犬骨肉瘤中维生素D受体、维生素a X受体、Ki-67、Survivin和Ezrin的表达

摘要

犬骨肉瘤是一种侵袭性恶性骨肿瘤。预后主要由临床参数决定。维生素D已被认为是许多恶性肿瘤的一种新的治疗选择。激活后，维生素D受体(VDRs)与类维生素a受体(RXR)结合形成异源二聚体，引发级联反应。维生素D的抗肿瘤活性及其在OS中的作用机制尚不明确。在33份存档的犬骨肉瘤标本中研究了VDR、RXR、Ki-67、survivin和ezrin的表达。VDR、RXR、survivin、ezrin在大多数病例中表达。VDR表达与肿瘤分级、类型、部位、动物品种、年龄和/或性别的关系无统计学差异。无显著关联()肿瘤分级与Ki-67表达之间的差异;特别是Ki-67在2级和3级OSs中表达无差异，而Ki-67与VDR表达呈负相关(），存活素和RXR表达之间存在正相关，发现（）.VDR和RXR在OSs中的表达与增殖/凋亡标志物之间存在显著的相关性。这些结果为阐明维生素D诱导骨肉瘤抗肿瘤活性的机制奠定了基础。

1.介绍

骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)是犬类最常见的原发性骨肿瘤，占所有原发性恶性骨肿瘤的85% [1那2］.犬骨肉瘤是一种局部侵袭性肿瘤，转移极为常见[1］.转移瘤通常是血行转移，在病程早期出现。虽然不到15%的狗在诊断时有转移的影像学证据，区域淋巴结受损伤是罕见的，但大约90%的被诊断为骨肉瘤的狗会死于转移性疾病，如果切除边缘干净是唯一的治疗方法[1］.目前的治疗标准包括广泛切缘的手术切除，然后化疗以控制显微镜下的转移性疾病[1］.放射疗法尚未被证明是一种有效的治疗方式。它主要用于缓解姑息性疼痛[3.那4.］.有些已经显示出在手术切除前降低原发肿瘤分期的价值[3.］.

目前控制转移性疾病最有效的选择是多药化疗与阿霉素、顺铂或卡铂[1那5.］.虽然这些药物在控制骨肉瘤生长方面都显示出一定的有效性，但也有多种副作用，如骨髓抑制、肝毒性、肾毒性、心脏毒性、耳毒性、神经病变和过敏反应的报道。此外，治愈率很低，只有20%的患者成功地进入缓解期[1］.

尽管不断尝试提高治疗成功率，但报告的中位生存时间仍保持在235–540天[1那4.]，平均中位生存时间小于1年[1］.这凸显了当前治疗方案在治疗全身性转移性疾病方面的无效。

治疗OS等肿瘤疾病的有效方法是在新辅助治疗中使用细胞分化剂诱导分化。与健康骨细胞相比，骨肉瘤细胞具有一定程度的间变缺失的成熟细胞表型。生长控制的丧失伴随着成熟细胞表型的丧失导致不受控制的增殖。假设如果这些间变性细胞能够被诱导分化成成熟的表型，不受控制的增殖将得到控制[6.那7.］.自然发生的OS自发回归病例[8.以及与细胞凋亡增加和增殖减少与表型分化增加相关的体外研究[6.那9.那10支持这个理论。

虽然其作用机制目前尚不完全清楚，但维生素D已被证明能够诱导多种肿瘤的分化和减少增殖[11］.人类肿瘤，包括结肠癌、乳腺癌和皮肤癌[6.那9.那10]及犬类OS [10]已经证明对维生素D治疗有效。目前的研究具有重要的临床意义，因为之前的研究已经验证了使用犬OS作为人类OS的合适模型[12那13］.

膳食维生素D羟基化为其代谢活性形式1,25-二羟基维生素D_3.(1,25 (OH)₂D._3.)通过发生在肝脏和肾脏的羟基化过程[14］.1,25（OH）₂D._3.在传统上，它最著名的作用是促进钙和磷的体内平衡，促进这些矿物质从肠粘膜吸收[14]然而，最近的研究提供了强有力的证据，证明维生素D除了钙和磷的代谢外还有许多作用[15]，包括观察到的抗肿瘤作用[6.那9.-11］.

行动1,25 (OH)₂D._3.由维生素d受体（VDR），一个核磷结合1,25（OH）介导₂D._3.具有高亲和力。这改变了VDR的配体结合域，并导致与维甲酸X受体（RXR）的强烈异二聚作用。由此产生的1,25（OH）₂D._3.-VDR-RXR复合物促进维生素D响应元件结合和维生素D促进基因产物的转录[16］.

而体外研究表明，维生素D可诱导单个犬OS细胞系的分化和凋亡[9.那10]，维生素D作为犬OS治疗的潜在用途取决于其受体的表达[11］.据作者所知，VDRs在犬自发性骨肉瘤中的表达尚未见报道。

本研究的目的是通过免疫组化的方法评价VDRs在犬骨肉瘤中的表达情况。我们假设vdr将在相当大比例的犬骨肉瘤中表达，从而支持维生素D治疗作为犬骨肉瘤可行的辅助治疗选择的发展。此外，我们还试图将VDR的表达与RXR和肿瘤增殖(Ki-67)、凋亡(survivin)、进展和转移(ezrin)标记物的表达联系起来。

2.材料和方法

本研究包括2006年1月至2009年2月期间提交给堪萨斯城兽医实验室资源的33例确诊犬OS病例。所有样品固定在福尔马林中，必要时脱钙，并嵌入石蜡中。石蜡块在4微米处切片，安装在Superfrost+载玻片上，并在65°C烤箱中烘焙一小时。脱蜡后，VDR、RXR、Ki-67、survivin和ezrin载玻片在pH值为6.0的柠檬酸盐缓冲液中使用Biocare去泥室（压力锅）热处理5分钟。压力归零后，从试验箱中取出玻片罐，在缓冲液中冷却10分钟，然后转移到含吐温的tris缓冲盐水中。根据公司协议，所有染色均在室温下使用Dako自动染色机进行。用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶10分钟 然后清洗。主要抗体的供应商、效价、培养时间和检测方法见表1．抗体使用Dako公司抗体稀释液稀释。所有载玻片用Mayer氏苏木，脱水复，清除和永久安装介质封片。MIB-1是单克隆Ki-67的抗体。Ki-67的是仅在循环细胞中表达的核内蛋白，是细胞增殖的敏感标记物[17］.RXR是一种核蛋白，能结合各种类维生素a(聚异戊二烯类脂的一个家族，包括维生素a) [18］.它是维生素D应答基因产物转录所需的VDR复合物的内在组成部分。Ezrin是一种细胞骨架交联蛋白，参与细胞粘附、细胞存活和细胞运动，并与转移有关[19］.Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，在大多数正常的成体分化组织中不存在。Survivin在细胞周期的G2/M期表达，抑制凋亡[20.］.

每个肿瘤的代表性切片用苏木精-伊红(H&E)和上述免疫组化染色。对每种标记物进行适当的阳性和阴性对照。从外科病理实验室接受的手术标本中选择标志物阳性对照，与其他标本进行比较，确定其阳性。

所有的幻灯片由两位作者(OT和JD)同时阅读。确认OS的原始诊断，并根据分化程度、类骨生成、有丝分裂指数、细胞和细胞核多形性、坏死和侵袭性对每个样本进行核和组织学分级(1-3)。免疫组化反应阳性定义为VDR和ezrin的细胞质染色阳性(图)1和5.，RESP）和阳性核染色的RXR（图2), ki - 67(图3.），和存活（图4.）.采用Grizzle等的方法测定VDR和ezrin的免疫染色评分[21］.细胞质染色强度评分从0到3。每个强度水平的阳性细胞百分比乘以适当的强度评分;将这些值相加，然后除以单元格总数，得到0到3之间的加权平均分数。0分表示“消极”结果，1+、2+或3+表示“积极”结果。这种方法已经被证明比通常的0-3 +染色强度更具有代表性，因为它考虑了病变中抗原的存在和抗原表达的变化。它还考虑了幻灯片上的所有相关区域。对于Ki-67的增殖指数(PI)和RXR和survivin的百分率，使用ChromaVision自动细胞成像系统的PI程序测定阳性核的百分率（圣胡安Capistrano的，CA）。的10％以上为细胞的Ki-67染色的染色被认为是阳性的，而对于RXR和存活素，大于或任何计数等于5％被认为是阳性。

统计分析使用了曼-惠特尼组合检验和双尾斯皮尔曼秩相关检验[22］.的Mann-Whitney检测2个数据集之间的差异，例如2级和3级os之间VDR的表达，被认为是显著的。采用Spearman秩相关检验确定VDR表达和MIB-1表达两个连续因子之间是否存在显著相关性。α < 0.05被认为是显著的，对应于， >0.346表示显著相关。使用Minitab v. 15 (Minitab Inc.， State College, PA, USA)对数据进行分析。

结果

这些狗的平均年龄为10岁（平均9.3岁，范围为5-15岁）。品种包括拉布拉多猎犬（10只）、灰狗（5只）、罗特维尔猎犬（5只）、混血犬（4只）、大比利牛斯山猎犬（2只）、金毛猎犬（2只）、德国牧羊犬（2只）、美国比特犬（1只）、牧羊犬（1只）。肿瘤部位为肱骨（9只）、桡骨/尺骨（4只）、肩胛骨/肩部（4只）下颌骨（3）、上颌骨（4）、股骨（1）、髂骨（1）、跗骨（1）、胫骨（4）和未知位置（1）。

所有肿瘤均为II级(5例)或III级(28例)。4个是成软骨细胞，4个是成纤维细胞，1个包含成软骨细胞和成纤维细胞，1个是巨细胞骨肉瘤。32/33标本的核分级与组织学分级一致，无明显差异．因此，本研究仅对组织学分级进行进一步评估。

本研究分析的肿瘤中，76%(25/33)的VDR表达2）.VDR表达在不同组织学肿瘤分级间差异无统计学意义()，品种()、年龄()、性别()，或肿瘤位置成立。虽然没有统计显著（），4成软骨细胞骨肉瘤3表示相比于成骨细胞样肿瘤（4/23）VDR（2+）的高电平。

无显著关联()， Ki-67表达在2级和3级OSs之间无显著差异(）.此外，Ki-67与肿瘤位置无相关性()有趣的是，Ki-67表达最高的肿瘤(≥25%）为III级OSs，不表达VDR，分析发现Ki-67表达与VDR表达呈显著负相关．

RXR在肿瘤的97％（31/32）中的溶液以及式（≥25％）（表2）.这些异常发生在罕见的样品中，被认为是脱钙的人为因素。低水平(≤4%)survivin与脱钙伪影的观察一致，但survivin表达与肿瘤分级(），VDR表达式（)或Ki-67 ()有趣的是，发现survivin和RXR表达之间存在正相关(）.Ezrin均匀表达良好(≥2+)，除了一个归因于脱钙过程的单一样本。

4.讨论

作为一种控制肿瘤生长的方法，分化治疗是一个最近引起人们极大兴趣的概念。特别是维生素D，在其作用机制和对各种人类肿瘤的影响方面一直是深入研究的对象[6.那7.那11那18那23-25]。多项研究表明，维生素D可影响多种肿瘤细胞系的增殖率、凋亡程度和表型。这些研究报告了不同肿瘤类型之间以及同一肿瘤类型的细胞系内的不同效应和反应程度[6.那9.-11］.在Valrance等人的一项研究中，维生素D在一些(但不是所有)乳腺癌细胞系中诱导了促凋亡和抗增殖作用。Valrance等人指出，无应答的细胞系是那些缺乏VDR表达的细胞系[26］.虽然维生素D在肿瘤细胞系中诱导凋亡和抑制增殖的机制尚不清楚，但维生素D治疗的成功在很大程度上依赖于靶细胞群中VDR的表达[7.那11那26］.

Barroga等。报道维生素d类似物和类视黄醇犬OS细胞系的刺激分化成更成熟的表型表现出细胞凋亡增加的证据，并降低的细胞增殖[9.那10］.虽然他们的结果支持维生素D作为犬骨肉瘤治疗剂的功效，但所有的研究都是在单个自发犬骨肉瘤衍生的细胞系上进行的。由于维生素D治疗的成功依赖于VDR的表达，因此确定VDR是否在自发性OSs中表达是至关重要的，以确保进一步研究维生素D作为潜在的治疗药物。据作者所知，VDR在犬自发性骨肉瘤中的表达尚未见报道。

我们的结果显示，73%(25/33)的犬自发性OSs表达VDR, 27%(9/33)表达2+ VDR。这些结果也与我们最近报道的免疫组化数据一致，证实了VDRs在86.4%的原发和转移性人类OS肿瘤(110个肿瘤中的95个)中表达[27］.虽然临床反应所需的VDR表达水平尚不清楚，但这些结果表明，维生素D治疗可能对大多数自然发生的犬和人OSs有效。此外，软骨母细胞的高水平VDR表达是非常有趣的。虽然这与其他OS亚型没有统计学差异()这可能是由于样本量的限制。更大样本量的进一步研究可能显示出显著的差异，表明成软骨骨肉瘤对维生素D治疗的敏感性增加。

Krishnan和Feldman表明，通过血清和生长因子的联合刺激，乳腺癌细胞系中的VDR表达上调[28］.如果VDR表达可以类似犬OS被诱导，病例数容易引起维生素d疗法可以显著增加。

Cross等人的研究[29]的研究发现，在癌发生的早期，VDR的表达与去分化同时增加，而在晚期癌中VDR的表达水平较低。Cross等人认为结肠癌细胞通过增加抗增殖物质的产生来响应肿瘤细胞的增殖刺激，例如那些通过vdr介导的物质。晚期肿瘤中VDR的低水平是由于维生素D的抗增殖作用失败和随后VDR表达的丧失。大肠癌中VDR的高水平也与生存率的提高有关[24］.

无显著差异(）中的溶液在目前的研究VDR表达与肿瘤分级之间找到。这些发现类似于我们在人类OS先前报道的结果[27］.有趣的是，VDR表达与Ki-67呈负相关，支持了越激进的操作系统表达的VDR越少的理论。为了确定犬骨肉瘤中VDR表达与肿瘤级别之间是否存在联系，有必要将本研究扩大到更大的样本量和所有级别的骨肉瘤。

RXR是RXR- vdr -维生素D复合物的一个组成部分，对于促进维生素D应答基因产物的表达是必要的。如果RXR不足，则可能由于限制RXR水平，肿瘤对维生素D治疗无反应[23].在本研究中，以及在我们的人类操作系统研究中[27]，RXR一致地良好表达（在30/32例≥25％）和在该对VDR染色阳性的3例的异常，其中，所述表达缺乏归因于脱钙工件所有情况下找到。应当指出，然而，高水平的RXR的人也存在于不表达VDR样本。虽然我们的样本大小是有限的，该研究不支持RXR表达犬OS的维生素d治疗的反应的限制因素。

所有样本均额外染色细胞骨架蛋白ezrin。ezrin与人类乳腺癌、人类OS和OS小鼠模型的转移有关[19那30.-32］.此外，犬和人OS中ezrin的高表达已被报道与转移的早期发展相关[19那32］.与以往的报告一致[19]，埃兹蛋白所有样品（≥2+）与其中染色差归因于脱钙工件的单个壳体的例外中强烈表达。这些发现与犬OS的公知行为早很好的相关性发生转移[1］.不幸的是，在这项研究中没有相关的数据ezrin水平与转移的存在。然而，Ezrin很有趣，因为它可能被用作预后指标和治疗成功的衡量标准。低水平的ezrin可能与低级别肿瘤转移可能性较小有关。通过成功的分化治疗，转移应该被延迟/预防，并可以观察到ezrin水平的下降。还需要进一步的研究来确定ezrin染色是否可以用于这种方式。

目前，犬OS的组织学分级部分是通过评估每10个高倍视野中有丝分裂的数目来进行的[2］.虽然这是细胞有丝分裂的客观测量，但它不允许识别有丝分裂期以外的循环细胞。MIB-1是一种Ki-67免疫染色剂，可染色所有生长活跃的细胞[17，从而能够快速、客观、敏感地评估肿瘤内活跃的细胞循环。由于Ki-67水平高与OS迅速增殖相关，预计生存时间会缩短。然而，在我们的研究中，没有病例的生存数据，Jong等人的一项研究没有发现Ki-67表达与人类OS生存之间的相关性[33］.Ki-67似乎对预测生存率没有用处;然而，这将是一个有用的敏感的定量标记细胞增殖。

Survivin是一种核蛋白，是凋亡抑制家族中的一员。高水平的survivin在生长不受调节和细胞凋亡水平较低的肿瘤中被发现，并与人类OS患者生存下降相关[20.那34］.本研究中预期高survivin水平，因为大多数样本为高级别OSs。在21/31个样本中，Survivin表达良好(>25%)。虽然survivin的表达范围很广(0-98%)，但我们的研究没有发现survivin的表达与肿瘤分级之间的相关性．

由于本研究中没有生存数据，我们无法评估survivin表达和生存之间的相关性。评估survivin水平应该被纳入未来评估维生素D治疗效果的研究中，因为预期其水平会因维生素D的促凋亡作用而显著降低。

有趣的是，在survivin和RXR表达之间发现了微弱的正相关．至于有没有在生存一个显著差异（)或RXR ()的表达，这种弱相关性归因于RXR和survivin在所有样本中均表达良好。

维生素D在治疗犬骨肉瘤方面有很大的潜力。作为一种分化诱导剂，它的作用将是全身性的，并解决局部和转移性疾病。此外，与化疗的细胞毒性作用相比，维生素D的副作用理论上不那么严重，而且是可逆的，主要与剂量依赖性诱导的高钙血症有关[11那35］.

在许多肿瘤，包括犬OS维生素d虽然目前的研究载体中的抗增殖和促凋亡作用[6.那7.那9.-11那23那26那36，目前尚无评估狗或人类OS对维生素D反应的临床研究报道。然而，令人相当担忧的是，如果不发生高钙血症，维生素D的治疗水平可能无法达到。考虑到这一点，人们正在进行旨在开发钙维生素D类似物的研究[18那36］.从不同的角度的工作，其它的正在调查协同化合物，例如旨在增效维生素d的抗增殖和/或抗肿瘤作用[类视黄醇9.那36那37］.

虽然必要的回应和要实现的响应的维生素d量VDR表达程度是未来研究的一个课题，我们的研究结果支持了我们的假设自发犬的显著数量的操作系统（73％）表达VDRs并且是潜在的候选维生素d疗法。此外，如犬OS进行验证作为人OS的模型[13，这些发现可以潜在地推广到人类病人身上。

5.结论

总之，我们在绝大多数石蜡包埋的犬骨肉瘤标本中证实了VDR的存在。VDR和RXR在OSs中的表达与增殖/凋亡标志物之间存在显著的相关性。这些结果将为阐明维生素D诱导其抗肿瘤活性的机制奠定基础。我们正在进行的研究重点是阐明维生素D在人OS细胞系中介导的前分化、前凋亡和抗转移作用的分子基础。这项持续工作的结果，以及最近显示维生素D和化疗治疗犬OS的协同作用的研究，可能会提高对治疗的反应性和总生存率，同时减少治疗的副作用。

伦理批准

这项研究没有涉及人类或人类的材料或数据。该研究包括对未鉴定的豁免犬病理学档案材料的检查。

利益冲突

每个作者都要证明他或她没有可能与所提交的论文产生利益冲突的商业协会(例如，咨询、股票、所有权、股权、专利/许可安排等)。

承认

作者希望感谢Marsha Danley女士为本研究准备所有免疫组化材料提供了出色的技术帮助。

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