骨肉瘤(OS)是最常见的原发性骨肿瘤狗占85%的原发性恶性骨肿瘤( 1, 2]。犬本地操作系统是一个侵略性的肿瘤和转移是非常常见的 1]。转移通常是血性的路线,在病程早期出现。虽然只有不到15%的狗的影像学证据和区域淋巴结转移的诊断参与是罕见的,大约90%的狗转移性疾病的诊断为操作系统会死如果用干净的利润率是唯一治疗截肢 1]。目前的标准治疗包括手术切除与广泛的利润率其次是化疗控制微观转移性疾病( 1]。放射治疗并没有被证明是有效的治疗方法治疗。它主要被用于姑息止痛 3, 4]。一些已经显示其价值,争取降期可射频原发肿瘤手术切除(之前 3]。

目前控制转移性疾病的最有效的选择是多药化疗与阿霉素、顺铂或卡铂( 1, 5]。虽然都有了一些有效性控制操作系统的发展,多种副作用如骨髓抑制、肝毒性、肾毒性、毒性、耳毒性,神经病变,过敏反应的报告。此外,治愈率很低,只有20%的患者被成功地进入缓解期( 1]。

尽管继续试图改善治疗成功,报道中位数生存时代已经保持不变,仍为235 - 540天( 1, 4),平均不到一年的平均存活时间 1]。这突出了当前的无效治疗方案治疗系统性转移性疾病。

一个有效的方法来治疗肿瘤疾病,如操作系统是细胞分化的诱导分化通过使用代理在新辅助治疗。相比健康的骨细胞,OS细胞有一定程度的间变的成熟细胞表型。附带的生长失去控制失去成熟细胞的表型结果不受控制的扩散。假设,如果这些未分化细胞可以诱导分化成成熟的表型,不受控制的扩散将保存在检查( 6, 7]。天然情况下的操作系统自发地回归( 8)和体外研究细胞凋亡的增加和减少相关增殖增加表型分化( 6, 9, 10支持这一理论。

虽然其作用的机制目前不完全理解,维生素D已被证明是能够诱导分化和减少扩散在多个肿瘤( 11]。人类肿瘤包括结肠癌、乳腺癌、皮肤癌( 6, 9, 10)和犬类操作系统( 10)已被证明对维生素D治疗。目前的研究是临床意义重大,因为先前的研究验证了犬的使用操作系统作为一个适当的模型对人类操作系统( 12, 13]。

膳食维生素D是其新陈代谢活跃的形式1羟化,25-dihydroxy维生素D₃(1,25 (OH)₂D₃)通过羟基化的过程,发生在肝脏和肾脏 14]。1,25 (OH)₂D₃传统上最出名的是它的作用在钙和磷体内平衡,促进这些矿物质的吸收肠道粘膜( 14]。然而,最近的研究提供了强有力的证据表明,维生素D之外有许多影响钙和磷的代谢 15),包括观察anti-neoplastic效应( 6, 9- - - - - - 11]。

行动1,25 (OH)₂D₃是由维生素D受体(VDR),一个核磷蛋白结合1,25 (OH)₂D₃高亲和力。这个改变配体结合域的VDR和结果强烈heterodimerization类维生素a X受体(RXR)。结果1,25 (OH)₂D₃-VDR-RXR复杂促进维生素D响应元素绑定和转录的维生素D提升基因产物( 16]。

在体外研究表明维生素D诱导分化和凋亡在一个犬OS细胞系( 9, 10),维生素D的潜在用途用于治疗犬类操作系统依赖于其受体的表达( 11]。作者的知识,论述的表达在自发的犬类操作系统以前没有报道。

本研究的目的是评估船舶的表达在存档自发的犬通过免疫组织化学方法操作系统。我们推测,船舶会表示在一个足够大的比例的自发犬OSs支持维生素D治疗的发展作为一个可行的辅助治疗选择犬类操作系统。此外,我们试图与VDR的表达式与RXR和标记肿瘤扩散(ki - 67),细胞凋亡(存活素)、进展、转移(ezrin)。

33例证实狗操作系统提交给堪萨斯城兽医实验室资源的2006年1月至2009年2月,被纳入本研究。所有样品都浸泡在福尔马林溶液,在有需要的部位脱钙,嵌在石蜡中。石蜡块分段4微米安装在Superfrost +幻灯片和65°C的烤箱内烤一小时。deparaffinization之后,VDR RXR ki - 67,生存素,柠檬酸和ezrin幻灯片热处理在缓冲区pH值为6.0 5分钟使用Biocare显现室(高压锅)。压力为零,回来后的幻灯片jar从室被移除,在缓冲冷却10分钟,然后转移到tris-buffered盐水渐变。执行所有染色在室温下使用Dako Autostainer每公司协议。内源性过氧化物酶被用3%过氧化氢10分钟然后冲洗。主要抗体的效价,供应商孵化时间和检测方法在表 1。抗体是使用Dako抗体稀释剂稀释。所有幻灯片都与迈耶的苏木精复染色,脱水,清除和盖玻片永久安装媒体。MIB-1单克隆抗体ki - 67。ki - 67是一个核蛋白质只有循环细胞表达和是一个敏感的标记细胞增殖的 17]。RXR核内蛋白,结合各种类维生素a(一家polyisoprenoid脂质包括维生素a) ( 18]。这是一个内在组成部分所需的VDR复杂维生素D的转录响应基因产物。Ezrin是一种细胞骨架交联蛋白参与细胞粘附,细胞存活率和细胞活性和与转移 19]。生存素是细胞凋亡蛋白的抑制剂家族中的一员,在大多数正常成人分化组织不存在。生存素表达在G2 / M期细胞周期,抑制细胞凋亡( 20.]。

代表部分从每个肿瘤与苏木精和伊红染色())和上述免疫组织化学染色。适当的为每一个标记包括积极的和消极的控制。积极控制标记选择从手术标本在外科病理学实验室和与其他样品相比他们的积极性被确认。

所有幻灯片都读同时由两个作者(OT和JD)。最初的诊断系统确认和核和组织学分级(1 - 3)被分配到每个样本基础上分化的程度,生产类骨质、有丝分裂指数,细胞和核多形性、坏死和侵袭性观察。积极的免疫组织化学反应被定义为一个积极的VDR和ezrin细胞质染色(数字 1和 5、职责)和积极的核染色RXR(图 2),ki - 67(图 3),和生存素(图 4)。灰色等人的方法被用来确定船舶的应用分数和ezrin 21]。胞质染色强度得分从0到3。在每个强度水平的阳性细胞百分比乘以适当的强度得分;这些值被总结,然后除以总数量的细胞获得加权平均分数在0和3之间。0分表示“负面”的结果,和1 + 2 +,或者3 +代表“积极”的结果。这种方法已经被证明是比平时更代表0 - 3 +染色强度,因为它考虑抗原表达抗原的存在和变化的损伤。它还考虑所有相关领域的幻灯片。ki - 67增殖指数(PI)和百分比积极性RXR和生存素的比例核immunopositivity决心使用ChromaVision的π程序自动化的细胞成像系统 ( 埃西斯 ) (圣胡安Capistrano, CA)。10%或更多的染色细胞染色和ki - 67被认为是积极的,而对于RXR存活素,任何数量大于或等于5%被认为是积极的。

统计分析进行了使用Mann-Whitney的组合 U 测试和正反斯皮尔曼等级相关的测试( 22]。的Mann-Whitney U 测试用于确定两个数据集之间的差异,例如,等级2和3之间表达VDR OSs, ( p 值 ≤ 0.05 ) ,被认为是显著的。斯皮尔曼等级相关的测试是用来确定是否有两个连续等因素之间的显著相关性VDR表达式和MIB-1表达式。与α< 0.05被认为是显著的 ρ < - - - - - - 0.346 > 0.346代表显著相关。数据分析使用Minitab诉15(一款统计软件公司,州立大学,宾夕法尼亚州,美国)。

狗的年龄中位数是10年(平均9.3年,范围5 - 15年)。品种包括拉布拉多寻回犬(10),灰狗(5),罗特韦尔犬(5),混合品种(4),大白熊犬(2)金毛猎犬(2),德国牧羊犬(2),美国斗牛(1),牧羊犬(1)肿瘤位置肱骨(9),半径/尺骨(4),肩胛骨/肩(4),下颌骨(3),(4)与上颌骨,股骨(1),髂骨(1),睑板骨(1),胫骨(4)和未知的位置(1)。

所有肿瘤都是二级(5)或三级(28)。四是chondroblastic,四人成纤维细胞的,一个包含chondroblastic和成纤维细胞的细胞数量,一个是巨细胞操作系统。核级相同组织学年级在32/33样品,而不是明显不同 ( p = 1。0 ) 。结果,只有组织年级进一步评估在这个研究。

VDR表示在76%(25/33)的肿瘤在这项研究中(表分析 2)。没有统计上的显著差异VDR表达式被发现肿瘤组织学之间的成绩( p = 0.23 ),品种之间也没有显著关联( p = 0.097 )、年龄( p = 0.073 )、性别( p = 0.068 ),或肿瘤的位置 ( p = 0 。 015年 ) 发现。虽然没有统计学意义( p = 0.058 ),3 4 chondroblastic骨肉瘤表达高水平的VDR(2 +),而成骨细胞的肿瘤(4/23)。

没有明显的协会( p = 0.316 肿瘤分级和ki - 67)之间的表达式被发现,也没有明显差异ki - 67等级2和3之间表达OSs ( p = 0.791 )。此外,ki - 67之间没有相关性和肿瘤位置指出( p = 0.147 )。有趣的是,最高的肿瘤ki - 67表达(≥25%)是三级OSs,没有表达VDR分析时,发现了一个显著的负相关ki - 67之间的表达式和VDR表达式 ( ρ = - - - - - - 0 。 466年 ) 。

RXR很好表达(≥25%),97%(31/32)的肿瘤(表 2)。异常发生在罕见的样品和工件被归因于脱钙作用。而低(≤4%)的生存素水平与脱钙作用工件的观察是一致的,之间不存在相关性生存素表达和肿瘤年级( p = 0.076 ),VDR表达式( p = 0.330 ),或者ki - 67 ( p = 0.104 )。有趣的是,生存素之间的正相关和RXR表达式被发现( p = 0.374 )。Ezrin表达是一致(≥2 +)除了单个的样品是归因于脱钙作用过程。

分化治疗的方法控制肿瘤生长是一个最近生成的概念感兴趣。维生素D在特定的主题密集的研究,无论是在其作用机理及其对多种人类肿瘤的影响( 6, 7, 11, 18, 23- - - - - - 25]。多个研究表明维生素D可以影响扩散的速度、程度的细胞凋亡和众多的肿瘤细胞系的表型。这些研究报告变量影响和程度的响应在不同肿瘤细胞株内类型和相同的肿瘤类型( 6, 9- - - - - - 11]。Valrance等人在研究维生素D的proapoptotic和抗增殖效果被诱导在一些,但并非所有的乳腺癌细胞系。Valrance等人指出,停止响应的细胞系是那些缺乏表达VDR [ 26]。而维生素D诱导细胞凋亡的机制和抑制肿瘤细胞系的增殖不清楚,维生素D治疗的成功在很大程度上依赖VDR的目标人群内的表达细胞( 7, 11, 26]。

Barroga等人报道的刺激犬OS细胞与维生素D类似物和类维生素a分化成一个更成熟的表型,显示细胞凋亡和细胞增殖减少(增加的证据 9, 10]。虽然他们的研究结果支持维生素D的效果作为犬治疗代理操作系统,所有研究都是在开展细胞系来源于一个自发的犬类操作系统。因为维生素D治疗的成功取决于船舶的表达,它是至关重要的,以确定VDR是自发的OSs表达需要进一步研究维生素D作为一个潜在的治疗。作者的知识,VDR在自发的表达犬OSs以前没有报道。

我们的结果表明,VDR是73%(25/33)的自发表达犬OSs为27%(9/33)显示2 + VDR表达式。这些结果也符合我们最近报道免疫组织化学表达数据确认船舶在人类操作系统86.4%的小学和转移性肿瘤(95 110肿瘤)( 27]。的VDR表达必要的临床反应不知道,这些结果表明,维生素D治疗可能有效在大多数天然宠物和人类OSs。此外,高水平的VDR chondroblastic OSs表达的非常有趣。虽然这不是统计学与其他操作系统不同亚型( p = 0.056 这可能是由于样本大小限制。有大量的样本进一步研究可能表现出显著差异说明chondroblastic OSs的易感性增加维生素D治疗。

它已经表明,VDR表达式可以调节。克里希和费尔德曼表明VDR表达在乳腺癌细胞系调节通过刺激血清和生长因子( 28]。如果VDR表达式同样可以诱导犬操作系统,病例数容易维生素D治疗可能会显著增加。

交叉的研究等。 29日]研究人类结肠肿瘤发现VDR表达增加与去分化的早期阶段致癌而只有低水平的VDR在晚期癌表达。横等人建议,结肠癌细胞对肿瘤细胞增殖的刺激通过增加生产anti-proliferative物质,如通过论述介导。晚期癌的低水平的VDR是归因于维生素D的抗增殖效果的失败和随后的VDR表达式的损失。高水平的VDR在结直肠癌也与改善生存( 24]。

无显著差异( P = 0.23 )被发现之间VDR表达和肿瘤年级在当前的研究中。这些发现是类似于人类的操作系统(我们之前报道的结果 27]。有趣的是,VDR表达式和ki - 67之间负相关 ( P = - - - - - - 0 。 466年 ) 指出,支持更激进的OSs表达少VDR的理论。扩大这项研究包括一个更大的样本量和OSs的成绩是必要的,以确定是否有肿瘤分级和VDR表达之间的联系在犬类操作系统。

RXR不可或缺的组件RXR-VDR-Vitamin D复杂需要促进维生素D响应基因产物的表达。如果RXR存在不足,有可能是肿瘤可能停止响应限制RXR水平的维生素D治疗结果( 23]。在这项研究中,以及在人类操作系统研究[ 27]RXR一直表示(30/32例)≥25%,在所有情况下发现VDR除3例呈阳性,其中缺乏表达是归因于脱钙作用工件。然而,它应该指出高水平的RXR也出现在样本不表达。当样本容量有限,本研究不支持RXR表达式作为限制因素在犬OS维生素D治疗的反应。

所有样本另外染色的细胞骨架蛋白ezrin。Ezrin在人类乳腺癌转移,有关人类操作系统,和小鼠模型的操作系统( 19, 30.- - - - - - 32]。此外,高ezrin表达在狗和人类操作系统据报道与转移的早期发展( 19, 32]。符合之前的报道( 19],ezrin强烈表示在所有样本(≥2 +)除了一例可怜的染色被归因于脱钙作用工件。这些发现关联与已知的犬类行为操作系统转移早期( 1]。不幸的是,这项研究没有数据关联ezrin水平转移的存在。Ezrin很有趣,然而,它可能被用来作为治疗和预后指标作为衡量成功。低水平的ezrin将与低级别肿瘤转移的可能性较小。与成功的差异化治疗,转移应该推迟/预防和减少ezrin水平可以观察到。需要进一步的研究来确定ezrin染色可用于这种方式。

犬类操作系统目前组织学分级的评估有丝分裂的数量每10高功率数据字段( 2]。虽然这客观衡量细胞进行有丝分裂,它不允许循环识别细胞在有丝分裂阶段。MIB-1 ki - 67应用,污渍所有积极增长细胞( 17),允许快速、客观、积极的和敏感的评估循环肿瘤细胞内。高ki - 67水平与一个快速增殖操作系统,生存时间预计将下降。同时,生存数据是不可用的情况下在我们的研究中,金正日等的研究,没有发现ki - 67表达之间的相关性和生存在人类操作系统( 33]。ki - 67似乎没有有用的预测生存;然而,这将是有用的作为一个敏感定量标记的细胞增殖。

生存素是一种核蛋白质和细胞凋亡抑制剂家族的成员。高水平的生存素在肿瘤与不受监管的增长和低水平的细胞凋亡,与降低患者生存在人类操作系统( 20., 34]。高生存素水平在本研究预期的大部分样本优质OSs。生存素表达(> 25%)在21/31样品。尽管有广泛表达生存素(0 - 98%),我们的研究没有发现肿瘤存活素表达和年级之间的相关性 ( ρ = - - - - - - 0 。 07年 ) 。

生存数据没有在这项研究中,我们无法评估生存素表达和生存之间的相关性。评估生存素水平在未来的研究应该包括维生素D治疗评估的影响,作为其水平将大幅降低对维生素D proapoptotic效果。

有趣的是,生存素之间的弱正相关和RXR表达式被发现 ( p = 0.374 ) 。在生存素没有显著差异( p = 0.20 )或RXR ( p = 0.82 )组织学评分之间的表达式,这弱相关是由于这一事实RXR和存活素都一致表示在所有样本。

维生素D治疗犬类的操作系统也有巨大的潜力。作为诱导分化剂,其影响将是系统性和地址本地和转移性疾病。进一步的细胞毒性影响化疗相比,维生素D的理论上是不太严重的副作用和可逆的,相关的主要是剂量依赖诱导血钙过多( 11, 35]。

尽管目前的研究支持维生素D的抗增殖和proapoptotic效应在许多肿瘤包括犬OS ( 6, 7, 9- - - - - - 11, 23, 26, 36),没有临床研究评估狗或人类的反应与OS维生素D已报告。然而仍有相当大的担心治疗水平的维生素D可能不会实现没有不可接受的发展程度的高钙血症。有鉴于此,研究正在进行,目的是开发calcemic维生素D类似物( 18, 36]。工作从另一个角度,别人正在调查协同化合物类维生素a等旨在其余维生素D的抗增殖和/或抗肿瘤的效应( 9, 36, 37]。

虽然VDR所需表达的程度反应和维生素D的含量必须达到响应是未来研究的主题,我们的研究结果支持我们的假设,即大量的自发犬OSs(73%)表达船舶和是维生素D治疗的潜在候选人。进一步,犬类操作系统验证模型对人类操作系统( 13),这些发现可以推断人类患者。

总之,我们证明了VDR在绝大多数档案石蜡包埋的犬类操作系统样本。之间存在显著的关系VDR在OSs和RXR表达和增殖/凋亡标记。这些结果将为阐明机制建立的基础维生素D诱导其抗肿瘤的活性。我们正在进行的研究的重点是说明prodifferentiation调控的分子基础的维生素D, proapoptotic, antimetastatic维生素D的影响在人类OS细胞系。这种持续的工作成果,以及最近的研究显示合作治疗犬与维生素D和化疗,操作系统可能会导致提高响应性治疗和整体生存而减少治疗的副作用。