O 2 • − formation. Moreover, downregulation of macrophage iNOS expression, as well as the inhibition of iNOS activity by NOS inhibitors, unveiled an important role of this enzyme in controlling O 2 • − and peroxynitrite formation during macrophage stimulation. In conclusion, our data demonstrated that simultaneous induction of NADPH oxidase, together with the iNOS enzyme, can result in the uncoupled state of iNOS resulting in the production of functionally important levels of O 2 • − soon after macrophage activation with LPS. Moreover, we demonstrated, for the first time that increased concentrations of L-arginine further potentiate iNOS-dependent O 2 • − formation in inflammatory macrophages."> 新角色的精氨酸诱导Nitric-Oxide-Synthase-Derived超氧化物阴离子调节生产生264.7巨噬细胞 - raybet雷竞app,雷竞技官网下载,雷电竞下载苹果
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体积 11 |文章的ID 321979年 | https://doi.org/10.1100/2011/321979

米凯拉Pekarova,安东尼Lojek、韩亚Martiskova Ondrej Vasicek,卢西亚Bino, a . Klinke d·刘Radek Kuchta,书中Kadlec, Radimir Vrba,卢卡斯Kubala, ”新角色的精氨酸诱导Nitric-Oxide-Synthase-Derived超氧化物阴离子调节生产生264.7巨噬细胞”,科学世界日报, 卷。11, 文章的ID321979年, 15 页面, 2011年。 https://doi.org/10.1100/2011/321979

新角色的精氨酸诱导Nitric-Oxide-Synthase-Derived超氧化物阴离子调节生产生264.7巨噬细胞

米凯拉Pekarova,1 安东尼Lojek,1 Hana Martiskova,1,2 Ondrej Vasicek,1 露西娅Bino,1 答:Klinke,3 d .刘,3 Radek Kuchta,4 书中Kadlec,4 Radimir Vrba,4 和 卢卡斯Kubala1

1科学院生物物理研究所的捷克共和国,Kralovopolska 135 612 65布尔诺,捷克共和国

2马萨里克大学生物化学系,理学院,Kotlarska 267/2, 611 37布尔诺,捷克共和国

3汉堡大学心脏中心,心内科Martinistrasse 52岁,20246年德国汉堡

4布尔诺大学电气工程学院和通信技术,Technicka 3058/10, 616 00布尔诺,捷克共和国

学术编辑器:马可·安东尼奥Cassatella
收到了 09年9月2011年
接受 2011年11月07
发表 2011年12月18日

文摘

膳食补充剂与精氨酸改善各种炎症模型的免疫反应。然而,精氨酸对免疫细胞的影响的分子机制仍未被承认的。在此,我们测试的假设限制精氨酸可能导致小鼠巨噬细胞诱导一氧化氮合酶的非耦合状态,因此,增加诱导nitric-oxide-synthase-derived超氧化物阴离子形成。——重要的是,我们表明,精氨酸剂量和时间依赖性强超氧化物阴离子生产细菌endotoxin-stimulated巨噬细胞,尽管它不影响NADPH氧化酶表达和活动。详细分析巨噬细胞激活显示之间的时间依赖性LPS-induced伊诺表达和增加 O 2 • − 形成。巨噬细胞的差别,对这些伊诺表达式,以及伊诺活动的抑制NOS抑制剂,推出了这种酶控制的一个重要的角色 O 2 • − 和过氧亚硝基形成巨噬细胞刺激。总之,我们的数据表明,同步感应NADPH氧化酶,伊诺酶,可能导致伊诺的非耦合状态导致的生产功能重要的水平 O 2 • − 巨噬细胞与LPS激活后不久。此外,我们表明,第一次增加了精氨酸浓度进一步加强iNOS-dependent O 2 • − 形成炎性巨噬细胞。

1。介绍

先天免疫系统提供了一线防御有害的侮辱。旁边的有益作用生物防御,放松管制的先天免疫反应的发病机制涉及各种慢性疾病,包括充血性心力衰竭,2型糖尿病和相关并发症如血脂异常和artherosclerosis [1- - - - - -4]。这些病理条件被认为是紧密联系在一起的和长期的合成增加活性氧(ROS)和活性氮物种(没有;超氧化物阴离子 O 2 • − ;过氧化氢,氢2O2;过氧亚硝基,ONOO−激活单核细胞和巨噬细胞等)。特别是ROS建议负责氧化细胞内的一系列广泛的分子,包括DNA和蛋白质,可以促进动脉病变(1,3,4]。

O 2 • − 是第一个巨噬细胞产生的活性氧在他们接触各种激活刺激(如有限合伙人、细胞因子、生长因子和碎片的细菌膜)(5]。的重要来源 O 2 • − 在刺激后的第一个小时时间显示是巨噬细胞NADPH氧化酶酶复杂(6,7]。另一个至关重要的反应中间体,是极度的抗菌和抗肿瘤的活动参与巨噬细胞是没有8]。由一氧化氮合酶(NOS) biosynthesized精氨酸的巨噬细胞激活炎性刺激干扰素-γ、TNF和有限合伙人(8- - - - - -10]。酶的功能作为一个二聚体组成的两个相同的单体,可功能和结构上分为两个主要领域:c端还原酶域和一个氨基端加氧酶域。诱导NOS(间接宾语)被描述为calcium-insensitive和依赖于绑定不同的代数余子式和NADPH一样,黄素腺嘌呤二核苷酸,黄素mononuleotide,血红素,tetrahydrobiopterine (BH4)和钙调蛋白(11- - - - - -13]。有趣的是,这是显示之前,没有精氨酸或NOS代数余子式,伊诺孤立从巨噬细胞变成了非耦合14,15]。号的非耦合状态描述当电子从还原酶域流向血红素转移氧气而不是精氨酸,导致的形成 O 2 • − (16]。这些事实表明,同时生产 O 2 • − (NADPH氧化酶和伊诺酶)和(通过伊诺酶)可能会导致增加 O 2 • − 以及ONOO−形成。ONOO−短暂的氧化剂和有效的诱导物的细胞死亡,被认为是负责血管疾病的进展,ischaemia-reperfusion损伤、循环衰竭,和炎症(1,2,5]。

精氨酸是一种丰富的氨基酸在体液中是没有毒的细胞(17]。重要的是,它曾表明,精氨酸有一种独特的作用在维护免疫内稳态的18,19]。发现它是重要的是参与t细胞和巨噬细胞功能的调节20.- - - - - -22),根据不同的临床研究,现在建议补充精氨酸可以提高伤口愈合的临床效益和人类的免疫反应23,24]。以来,精氨酸是现在公认为影响先天性和获得性免疫反应之间的关系,我们测试的假设限制精氨酸可能导致伊诺的非耦合状态,因此,增加iNOS-derived O 2 • − 形成。目标是描述更详细,各种精氨酸浓度对动力学的影响 O 2 • − 和生产之间的可能联系伊诺蛋白表达和活动 O 2 • − 生产炎性巨噬细胞。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

除非另有说明,所有化学品都购自Sigma-Aldrich(美国)。小鼠腹腔巨噬细胞原始264.7线得到来自美国收集类型(美国写明ATCC)和文化是生长在杜尔贝科修改鹰的媒体(PAA、派斯克、奥地利)补充10%胎牛血清(的边后卫,低内毒素;庆大霉素PAA、派斯克、奥地利)和1%。细胞被刺激与50 ng / mL的有限合伙人(大肠杆菌血清型026:B6)。

细胞外精氨酸的影响评估可用性、L-arginine-free DMEM媒体被用于实验。DMEM媒体与不同浓度补充精氨酸:100,200,300,400μ米,根据一些标准选择。首先,我们选择剂量与参考类似哺乳动物血浆精氨酸(~ 36 - 140的值μ米)(25)和精氨酸浓度最高(400μ米)与它的内容相当商业化DMEM媒体常用的在体外实验。

以下NOS抑制剂被:N-nitro-L-arginine甲酯(L-NAME;最终浓度25μ米)、2-amino-5 6-dihydro-6-methyl-4H-1 3-thiazine (AMT;最终浓度10μ米),氨基胍(AG);最终浓度10μ(M), L-N6) - 1-iminoethyl赖氨酸(赖氨酸;最终浓度10μ米)。

2.2。细胞生存能力

细胞的生存能力测试是基于总细胞贴壁细胞的质量,使用detergent-compatible蛋白质测定试剂(Bio-Rad实验室、美国),以牛血清白蛋白为标准,如前所述[26]。没有一个研究药物浓度有毒原料264.7的应用(数据没有显示)。

2.3。细胞内精氨酸浓度

细胞内精氨酸是决定使用一种验证大规模液体chromatography-tandem质谱(质/ MS)分析,详细描述其他地方(27]。细胞在DMEM媒体没有精氨酸或400μ米精氨酸在没有或有限合伙人(50 ng / mL)的24 h。

2.4。免疫印迹分析伊诺

264.7后的治疗过程中,原始细胞细胞溶解使用SDS-lysing缓冲区。相同数量的蛋白质(30μg)从每个溶菌产物受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳,像前面描述的那样28]。蛋白质电泳后,被转移到PVDF (Immobilon-P)膜,然后用鼠标孵化iNOS-specific抗体(1/5000)(Anti-iNOS / NOS II型马伯,转导实验室、美国)24 h,和辣根peroxidase-labelled anti-mouse IgG抗体(1/2000)(ECL anti-mouse免疫球蛋白,生物科学,美国)1 h。蛋白质的平等加载被验证了β肌动蛋白免疫印迹(美国1/5000,SantaCruz生物技术)。这些墨迹可视化使用西方SuperSignal Pico化学发光底物(美国皮尔斯)和暴露于CP-B x光片(爱克发,捷克共和国)。蛋白质的相对水平被扫描测密度术量化,使用ImageJ程序,个人带密度值表达任意单位。

2.5。亚硝酸盐的测定

没有生产决定基于没有氧化产物亚硝酸盐的积累。亚硝酸盐积累在细胞培养基是由格里斯方法,使用亚硝酸钠作为标准,如前所述[29日]。

2.6。细胞色素c还原试验

的细胞外生产 O 2 • − 巨噬细胞是通过分光光度分析的细胞色素c还原如前面描述的细节(30.]。过氧化物的浓度计算使用的消光系数降低了细胞色素c。

2.7。NADPH氧化酶活性测定

NADPH氧化酶活性测定在细胞溶解产物准备根据完善的协议(31日]。简单地说,100年μL的测试解决方案,lucigenin添加在最后一集中5μm .之后,NADPH在100年最终浓度μM是添加到开始生产 O 2 • − 。发光信号测量1 h。

2.8。检测NOX2、p47phox p67phox表达式定量rt - pcr

从原始264.7细胞总RNA分离试剂盒的解决方案(美国MRC三试剂RT),根据供应商的指令。RNA (1μg)反向转录cDNA根据制造商的指示(发电机cDNA合成装备,Finnzymes,芬兰)。引物和探针。20 NOX2、p67phox p47phox设计使用通用探针库(瑞士罗氏公司)。引物的序列如下:NOX2(向前5′-gtgcacagcaaagtgattgg-3′,反向5′-tgccaacttcctcagctaca-3′), p47phox (forvard 5′-ctgccacttaaccaggaacat-3′,反向5′-ggacaccttcattcgccata-3′),和p67phox (forvard 5′-ccagccattcttcattcaca-3′,反向5′-cccaggtggtagcaatcttc-3′)。实时PCR进行RTCykler7300(应用生物系统公司)和放大的参数设置根据供应商的指令。信使rna诱导的褶皱是计算使用 Δ Δ 方法,与GAPDH看家基因(美国应用生物系统公司TaqMan啮齿动物GAPDH控制试剂)(31日]。

2.9。264.7原始细胞的转染

使用电穿孔系统(II基因脉冲发生器,Bio-Rad laboratopries,美国,详情参见[31日]),细胞转染质粒含有成分构造,对伊诺和负控制质粒炒序列(美国Origene)。稳定转染细胞在DMEM + 5%的边后卫和5μ克/毫升嘌呤霉素。264.7原始细胞转染shRNA和消极控制质粒对LPS刺激敏感。对于LPS-activated生264.7与负控制细胞转染质粒,伊诺的表达蛋白质、亚硝酸盐积累,和 O 2 • − 生产比得上那些测量nontransfected LPS-activated 264.7原始细胞(数据未显示)。

2.10。Luminol-Enhanced化学发光(CL)测定氧化破裂

巨噬细胞的CL是衡量使用微型板块光度计LM-01T (Immunotech,捷克共和国),如前所述[32]。简而言之,100年的反应混合物包括μL细胞( 1 0 0 × 1 0 5 ),1毫米腔的,其中一个氧化破裂活化剂(PMA, 97.6μg / mL或调理的酵母聚糖颗粒(丁),0.4毫克/毫升)。自发的CL测量样本中含有巨噬细胞和其他物质,但没有催化剂,包括在每一个试验。2 h CL发射后的37°C。CL反应的积分值代表了由巨噬细胞ROS总产量。

2.11。免疫细胞化学

该方法被用于评估没有, O 2 • − 派生ONOO−,这是众所周知的,与酪氨酸残基在蛋白质和反应产生一个特定的硝化产物,硝基酪氨酸(14]。短暂,治疗后在98孔板(PAA),和4%的多聚甲醛固定细胞PBS在室温下30分钟。细胞培养用鼠标单克隆antinitrotyrosine免疫球蛋白(美国北部生物技术1:500)1 h。疣是一个使用3-amino-9-ethylcarbazole Extravidin过氧化物酶染色设备来完成作为发色体。光学显微镜下细胞被拍到×200放大。

2.12。检测清除毒品对没有的属性

的潜在药物的清除能力没有化学电化学测试系统测试的不,像前面描述的那样28]。测试药物的清除属性表示成一个快速减少NO-induced信号检测电极连接到ISO没有MARK II稳压器(美国WPI)。积分得到的曲线下的面积与的总量没有出现在玻璃小瓶,用于清除属性的评估测试的药物。药物和化学物质的清除属性对不并不重要(数据未显示)。

2.13。数据分析

数据统计分析使用一个单向方差分析(方差分析),紧接着Dunnett多重比较的测试(Statistica Windows 8.0, Statsoft,塔尔萨,俄克拉荷马州,美国)。所有数据报告为±SEM手段。一个 值小于0.05被认为是显著的。

3所示。结果

3.1。L-Arginine-Enhanced生产 O 2 • − 在原始264.7巨噬细胞与LPS刺激

在第一组实验中,我们测试了既定的假设限制精氨酸的可用性可能会导致伊诺的非耦合状态,因此,增加iNOS-derived O 2 • − 形成。令人惊讶的是,我们发现,在生的时候264.7细胞孵化有限合伙人,精氨酸,在所有浓度(100 - 400年使用μ米),造成了显著的剂量和时间增加 O 2 • − 形成,开始上升12 h后的细胞孵化有限合伙人(图1)。264.7相比原始细胞在DMEM培养没有补充精氨酸,精氨酸的细胞内浓度显著增加细胞治疗24小时后400年μ精氨酸( 3 8 。 9 1 ± 3 。 1 8 μM和 7 1 。 5 0 ± 3 。 2 5 μM *,意味着±SEM),是由特定的质/ MS方法。


图1
O 2 • − μ O 2 • − = 6 ∗ < 0 。 0 5 精氨酸剂量和时间管理264。7生产LPS-stimulated原始细胞。细胞培养在L-arginine-free DMEM或与不同浓度DMEM精氨酸(100,200,300,400米)和刺激有限合伙人(50 ng / mL)。的测定细胞培养上清液中表示时间有限合伙人管理使用细胞色素c。结果后表示意味着±SEM ()。。
3.2。进气阀打开蛋白质的时间感应,没有生产, O 2 • − 264.7形成LPS-Stimulated原始细胞

的显著增加 O 2 • − 生产LPS-stimulated巨噬细胞导致的起源问题 O 2 • − 这是在生产实验。因此,我们测量了伊诺蛋白质表达、亚硝酸盐积累,和也 O 2 • − 形成在一个时期后24 h LPS刺激巨噬细胞在DMEM培养与400年媒体μ精氨酸。正如所料,孵化264.7原始细胞与LPS导致亚硝酸盐和表达的时间积累伊诺蛋白质(图2(a))。伊诺的表达开始大约4 h 264.7原始细胞与LPS刺激后,紧随其后的是一个循序渐进的亚硝酸盐积累在细胞上清液(图2(a))。伊诺表达达到最高水平后6 h有限合伙人管理然后保持稳定,直到实验结束。有趣的是,264.7的详细分析表明,孵化原始细胞与有限合伙人也导致了一个依赖于时间的生产 O 2 • − 开始早起(约。,3 h after LPS administration) and was stable for the next few hours. Then we observed a massive increase in O 2 • − 形成(图2(a))。蛋白质浓度的细胞质量没有显著改变的实验小组,相比,控制细胞。这表明没有一个研究药物浓度有毒原料264.7的应用(数据未显示)。


图2
O 2 • − μ O 2 • − = 6 μ = 3 ∗ < 0 。 0 5 伊诺蛋白质表达、亚硝酸盐积累,264。7生产和NOX2 mRNA的表达的原始细胞。细胞在DMEM孵化媒体包含400米精氨酸与LPS刺激(50 ng / mL)。伊诺的表达蛋白在细胞溶解产物,亚硝酸盐的积累,生产在细胞上清液(a)测定时间点表示。结果代表意味着±SEM ()。(b) NOX2、p47 p67phox表达,细胞在DMEM培养媒体与不同浓度的精氨酸(0、100、200、300和400米)和刺激有限合伙人(50 ng / mL) 4 h。结果代表意味着±SEM ()。。
3.3。L-Arginine-Enhanced生产 O 2 • − 没有与NADPH氧化酶表达的变化和活动

因为NADPH氧化酶是已知的主要来源 O 2 • − 在激活吞噬细胞,我们决定是否改变 O 2 • − 生产期间观察巨噬细胞激活的时候增加选定的NADPH氧化酶亚基的表达。使用定量rt - pcr方法,我们表明,有限合伙人的mRNA水平显著增加只有NOX2膜相关复杂(图2(b)),胞质p47剩下p67子单元的水平(图的影响2(b))。重要的是,细胞外补充精氨酸没有改变所有子单元的mRNA水平nonstimulated和LPS-stimulated原始细胞(图264.72(b))。研究巨噬细胞NADPH氧化酶的活性和细胞溶解产物,我们使用两个已知的氧化催化剂破灭,PMA和丁屋。我们发现PMA和OZP-induced O 2 • − 形成不受应用精氨酸的浓度(0 - 400μ米)(数据没有显示)。

3.4。L-Arginine-Enhanced生产 O 2 • − 依赖于伊诺在原始264.7巨噬细胞表达吗

进一步定义L-arginine-dependent伊诺酶的调控作用 O 2 • − 264.7生产,我们建立了稳定的原始细胞克隆转染shRNA对伊诺(进气阀打开−−/264.7原始细胞)。LPS-stimulated生264.7相比,成功转染进气阀打开−−/264.7原始细胞的特征表达下调伊诺蛋白表达(图3(a))。相应地,原始264.7中的亚硝酸盐积累细胞上清液明显高于24小时与LPS刺激后,与亚硝酸盐的基础水平相比nonstimulated生264.7,而没有增加在伊诺观察−−/264.7原始细胞上清液。有趣的是,类似的效应决定 O 2 • − 生产,在伊诺显著降低−−/与有限合伙人(图264.7原始细胞刺激3(b))。


图3
O 2 • − −−/ −−/ μ O 2 • − 2 = 6 O 2 • − = 6 ∗ < 0 。 0 5 伊诺蛋白表达、亚硝酸盐积累和在原始生产264.7和进气阀打开264。7原始细胞。巨噬细胞是稳定转染shRNA与进气阀打开,然后用LPS刺激(50 ng / mL)。生264.7和进气阀打开264。7原始细胞在DMEM媒体包含400孵化精氨酸。伊诺蛋白表达在细胞溶解产物,亚硝酸盐的积累(a),和生产在细胞上清液(b)确定使用方法中描述的部分()。的生产也有权势的人使用(c) PMA和(d)丁屋有或没有合并施打有限合伙人(50 ng / mL) ()。。

此外,我们分析是否在伊诺NADPH氧化酶活动−−/264.7原始细胞可以伊诺的差别的影响对这些基因的蛋白表达。我们使用PMA和丁nonstimulated和LPS-stimulated激活的巨噬细胞在400年的存在μ精氨酸。我们发现治疗生264.7和进气阀打开−−/264.7原始细胞与PMA或丁导致类似的变化 O 2 • − 形成,表现为细胞色素c还原(增加数据3(c)和3(d))。然而,当264.7原始细胞暴露在有限合伙人24 h, PMA和OZP-induced O 2 • − 生产显著疗效,伊诺相比−−/264.7原始细胞,没有这样的观察增加。伊诺的差别因此,我们得出结论,对这些基因的蛋白表达并不直接影响NADPH氧化酶的活化。

增加NOS-dependent O 2 • − 形成导致的问题是否硝基酪氨酸的含量反映了ONOO的生产−在巨噬细胞。而LPS-treated生264.7,连同原始264.7与负控制细胞转染质粒,对硝基酪氨酸密集的染色,我们发现对伊诺没有影响−−/与有限合伙人(图264.7原始细胞刺激4)。有趣的是,264.7 LPS-stimulated原料的预处理细胞L-NAME (25μ米)导致显著降低硝基酪氨酸的疣状(图4(c))。


图4
μ −−/ −−/ μ 硝基酪氨酸在264.7 (a)原始细胞形成,264.7 (b)原始细胞与LPS刺激,264.7 (c) LPS-stimulated原始细胞接受L-NAME (25米),(d)进气阀打开264。7原始细胞,(e)进气阀打开264。7原始细胞与LPS刺激,(f)生264.7与负控制细胞转染质粒与LPS刺激。细胞在DMEM孵化与400年媒体补充精氨酸。
3.5。NOS抑制剂调节没有, O 2 • − 264.7生产LPS-Stimulated原始巨噬细胞

来验证我们的假设,增加 O 2 • − 形成与伊诺酶的活动,我们使用不同的NOS抑制剂(AMT) 10μM;AG) 10μM;L-NAME, 25μM;赖氨酸、10μ米)。所有的研究药物浓度有毒原料264.7的应用(数据未显示)。首先,我们测试了抑制剂的影响在伊诺蛋白质表达和iNOS-derived没有24小时的生产。264.7 LPS-stimulated原始细胞的接触AMT, AG) L-NAME,和赖氨酸造成显著抑制亚硝酸盐形成的细胞上清液,而伊诺蛋白表达没有改变(图5(一个))。在控制实验中,我们发现所有的NOS抑制剂检测能够诱导伊诺nonstimulated生264.7细胞蛋白质表达或亚硝酸盐积累400年的孵化μ米精氨酸(数据没有显示)。

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(一)
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(b)
图5
O 2 • − μ = 6 O 2 • − μ = 6 ∗ < 0 。 0 5 号inhibitors-dependent LPS-induced亚硝酸盐积累和监管264。7生产原始细胞刺激有限合伙人。细胞用NOS抑制剂预处理浓度表示的DMEM媒体包含400的存在精氨酸。(一)LPS-induced伊诺蛋白表达和亚硝酸盐积累测定细胞培养24小时后)。(b)生产以DMEM媒体包含400的存在米精氨酸在两个时间点:10和15 h后有限合伙人管理局()。。

确认 O 2 • − 由进气阀打开,电池使用两个跨度为NOS抑制剂的选择,结果显示如图2。NOS抑制剂一起管理有限合伙人没有影响 O 2 • − 生产在孵化前10 h(图5 (b))。相比之下,孵化15 h后,超过70%的 O 2 • − 生产被使用的所有NOS抑制剂(图5 (b))。此外,NOS抑制剂NADPH-oxidase-derived没有影响 O 2 • − PMA - 264.7或OZP-activated生细胞生产与400年孵化μ米精氨酸缺乏有限合伙人(数据没有显示)。

3.6。黑洞4能够抑制L-Arginine-Induced没有和 O 2 • − 264.7生产原始细胞

发表的数据显示Kuzkaya et al。33),我们预计伊诺的非耦合状态引起的增加细胞外精氨酸浓度在264.7 LPS-stimulated原始细胞可以减少水平的黑洞造成的4在时间的实验。我们添加了一个额外的10μ米的黑洞4与400年的媒体μ米精氨酸以及有限合伙人(50 ng / mL)刺激。我们发现与黑洞264.7原始细胞的治疗4对亚硝酸盐积累和没有影响吗 O 2 • − 生产10 h后孵化有限合伙人(数据未显示);然而,它能够部分防止大规模增加 O 2 • − 生产24 h后孵化有限合伙人(图6)。因此,治疗264.7原始细胞与黑洞4引起亚硝酸盐积累的增加24 h后的细胞孵化有限合伙人,和伊诺蛋白表达(图尚未受到影响6)。

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(b)
图6
4 O 2 • − 4 μ O 2 • − = 3 ∗ < 0 。 0 5 黑洞的影响在伊诺蛋白表达、亚硝酸盐积累和264。7生产原始细胞。细胞培养的基本号代数余子式,黑洞在DMEM媒体包含400精氨酸。伊诺蛋白表达在细胞溶解产物,亚硝酸盐的积累(a),和生产在细胞上清液(b)测定细胞培养24小时后与有限合伙人(50 ng / mL)。结果代表意味着±SEM ()。。

4所示。讨论

当前数据清楚地表明,在没有生产的规定,精氨酸是能够导致iNOS-derived增加剂量和时间 O 2 • − 形成炎性巨噬细胞。我们的发现是重要的对巨噬细胞的激活和/或积累可以显著促进炎症的发展,以及许多疾病,已被证明与精氨酸代谢受损和血浆精氨酸水平降低(如哮喘,肺动脉高压,cytstic纤维化和肾功能衰竭)(34- - - - - -39]。

目前,NADPH氧化酶仍被视为的主要来源 O 2 • − 在炎性巨噬细胞(7]。重要的是,它被证明之前,伊诺来自巨噬细胞能够产生的重要功能水平 O 2 • − 条件下,除了没有一代精氨酸或代数余子式的损耗14,15]。相比之下,我们的差别表明,对这些伊诺蛋白表达明显减少 O 2 • − 生产LPS-stimulated巨噬细胞暴露于400年μM细胞外的精氨酸。我们发现,在炎症条件下,伊诺酶的活性显著贡献 O 2 • − 生产15个小时后孵化有限合伙人的巨噬细胞。重要的是, O 2 • − 生产会增加细胞外精氨酸浓度。从这些观察,几个问题出现。(一)增加 O 2 • − 形成与变化NADPH-oxidase表达式或活动?(b)有时间之间的一致性 O 2 • − 形成,伊诺蛋白表达,iNOS-dependent不生产?(c)是伊诺可能负责增加 O 2 • − 形成?

根据我们提供的数据,我们提出以下可能的解释。首先,NOS抑制剂用于这项研究可以清除ROS和没有属性。这个解释可以拒绝,因为没有清除的属性NOS抑制剂在我们的研究中被发现。第二个选择是NOS抑制剂或精氨酸可能就调节的NADPH oxidase-dependent生产 O 2 • − 。然而,我们表明,没有一个测试化合物的影响 O 2 • − 生产从NADPH氧化酶在巨噬细胞激活PMA或丁有限合伙人的缺失。第三种可能,精氨酸调控LPS-stimulated巨噬细胞NADPH氧化酶的表达,也反驳了,因为治疗264.7原始细胞有不同的细胞外精氨酸浓度没有影响NOX2, p47, p67 mRNA水平。最后,经过一系列的实验和进气阀打开−−/生264.7巨噬细胞和NOS抑制剂,我们证明了我们的假设的大量增加 O 2 • − 形成很可能引起巨噬细胞伊诺“解偶联。”

根据我们的研究证明,精氨酸浓度增加积极贡献伊诺的非耦合状态。相比之下,夏et al。14,15),在他们的研究中,提出了胞质精氨酸引起的损耗 O 2 • − 从巨噬细胞伊诺一代。夏et al。14还显示,增加 O 2 • − 生产可以跟着一个NOS-dependent ONOO−形成。他们认为,通过耦合精氨酸水平伊诺蛋白质合成,巨噬细胞提供一个机制来确保伊诺L-arginine-depleted细胞不表达,有毒 O 2 • − 不能生产。基于这些数据,其他的临床研究表明,有限的精氨酸水平的重要来源 O 2 • − ——以及ONOO−介导的组织损伤(34,36,37,40]。与我们的结果相比,有出现了一个重要的问题有关的可能性缺乏精氨酸是巨噬细胞ONOO负责−形成。我们的数据和其他人发布的数据41,42)表明,当伊诺精氨酸是不可用的,没有没有生产刺激巨噬细胞,从而无法反应 O 2 • − 形成ONOO−。因此,它是有问题的,如果iNOS-derived ONOO−可以负责增加硝基酪氨酸L-arginine-free媒体形成巨噬细胞激活了夏et al。14,15]。此外,夏et al。14)没有检测 O 2 • − 生产由巨噬细胞孵化有限合伙人和干扰素-γ在精氨酸补充媒体24小时后。相反,在我们的实验中,LPS-induced O 2 • − 形成可以检测到至少两个不同的方法论的方法上面所示。有趣的是,我们的研究和学习的唯一区别的夏et al。14,15)是由干扰素-巨噬细胞的聚集有关γ。有限合伙人和干扰素-γ被其他作者评估用于巨噬细胞刺激吗 O 2 • − 和ONOO−生产由巨噬细胞(42,43]。阿玛托等。42)描述细胞刺激后8 - 18 h之间没有生产是轻微的,和一个强大的线性增加当时18-48观察一段时间。同样在我们的实验中,逐渐的开始没有发现生产后6 h(巨噬细胞孵化有限合伙人。此外,阿玛托等。42)发现ONOO巨噬细胞产生−经过18 h的孵化与刺激器,这是符合我们的数据。

我们建议,在时间与LPS激活巨噬细胞,精氨酸是被伊诺酶,导致生产的不。因为在巨噬细胞NADPH氧化酶产生相关的 O 2 • − 在第一个小时与LPS刺激后,可以很容易地与iNOS-derived没有反应,形成高活性ONOO−。精氨酸越多,ONOO越多−这是生产。因为ONOO−是一个强大的氧化剂,它能容易氧化黑洞吗4,这可能导致的形成 B H 3 • 激进。这种现象已经描述的内皮细胞和血管,文化,这些条件造成以挪士解偶联。有趣的是,ONOO内皮细胞接触后−可以完全恢复,以挪士活动治疗细胞与外生黑洞4(33]。我们假设相同条件下可能发挥重要作用在伊诺解偶联是黑洞的补充支持的事实4培养和LPS-stimulated巨噬细胞部分避免增加 O 2 • − 形成经过长时间的孵化有限合伙人。

我们的研究有重要的意义。我们已经表明,有限合伙人可以biphasically诱导 O 2 • − 264.7生产原始细胞。LPS-stimulation在最初的几小时后,巨噬细胞产生相对较小,但大量的 O 2 • − 这应该被视为是由NADPH氧化酶激活。在第二个阶段,LPS引起大规模增加 O 2 • − 生产,主要是由于伊诺解偶联。更重要的是,的第二阶段 O 2 • − 生产是直接由细胞外精氨酸的可用性。

总之,精氨酸可用性似乎发挥重要作用对巨噬细胞的免疫状态和目前双方的问题。一是缺乏细胞外精氨酸是负责相关免疫函数的衰减降低免疫细胞增殖并没有生产,从而导致不同病理生理状态(44- - - - - -48]。另一方面,补充精氨酸可能导致增加 O 2 • − ,随后增加ONOO形成对宿主防御至关重要,但也可能是有害的对宿主细胞/组织。

确认

作者感谢Lenka Vystrcilova优秀技术援助和生物科学罢工的专家语法分析。下这项工作进行支持的研究计划(AVOZ50040507和AVOZ50040702)和捷克科学基金会(524/08/1753)、马萨里克大学的布尔诺(市政/ C / 0886/2010),和欧洲区域发展Fund-Project FNUSA-ICRC(没有。CZ.1.05/1.1.00/02.0123)。

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