的多样性结核分枝杆菌乌干达西南部肺结核相关的复杂谱系

抽象的

乌干达是世界上22个国家之一，结核负担。该国西南地区一直注册了高TB / HIV发病率。本研究旨在表征结核分枝杆菌乌干达西南部的复合体（MTBC）基因型多样性。使用特定的单核苷酸多态性标志物的血管结核病患者共有283个痰样品，用于血管分析3和4.大多数患者是男性，平均年龄为34岁。血统4乌干达家族被发现是最占主导地位的菌株占所有案件的59.7％，然后划分为15.2％。血统4个非乌干达家族占所有病例的14.5％，而4.2％显示血统4和谱系的扩增3. 88个样品（6.4％）的菌株仍然未分类，因为它们不能与任何基于任何血统匹配的菌株使用基因分型技术。该研究表明，具有血统4乌干达家族的血管肺结核，患者患有肺结核的肺结核是更为占主导地位的。然而，为了确认这一点，需要使用更多辨别性基因分型方法进行进一步的研究。

1.介绍

结核病（TB）是一种古老的传播疾病，过去几千年仍然存在，迄今为止仍然是全球主要的公共卫生问题。它是由称为密切相关的酸 - 快速细菌引起的结核分枝杆菌复杂的（MTBC）与七个人采用的MTBC谱系（指定谱系1通过谱系7），两个谱系适应各种野生动物物种，但能够引起人类感染的牵连[1-4.]．流行病学研究表明，这种有机体的强神经图构造[5.-7.]并适应对称人类人群[8.那9.]．这使得这些谱系在某些地理位置的特定人口中更占主导地位[1那7.那10.]．例如，谱系2（L2）在东亚最主要占主导地位，与毒力和耐药性比其他谱系更有关[11.那12.]．L1(中度毒性)和L3主要发生在印度洋周围地区，而L5和L6高度局限于西非[13.那14.]．L4通常在非洲，中美洲，欧洲和南美洲发现[15.]，而L7在埃塞俄比亚[高度和排他地限制16.]．这种采用可能是参与的结果[17.那18.]．研究还表明，人类迁移大大有助于TB传播并引起MTBC [遗传多样性的增加9.那19.-23.]．

乌干达是世界上22个国家的最高结核病高负担国家[之列24.]土耳其和巴基斯坦之后，世界上第三大难民宿主国家，有超过136万难民[25.-27.]．这些难民来自如刚果民主共和国（金），布隆迪，埃塞俄比亚，厄立特里亚，卢旺达，索马里和苏丹南部的国家。在过去的五年里，已经从刚果民主共和国和苏丹南部大规模难民涌入该国与该国最收容这些难民的西南地区。这些难民的百分之九十二（92％）一起生活在那里的住宿和农用地给予他们[当地社区27.]．在乌干达中部进行的早期研究表明，大多数TB案件都是由于MTBC谱系4次副植物乌干达家族（L4-U）[28.-30.),欧美血统。该亚系的定义是724区差异(RD)和(SNP)分型33 - 36,40和43 spoligotype指纹间隔缺失，以及多个单核苷酸多态性(SNPs)。类似地，2010年Bazira及其同事在乌干达西南部利用spoligotyping进行的一项研究表明，该地区的大多数结核菌株属于乌干达基因型[31.]．然而，在一致的区域中始终寄存高TB发生率的地区涌入的事实要求更加了解该区域MTBC的分子流行病学和遗传变异，以便能够更好地控制TB的这种致病剂。

2.方法

2.1。学习环境

这项研究于2018年5月至2019年4月在乌干达西南部地区进行，该地区有15个行政区，与坦桑尼亚、卢旺达和刚果民主共和国接壤(补充文件)1： 数字1）。该地区受TB / HIV流行病影响，不断登记高TB发病率[32.-34.]．有四名患者招聘中心包括两个区域推荐医院（Kabale和Mbarara区域推荐医院）和该地区难民营的两名卫生中心（Oruchinga和Nakivale Health Center IV）。

2.2。患者招聘和样品收集

记录了患者的临床信息，包括年龄，性别，艾滋病毒状况，以前的结核病历史和经济地位。从≥18岁的患者收集痰样品。通过Genexpert Cepheid试验在样品收集中心诊断肺结核（PTB）的病例，用于在区域推荐医院或痰涂片显微镜下进行分析的样品，用于在保健中心分析的样品。然后将那些诊断为PTB阳性的样品（收集时间不超过72小时），在一个冷箱中到Mbarara科学和技术基因组学和翻译实验室进行加工和分子分析。

2.3。痰样品中MTB的DNA提取和证实

从每个患者样品的基因组DNA用标准化协议处理[35.那36.]．所有的标本通过检测123 bp的IS片段进行筛选，确认为结核分枝杆菌6110.在MTBC成员中常见的基因。

2.4。单核苷酸多态性（SNP）打字

通过RT-PCR进行SNP键入以确定MTB谱系（BIO-RAD CFX96 TOUD™）进行。谱系特异性引物如下：基于先前研究Wampande等人的先前研究，MTB L4-U，用于MTB L4-NU的MTB L4-U，RV2962C的RV012C，以及用于MTB L3的RV0129C。[37.他们伴随的杂交探针（补充档案2： 桌子1）。MTBC谱系是基于熔化温度的差异（ ）。简而言之，测定在20中进行 μ.l含有3.75的反应混合物 μ.L PCR水，1.25 μ.L（0.5 μ.米决赛浓度）的各引物，0.625 μ.升（0.25 μ.米决赛浓度）每种探针，9.5 μ.L 2xLunar®通用基因分型主组合，3 μ.l (5–50 ng) of extracted genomic DNA. The Bio-Rad CFX96 Touch™ Real-时间PCR检测系统被编程用于PCR扩增和熔化曲线阶段。对于三种非单三一单程测定中的每一个，扩增阶段由在95℃下进行10分钟进行的预先PCR阶段，扩增阶段在95℃下变性30秒（用于RV004C或52的50℃℃对于RV0129C或51℃的RV2962C）30秒，并在60℃下延伸30秒，45个循环。熔融曲线分析由95℃的扩增子的变性组成，10秒，以在65℃下以连续采集模式产生单链DNA，在65℃下探针退火温度，以允许捕获荧光，并探测熔化温度范围从40到80°C。在所有测定中，使用KC32969（L4-U），H37RV（L4-NU）和Delicus（L3）基因组DNA（由Makerere分子实验室的礼貌）作为阳性对照，而Nontemplate混合为阴性对照。Bio-Rad CFX96 Touch™软件用于通过分析扩增子熔化温度来确定MTB谱系（ ）(补充文件3.： 数字2）。

2.5。统计分析

将患者人口统计数据转换为Excel表格，然后导出到SPSS version 25 (IBM, Chicago, USA)进行分析。采用卡方检验进行双变量分析，确定分类变量(自变量)与因变量的关系。拟合多项logistic回归模型来评估MTB谱系(因变量)和患者原籍国/种族(主要自变量)之间的关系。在拟合最终模型时，将患者的年龄、性别、经济状况等特征作为协变量。统计意义为 。卡方和Fisher精确检验进行了计算，并且值≤0.05被认为是显着差异的证据。

3.结果

共有283个样品进行基因分型。从乌干达患者获得大部分样品（246,86.9％）。患者的平均年龄为34岁，大多数（73.1％）是男性。在研究时患者患有一百二十九（45.6％）患者未知的血清液，并且在26.9％的同时没有同意进行测试。在分析的283个样品中，59.7％（169）属于血统4乌干达家族（L4-U），14.5％（41）是其他谱系4非乌干达（L4-NU），15.2％（43）谱系3（L3）虽然4.2％（12）对血谱4和谱系3的扩增3.剩余的18（6.4％）菌株基于所用基因分型技术不能与任何谱系匹配（图1）。在来自难民的37个样品中，8.1％属于L4-U系列，而分别为1.1％，3.2％和0.4％，分别为L4-Nu，L3和未分类的菌株。在来自乌干达患者的那些样品中，51.6％属于L4-U系列，分别为13.4％，12％和6％，分别为L4-Nu，L3和未分类的菌株（表1）。

作为结果的血清分析表明，随着年龄，性别，艾滋病毒状况，收入水平，收入水平或TB历史，对每种MTBC血统的患者的比例没有差异。尽管存在乌干达基因型以较高比例的通过Genexpert或显微镜证实的那些，但该比例在统计学上没有统计学意义（ ）（桌子1）。进一步执行多项逻辑回归分析，以确定独立变量“患者国籍”与乌干达西南部循环的MTB谱系之间的关系（表2）。据透露，乌干达患者的患者显着患有L4-U株（或：0.501; 95％CI：0.143-1.758;值：0.281）当其他因素保持恒定时比难民患者。此外，该模型投射了那些乌干达患者不太可能有谱系3的菌株（ ），两个谱系3和4（ ）比相比具有谱系4非乌干达家族（参考类别）非乌干达患者;然而，这不具有统计学显著（ ）。相反，该研究表明，乌干达患者在其他因素保持恒定的情况下比难民患者比难民患者更容易获得1.342倍，但在统计上没有统计学意义（达到统计学意义）（4.5％CI：0.130-13.54）。 ）。

4。讨论

为了深入了解在乌干达西南部(结核病感染广泛分布的地区)引起PTB的MTBC人群结构，我们利用SNP分型分析了来自乌干达和非乌干达诊断为PTB的患者的283份痰样本。之所以选择SNP分型，是因为Wampande和他的同事对它进行了优化，并发现它具有鉴别性[37.]．我们的研究结果揭示了MTBC的异质性，导致该地区的PTB，L4是最主要的谱系，其中L4-U家族和L4-NU分别占所有病例的59.7％和14.5％。L4-U家族占乌干达51.6％，占8.1％的非乌干达患者，而L4-NU分别代表13.4％和1.1％。我们L4是本研究中最普遍的结果的结果是与表明非洲TB流行病的报道主要由L4菌株引起[15.]．L4是系统源性复合物，具有至少十个不同的额外升级，在地理分布方面不同，局部基因型占某些地区中循环菌株的比例较大[15.]．例如，l4 -喀麦隆家族几乎只在西非发现[14.]，而拉丁美洲-地中海(LAM)家庭则主要分布在赞比亚[38.那39.]．同样，L4-U家族在乌干达中更占主导地位，而不是其他地方[4.那28.那31.那40]．这是由我们的研究结果支持这表明，L4-U是其中乌干达患者最常见的，而不是难民，可比记录在乌干达中部[63％28.而在乌干达西南部Mbarara进行的一项早期研究中报告的比例为59.2% [31.]．研究表明，在邻国，L4-U家庭不太常见。例如，坦桑尼亚报告了21.8％[40] L4-U，而肯尼亚报告11％[41.]．因此，我们很容易推测，与其他菌株相比，本地菌株更有可能在特定的地方环境中传播。

在该研究中观察到的另一种谱系以相对高的比例为L3，患病率为15.2％。乌干达患者占该百分比的12％，而非乌干达人占3.2％。这种发现与乌干达中部进行的研究结果相当，发现L3为11％[28.]．在乌干达的邻国，如坦桑尼亚、苏丹、肯尼亚和卢旺达进行的研究也揭示了L3(特别是中亚(CAS)家族)是PTB中广泛涉及的谱系[40]．该MTBC被称为保持稳定，即使在广阔的国际化区域，如旧金山，伦敦，当地人和移民之间交缠的某种程度的预期[42.]．这得到了一些研究的支持，这些研究表明MTBC最好在同域宿主群体中传播[7.那9.那11.那43.]．因此，由于这些观察，因此容易推测不同的MTBC谱系可能适应不同的人口，可能是由于MTBC的长心共存史及其人体宿主的结果[6.那8.那17.那18.[与他人相比，局部菌株更容易在给定的局部设置中传输。我们观察到L4-U在该区域中主要是与该假设一致的。然而，需要进一步的工作来验证这种理论，包括探索MTBC遗传变异变异和人类之间的相互作用的研究。在我们的研究中，6.4％的样品没有放置在筛选的三个谱系中的任何一个，并且可能需要其进一步的表征，以更好地理解它们并将我们的知识添加到乌干达的这一领域的TB的分子流行病学。

5.研究的限制

采用本研究三个独特的SNP标记可能有限制，我们检测到其他MTBC系在这一地区造成PTB的能力。然而，我们的研究使用SNP标记由当地的研究证实，并考虑到共同的谱系在流通东部和中部非洲，那里的患者人群是从。

六，结论

在乌干达西南部，引起PTB的MTBC具有异质性，乌干达血统4家族菌株是最主要的。然而，这种多样性需要进一步确定更多的鉴别技术，如分枝杆菌分散重复序列单位-串联重复序列可变数量(MIRU-VNTR)分型或全基因组测序。

缩写

中科院:	中亚家庭
脱氧核糖核酸：	脱氧核糖核酸
eai：	东非，印度
L3：	结核分枝杆菌谱系3
L4：	结核分枝杆菌沿袭4
L4-nu：	结核分枝杆菌乌干达家族以外的血统4
L4-U：	结核分枝杆菌乌干达家族
我是：	拉丁美洲 - 地中海
MTB：	结核分枝杆菌
MTBC：	结核分枝杆菌复杂的
PTB：	肺结核
RT-PCR：	实时聚合酶链反应
SNP：	单核苷酸多态性
结核病：	结核。

数据可用性

可以访问该研究中使用的信息http://www.re3data.org/。

伦理批准

该报告获得了姆巴拉大学科技机构审查委员会的批准，并获得了乌干达国家科学和技术研究理事会的批准，其参考编号分别为13/08-17和HS2379。

利益冲突

提交人声明他们没有竞争利益。

致谢

我们感谢来自Makerere大学医学院的分子生物学实验室的同事，以及Mbarara科技大学结核病实验室工作人员，为技术援助。

补充材料

补充1。图1：映射的乌干达表示研究区域。

补充2。表1：使用RT-PCR测定法用于鉴定MTB谱系的谱系特异性SNP键入引物和探针。

补充3。图2：RT-PCR（Bio-Rad公司CFX96触摸™）的图示SNP分型的扩增子使用谱系特异性引物和探针解链温度分析。

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