无结核感染的hiv感染者免疫激活和利福平吸收的初步研究:一份简短报告

抽象的

背景．在与人免疫缺陷病毒（HIV）携带的结核病患者中经常观察到利福平吸收症，但不能被CD4 + T细胞计数或HIV病毒载量如患者因素预测。方法．我们试图描述艾滋病毒相关免疫激活，肠道吸收能力和渗透性措施与耐逆转录病毒治疗的6个艾滋病毒感染的肺结核患者的利福平药代动力学参数之间的关系。结果．在8小时观察期间浓度 - 与时间曲线下的中值利福平面积为42.8mg·hr / l（范围：21.2至57.6），中值峰值浓度为10.1mg / l（范围：5.3至12.5）。我们观察到延迟的利福平吸收，时间达到最大浓度超过2小时，在6名参与者中的2例中。血浆浓度增加了SCD14的趋势，响应于细菌易位的单核细胞活化的标志物，与具有快速吸收的参与者（ ）。结论．在接受抗逆转录病毒治疗的hiv感染者中，延迟吸收利福平可能与细菌易位标记物升高有关naïve。这个试验注册在NCT01845298.．

1.背景

包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺和乙胺丁醇在内的标准化抗结核药物方案是全球公共卫生应对结核病流行的基石[1］．抗结核药物的吸收和代谢具有广泛的可变性，血液中抗结核药物浓度低与较差的结核治疗结果有关，包括治疗失败和复发[2-5.］．药代动力学可变性已被鉴定为灭菌效果率的关键介质以及结核治疗期间新药抗突变的出现[6.那7.］．在一线抗结核药物中，利福平吸收不良常见于合并感染HIV的结核病患者，但不能由CD4+ T细胞计数、病毒载量或是否有腹泻等因素预测[8.那9.］．在没有艾滋病毒繁殖的结核病患者的临床研究中，肠道吸收能力下降和增加的肠道渗透性可能是临床吸收的，与抗尿布药物的不良吸收有关，包括利福平[10-12］．

肠道相关的淋巴组织是艾滋病毒感染患者早期和戏剧性淋巴细胞枯竭的部位，在感染的前几周内接近肠道CCR5 + CD4 + T细胞的完全丧失[13］．淋巴细胞消耗伴随着肠上皮阻隔完整性的丧失，最近的关注重点关注脂多糖易位和其他细菌产物在损伤的肠道屏障中的潜在作用[14］．为支持这一模型，系统免疫激活标记物已被证明比CD4+ T细胞计数或HIV病毒载量更好地预测艾滋病毒进展[15］．在慢性HIV感染个体中，单核细胞对脂多糖反应的标志——可溶性CD14 (sCD14)水平是死亡率的独立预测因子[16］．

HIV疾病对患者吸收特定药物和营养素的能力的影响优异，进一步调查，特别需要了解与免疫参数有关的利福平吸收的可变性[17］．我们试图描述艾滋病毒相关免疫激活，肠道吸收能力措施与渗透率之间的关系，以及艾滋病毒感染的个体Naïve的利福平吸收抗逆转录病毒治疗。

2.方法

我们对6名接受抗逆转录病毒治疗naïve并在伙伴关系综合护理实践(Philadelphia, PA)接受艾滋病毒护理的18岁至55岁的艾滋病毒感染者(18岁至55岁)进行了一项非随机、开放标签的利福平药代动力学初步研究。我们排除了CD4+ T细胞计数低于350细胞/uL的患者，理由是应该鼓励这些患者立即开始抗逆转录病毒治疗。我们也排除了肾功能不全、肝转氨酶升高和体重指数低于19公斤/米的患者²或大于35公斤/米²．书面知情同意书是从所有患者获得的，该研究得到了Drexel University医学院的机构审查委员会的批准。

在一夜禁食后，每个参与者口服600毫克利福平。在摄食前以及摄食后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6和8小时采集血液样本。离心后，血清样本存储在−80°C，并使用经过验证的高效液相色谱分析方法，运送到佛罗里达大学传染病药代动力学实验室测量利福平浓度。在药代动力学访问的上午，在给利福平之前，采集血液样本进行免疫分析，在库茨勒实验室进行。

人sCD14 Quantikine免疫分析(DC140, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, USA)使用市售的ELISA试剂盒，根据制造商的协议分别对稀释至50%、0.5%和未稀释的血浆进行检测。sCD14的最终浓度是基于使用在每个酶联免疫吸附测定板上运行的标准曲线所枚举的值。所有检测均进行，每项检测重复进行，并计算sCD14值的平均值。采用流式细胞术检测CD4+和CD8+ T淋巴细胞的免疫激活表面标记物CD38、HLA-DR和CD57。CD8+ T细胞上CD38和HLA-DR的表达是hiv相关免疫激活的一种总结方法[15[CD8 + T细胞上的CD57表达是慢性艾滋病毒感染中免疫衰老的量度，鉴定细胞凋亡途径的细胞[18］．简而言之，对于流式细胞术分析，通过Ficoll-Hypaque（GE Healthcare）密度梯度离心和冷冻介质中含有人血清白蛋白（HSA，Gemini Bio-Products），Hetastarch和10％DMSO的冷冻培养基中，从全血中分离出来的PBMC。在流式细胞术中染色时，将PBMC溶解，洗涤，并在37℃下在R10稀释的苯并酶（RPMI 1640培养基]含有10％FBS，50 IU / ML青霉素和50次 μ.g / ml链霉素和10 mm Hepes [Life Technologies]）。使用伯爵夫人自动细胞计数器（Invitrogen）计算PBMC，并在圆底96孔板中镀到1×106个细胞/孔的浓度。将细胞在20℃下用抗体试剂染色30分钟。用CD3，CD4，CD8A，CD57，CD28，HLA-DR（eBioscience），CD38（BD）和活/死染色试剂盒（Invitrogen）染色PBMC。洗涤染色细胞并重新悬浮在含有1％多聚甲醛的PBS中。所有流式细胞术分析在固定后2小时内进行。在标准化的18色LSRFortessa（BD Biosciences）上分析了PBMC，每次运行至少收集200,000个总事件。抗体捕获珠粒（BD Biosciences）和与面板中使用的所有抗体的单独染色进行数据补偿。Flowjo 10.0.8R1（树星）用于流式细胞术门术分析。用棱镜6（GraphPad Inc.）进行图形和统计分析。

参与者返回第二次访问肠道吸收和渗透性测定的性能。D-木糖测定法测量小肠的吸收能力，用于确定肠上皮中的缺陷是否负责药物或营养素的吸收。在快速过夜后，将25g D-木糖施用在250ml水中，并将乳糖（5g）和甘露醇（1g）的混合物在250ml水中施用。所有尿液都被收集到后续5小时。D-木糖分光光度法测定[19]，在5小时内收集的d -木糖小于4.0 g，表明吸收受损。采用乳果糖/甘露醇法测定肠道通透性。乳果糖和甘露醇都是难以吸收的、不可消化的碳水化合物，比例升高表明肠上皮细胞(乳果糖)之间大分子的肠渗透性增加，或跨细胞吸收(甘露醇)减少，反映吸收表面积的损失[20.］．基于酶促碳水化合物测定法对5小时尿液收集（Genova诊断，Ashville，NC）的等分试样进行乳糖/甘露醇比例测定[21那22］．根据实验室参考范围，乳果糖排泄百分比与甘露醇排泄百分比的比值大于0.11，支持肠道通透性的增加。

统计分析计划的目标是描述免疫激活和肠功能测定测量的可变性，并探讨免疫激活，肠功能和利福平药代动力学参数之间的关系。用中值和范围总结了连续措施，并在散点图中以图形方式检查免疫激活参数的分布。进行非组件分析来描述利福平峰浓度（），峰值浓度的时间 那在采样期间，利福平浓度浓度 - 与时曲线（)。由于参与者数量有限，我们没有进行室间药动学建模或调整分析。所有统计分析在R版本3.1.1中进行，使用PK包进行非区室分析[23］．

结果

我们注册了6名参与者，完成所有学习程序（5名男子和1名女子）。中位年龄为27岁（范围：22-33岁），所有参与者报告了非西班牙裔和非裔美国人的种族和种族。在研究访问时，所有参与者都是抗逆转录病毒治疗，中值CD4 + T细胞计数为675（范围：367-1573）。有一个有未定例的艾滋病毒病毒载量的参与者，与她的临床身份一致，作为长期的非投手。

免疫激活和微生物易位测定结果显示在表中1．流式细胞术在6名6例患者中进行了足够的外周血单核细胞进行分析，如图所示1(CD4+ T细胞)和图2(CD8 + T细胞)。HLA-DR在CD4+和CD8+ T细胞上的表达均大于CD38。令人惊讶的是，我们没有观察到任何CD8+ T细胞是CD38+和HLA-DR+双重阳性。流式细胞术表面标记物总结见表1．

根据5小时尿液收集期4.0 g d -木糖阈值，只有一名受试者(受试者104)符合肠道吸收受损标准，尿液d -木糖排泄总量为3.3 g(正常> 4.0 g)。一名受试者(受试者102)的5小时尿乳果糖/甘露醇比值升高，乳果糖/甘露醇比值为0.11，表明肠道通透性增加(正常< 0.11)。

图中显示了利福平血清浓度与时间的关系3.．总的来说，6名参与者中有4人有一个价值大于8 mg / L的目标，中位数10.1 mg / L（范围：5.3至12.5）。中位数为43.6 mg·hr/L(范围:23.5 - 57.4)。我们观察到一个吸收延迟，定义为超过2小时，6例患者中有2例。中位数和在这2名患者中，分别为6.5mg / L和24.7mg·HR / L，而4例患者中的12.0mg / L和44.9 mg·HR / L在没有延迟吸收的情况下。与延迟的利福平吸收的参与者都不表现出D-木糖试验的低肠吸收能力或通过乳糖/甘露醇比例增加肠道渗透性。在对免疫激活和利福平吸收的标志物之间关系的探索性分析中，观察到SCD14值升高，其中2名参与者在延迟吸收（中位数：1925ng / ml）中，与4个参与者没有延迟吸收（中位数）相比（中位数：1252 ng / ml， ）。

4。讨论

在这个试点研究利福平的药物动力学进行6感染艾滋病毒(tuberculosis-uninfected)个人天真的抗逆转录病毒治疗,我们观察到的趋势上升标记细菌易位的患者2 6延迟利福平吸收,而4 6例没有延迟吸收。对这一发现的一种解释是，sCD14提供了肠细胞从营养或吸收功能向炎症功能转变的血液生物标志物，这种潜在的关系应该在更大规模的艾滋病毒/结核病患者研究中进行研究。有趣的是，吸收延迟最大的患者是被归类为长期无进展者的参与者，尽管自HIV感染确诊以来已有10年的时间间隔，但HIV病毒载量和CD4+ T细胞计数仍保持在不可检测的水平。在进行治疗性药物监测时，利福平的吸收延迟是建议在给药后2小时和6小时采集血液样本的动机之一[1］．我们没有观察到有和没有延迟利福平吸收的参与者在肠道吸收能力或渗透性方面的差异。

这项初步研究有几个重要的局限性。有限的样本量排除了使用非线性混合效应模型进行室间药动学分析，因此我们无法评估作为吸收系数的协变量影响的免疫激活的个体措施。在治疗的前几周，利福平经历了自我诱导，一旦达到稳定的药代动力学条件，就会导致药物暴露的下降，因此观察到的免疫激活和利福平暴露之间的关系可能会在治疗过程中改变。此外，还排除了体重指数低于19公斤/米的个体²，以及活动性结核病患者，可能会限制对患有晚期疾病和更严重吸收不良的艾滋病毒/结核病患者人群的推广，以及使用统一的600mg剂量，而不是基于体重的剂量[1］．该研究的优点包括具有详细免疫和药代动力学评估的肠功能性测定的新颖性能，提供了对这些测定的分布的描述，这些测定在吸收相期间支持未来研究的设计和强化药代动力学采样设计。

总之，我们在艾滋病毒感染的个体Naïve中的免疫激活，肠损伤和细菌易位对抗逆转录病毒治疗方面观察到显着变异性。细菌易位标志物与延迟利福平吸收的潜在关系在艾滋病毒/结核病患者的前瞻性研究中进行进一步评价。

缩写

艾滋病病毒：	人类免疫缺陷病毒
：	最大浓度
AUC：	曲线下面积
：	时间达到峰值浓度。

数据访问

在当前研究期间分析的数据集可在合理的请求后从相应的作者获得。

伦理批准

这项研究得到了德雷塞尔大学医学院的机构审查委员会的批准。

同意

所有参与者均提供书面知情同意。

披露

资助者在研究的设计，收集和分析的设计中没有作用，或写作稿件。这项工作的一部分以抽象形式呈现在ASM Microbe 2016，波士顿，MA。

利益冲突

作者声明他们没有利益冲突。

作者的贡献

Christopher Vinnard和Michele A. Kutzler负责设计的设计。Sheryl Varghese，Joella Adams和Christopher Vinnard负责参与者的入学人员。Isabel Manley，Brittney Scott，Mariana Bernui，Isaac Zentner和Michele A. Kutzler负责标本加工和测定程序，以及数据收集和分析。Christopher Vinnard写了稿件。所有作者阅读并认可的终稿。

致谢

这项工作得到了Janssen LLC的调查员启动的奖励，以及美国国家过敏和传染病研究所（K23AI102639至Christopher Vinnard博士）的职业发展奖。

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