析过程中的每一个步骤[3.]．在某些情况下，分析被推迟，或者标本被送到遥远的实验室进行分析。而且，多个实验时间点的规划往往会导致样品在较晚的时间将一起进行分析，从而在分析前受到不同的贮藏期[4].在这种情况下，必须通过冷冻或冷冻样品来防止不稳定分析物的降解。许多作者指出，不仅生理条件和因素（如年龄、性别、怀孕和营养状况）而且生物样品储存不足，作为分析前误差的潜在来源，可能显著影响许多生化变量的浓度[5- - - - - -7]然而，样本储存对不太频繁测量的生化变量（包括急性期蛋白质）浓度的影响，以及它们在兽医储存期间的稳定性，没有很好的记录。

急性期蛋白是一组血液蛋白，在受到外部或内部刺激（如组织损伤、炎症、体内平衡受损、创伤或压力）的动物体内浓度发生变化[8]在牛中，血清淀粉样蛋白A（SAA）是诊断上最重要的急性期蛋白之一，由于炎症反应，血清浓度增加了1000倍[9]．血清淀粉样蛋白A是一种小的疏水蛋白，是淀粉样蛋白A的前体，是主要的蛋白α-淀粉样蛋白，因此它可能参与反应性淀粉样变性的发病机制[10]发现了几种SAA的同型。其中，同型SAA1和SAA2对炎症刺激有反应，肝脏中的产生显著增加[11]．SAA3亚型在急性期反应期间在非肝组织中表达，在肺或乳腺中发现增加[12]．乳腺相关SAA亚型(M-SAA)的作用与乳腺炎奶牛新生儿对子宫外生活的适应和乳腺组织重塑有关[13]．在人类医学中，急性期蛋白几十年来一直被用作疾病的生物标志物[14]．然而，尽管急性期蛋白浓度的测量可以检测或确认感染或病理损伤的存在，并为监测动物的健康状况提供有用的信息，但急性期蛋白在兽医学中尚未得到充分利用。血清淀粉样蛋白A的使用由于纯化和定量困难而受到限制，可能是因为它是一种疏水载脂蛋白，与血清高密度脂蛋白复合[15]．在牛的实践中，最近越来越重视急性期蛋白的应用，包括血清淀粉样蛋白A。稳定性和贮藏研究是急性期蛋白测定方法引入过程中需要进行的重要研究之一。

因此，本研究旨在评价不同条件下的贮藏对犊牛血清样品中牛急性期蛋白-血清淀粉样蛋白A (SAA)浓度的影响。此外，我们还研究了奶牛牛奶样品中SAA乳腺亚型的稳定性。

2.材料和方法

2．1．样品收集

从一个传统奶牛场采集的7头临床健康母牛的血液样本中，研究了冷藏和冷藏温度对血清淀粉样蛋白A浓度的影响。这些小牛是斯洛伐克斑点品种及其杂交后代，年龄为4-6个月，体重为85–140 kg。被评估的动物被松散地分为较大的一组，喂食干草和谷物，并自由饮水。通过直接穿刺血液采集血液样本进行分析诉jugularis进入血清凝胶分离管，无需抗凝剂。血液标本在室温下凝固，3000 g离心30分钟分离血清。收获的血清被分成等份。一种是分析血清淀粉样蛋白A (SAA，μg/mL)，以0时的结果作为初始浓度。第二次分离的血清在4°C冰箱中保存1天，然后进行分析。其余等份在−18℃冷冻，并在储存2、7、14和21天后测定SAA的浓度。

为了评估SAA乳腺亚型(M-SAA, ng/mL)在储存过程中的浓度变化，本研究纳入了来自传统奶牛场的6头临床健康奶牛的牛奶样品。研究对象为斯洛伐克斑点牛及其3 ~ 5岁的杂交牛。评价后的奶牛根据产奶量每天喂饲2次随意接触到水。用手剥离法将复合乳样品收集到塑料管中。先把前带挤干，然后从每个季度取大约等份的牛奶混合在一起。收集的牛奶样本被分成等份。其中一个分配线分析M-SAA的浓度在样品采集当天不储存。第二次分取的牛奶样品在4°C冰箱中保存1天，然后进行分析。剩余的等量品在−18°C下储存，并在储存2、7、14和21天后分析M-SAA浓度。

2．2.实验室分析

血清SAA浓度采用夹心酶联免疫吸附法分析，使用商业ELISA试剂盒(Tridelta Development, Ireland)，按照制造商描述的程序进行。所有样品，包括标准样品，一式两份。在Opsys MR (Dynex Technologies, USA)上以630 nm作为参考，在450 nm处读取光密度。

M-SAA的浓度由ELISA法测定，使用商业诊断试剂盒(Tridelta Development, Ireland)，根据SAA所描述的方法，制造商修改了用于测定牛奶样品中M-SAA的方法。

2.3.统计分析

算术方式(x)、标准偏差(SD)和血清和牛奶样品中SAA浓度的中位数，使用描述性统计程序进行计算。在−18°C冷冻样品的存储过程中，通过重复测量方差分析(repeat measures ANOVA test)和Tukey-Kramer多重比较检验来评估时间对评价变量浓度的影响，以确定哪些平均值彼此之间存在显著差异。的配对-test用于评估测量参数的初始浓度与在4°C下保存1天的样品中定量值之间的差异。所有统计分析均使用GraphPad Prism V5.02程序(GraphPad Software Inc.， California, USA)进行。

3.结果

牛血清中SAA浓度的数据和储存期间牛奶样品中M-SAA的值用平均值、标准差和中值(包括平均值浓度差异的显著性)表示，见表1和2．

对SAA平均血清浓度随时间变化的评估显示，在−18°C储存期间，值有显著下降的趋势(桌子1）.从第2天开始，存放在冰箱中的样品浓度显著降低()，与初始值相比，贮藏第14天和第21天的浓度显著最低(）.更详细的血清SAA浓度分析显示，50%的未储存(第0天)样品的结果在11.70 - 42.10之间μg/mL，中位浓度为30.50μ克/毫升(图1）.储存第2天记录的SAA浓度中位数约低一半(15.60μg/mL)， 50%的实测值在6.89 ~ 29.70范围内μ克/毫升。SAA的中位浓度在贮藏第14天最低(12.00μg / mL)。

牛奶样品中M-SAA的平均浓度随−18℃储存时间的变化非常显著(桌子1)。对于在冰箱储存第2天测定的牛奶样品中的M-SAA浓度，发现其值显著降低(桌子1)，与初始值相比，储存第7天后浓度进一步显著降低()，则该值在冷藏评价期内保持相对稳定。M-SAA的中位浓度在冷冻期间逐渐下降，最低中位浓度是在冷冻21天(4483.20 ng/mL，图)2）.通过更详细的评估单个M-SAA浓度初步分析中我们发现,牛奶样品50%的测量值范围从3936到7326 ng / mL,和样品分析的第2天存储我们已经记录的低浓度50%的测量值的范围在3371和6091 ng / mL。

在4°C下保存1天的牛血清中获得的SAA的平均浓度没有显著低于立即分析的样品的评估记录值(表)2）.同样，在分析冷藏后牛奶样品中M-SAA的浓度时，未冷藏的样品与4℃冷藏1天的牛奶中M-SAA的浓度没有显著差异。

4.讨论

许多临床试验和研究依赖于采集的血液样本的延迟批次分析。为了完成这些分析，血液样本要通过离心分离，收集的血清或血浆要迅速冷冻[16].在特定的随访时间，按照研究方案的规定解冻和分析样本。一些常规临床生化参数（总蛋白、白蛋白、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、微量元素和激素）的稳定性在不同的实验室储存条件下，在人类和一系列动物物种中进行了试验[4，5，17]。这些研究表明，温度和储存时间是可能影响生化分析结果的重要因素。此类报告中关于急性期蛋白质稳定性以及储存对其在血液样本中浓度的影响的数据非常稀少。稳定性和储存研究为p其目的是确定储存对C-反应蛋白浓度的影响，C-反应蛋白是人类诊断中最重要的急性期蛋白[18，19]。事实上，关于急性期蛋白质储存稳定性的数据以及在兽医中储存温度和时间对其浓度的影响仍然有限。因为急性期蛋白质测定可能在牛的实验室试验中变得非常重要，包括血清淀粉样蛋白A及其乳腺亚型（要正确测量），需要更好地了解其生物变异以及分析前因素对其浓度的影响。

在本研究中，我们观察到样品在较低温度下储存对血清淀粉样蛋白a浓度的显著影响，其特征是在冰箱或冰箱温度下其浓度的变化强度不同。在冷冻血清样品中，结果显示SAA和M-SAA浓度随时间有显著降低的趋势。在储存2天后，浓度已经显著降低。在冰箱温度下保存的血清样品中SAA浓度与未保存的样品没有显著差异，但其平均值更低。Hillström等人研究了SAA的贮存稳定性[20.]在马血清样本中。作者观察到，在4°C温度下储存的血清样本中，SAA浓度随时间没有显著变化，并且日间的差异不高于该方法的不精确性。同样，在另一项研究中，马SAA标准池在4°C温度下储存两个月几个月后，未观察到SAA浓度的显著变化[21]这些作者只观察到测量值的轻微波动，他们解释了该方法的不精确性。此外，对于储存在实验室的样品，未发现对人类SAA和C-反应蛋白稳定性的影响−20°C持续2个月，直到实际测量[22]．Solter等[23Cerón等[24]据报道，急性期蛋白，包括结合珠蛋白和C反应蛋白，比血液中的细胞成分更稳定，并且可以在冰冻血清样本上进行分析[18，表明不同的标本处理和储存条件对急性期蛋白浓度的影响可能取决于分析配置，应在任何研究项目开始时进行验证。根据我们的发现，牛SAA在较低的温度下，尤其是在冷冻时，似乎不太稳定。在我们的研究中，SAA在冷冻和冷藏过程中获得的较低温度下的浓度降低，可能与该蛋白的不稳定性和降解有关，这是由于在存储过程中其分子构型发生了变化。SAA在储存过程中稳定性变化的另一个原因可能是它的生物学行为[20.]然而，上述相互矛盾的数据表明，需要进一步调查，以澄清储存温度和持续时间对牛血清淀粉样蛋白A浓度的可能影响，并解释在较低温度下储存期间其浓度的变化。

储存温度和时间对奶牛牛奶样品中SAA乳腺亚型浓度的影响还没有很好的文献记载。根据制造商的数据，用于M-SAA测定的牛奶样品可以在4°C下保存2天，或在−20°C下冷冻保存更长时间(Tridelta Development，爱尔兰)。然而，据我们所知，目前还没有关于样品储存对M-SAA浓度与储存温度和时间的关系的研究报道。在本研究中，我们观察到M-SAA值从第2天起在冷冻温度下显著递减。同样，在冰箱温度下的牛奶样品中发现M-SAA浓度没有显著降低。上述储存后牛奶样品中M-SAA浓度的降低可能是由于这种乳腺SAA亚型的降解造成的，因为已经发现在不同的温度和时间储存期间，有几个因素会影响牛奶成分[25]．Woltersdorf等人[26]的研究报告指出，冻结过程和由此产生的分析延迟可能会导致样品的物理变化，这可能会影响样品中分析物的浓度。对包括M-SAA在内的急性期蛋白质的浓度进行量化，以获得诊断或监测所需的信息[27，28]。这需要精确测量急性期蛋白质浓度和分析稳定性。根据上述结果，建议在牛中使用不冷藏的血清和牛奶样品进行SAA分析，包括确定其乳腺相关亚型的浓度，因为在试验过程中蛋白质降解在较低温度下储存可能会引起其浓度的变化。鉴于有关SAA及其主要乳腺异构体在不同条件下储存期间的长期稳定性的已发表数据仍然有限，进一步的研究可能会有所帮助。

5.结论

对于分析方法来说，适当的样品处理和处理是非常重要的。因此，应考虑与急性期蛋白测量分析前因素有关的问题，以避免在患病动物和健康动物之间可能出现的错误分类。我们的结果表明，作为样品处理的一部分，储存的温度和时间也是一些急性相蛋白分析的重要因素。我们的研究结果显示，样品储存(主要是在冷冻温度下)对牛血清淀粉样蛋白A及其乳腺相关亚型的浓度有显著影响，随着评估时间的推移，其值逐渐显著降低。因此，在较低温度下储存较长时间后，血清或牛奶样品中SAA以及M-SAA的测量可能不准确，可能导致错误的解释。根据这些结果，对不需冷藏的样品进行上述参数分析显得很重要。

致谢

这项工作得到了斯洛伐克研究和开发局的支持。apvv - 04710和VEGA科学基金资助编号:1月0614/09和1月0812/12教育部。

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