文摘

人类健康,结核分枝杆菌(MTB)是最致命的敌人几十年以来由于其耐药菌株。结核分枝杆菌潜伏结核感染的阶段,期间消耗硝酸作为替代机制缺乏呼吸的氧气,从而增加其生存和毒性。NarL硝酸盐或亚硝酸盐反应转录调控蛋白的双组分信号转导系统,调节硝酸还原酶、甲酸脱氢酶MTB适应厌氧条件。由传感器激酶磷酸化(NarX)背后的主要机制是激活NarL虽然很多响应监管机构被小分子激活phospho-donors没有传感器激酶。使用在网上方法,香豆酮的分子对接和naphthofuran衍生品和香豆酮衍生品进行的动态研究。是观察到的化合物乙5-bromo-3-ethoxycarbonylamino-1-benzofuran-2-carboxylate可以稳定在10 ns仿真的活性部位。在这里我们建议衍生品香豆酮的一部分会导致公开小说发展的药物。

1。介绍

呋喃有多种药理和生物活动,如公开(1,抗炎2),和抗菌3活动引起了合成化学家的注意。抗结核的活动观察(4在在体外分析使用由微量滴定板刃天青试验方法(瑞玛)香豆酮衍生品。代替香豆酮发现他们的应用程序在不同领域如荧光传感器(5)、抗氧化剂、光明的代理和各种药物和农业。

在全球主要传染病,结核分枝杆菌艾滋病毒/艾滋病后(MTB)是第二。140万人死亡,870万人在2011年从结核病患病。在低收入和中等收入国家超过95%的结核死亡发生,它是死亡的三大原因之一从15到44岁的女性6]。营养的可用性结核分枝杆菌在主机和它们的新陈代谢过程中起着重要作用在厌氧条件分枝杆菌发病机理和持久性。由于耐多药结核病(mdr - tb),细菌可以对异烟肼和利福平,两个最强大的一线抗结核药物或标准。分枝杆菌可以由双组分信号转导系统适应宿主环境(TCS),在那里他们,回应,并适应环境的变化通过调制的子集的表达基因响应特定的细胞外信号。

有11个完整的结核分枝杆菌的tcs (7]。一个典型的双组分系统由一个组氨酸蛋白激酶(香港)和监管机构(RR)的响应。RRs守恒的接收机组成的有一个模块化的体系结构域和一个变量效应域组成的DNA结合元素(8]。NarX-NarL和NarQ-NarP双组分系统参与厌氧呼吸的调节基因表达,以应对硝酸盐和亚硝酸盐9]。NarX硝酸膜结合传感器(10)和NarL是监管机构的胞质反应组成的氨基端接收域和c端效应域。NarL参与的合成硝酸还原酶(由narGHJI编码)和甲酸dehydrogenase-N fdnGHI操纵子(编码)的硝酸盐和硝酸这些酶参与呼吸11]。NarQ传感器激酶可以独立意义的存在硝酸盐和转让NarL的信号。此外,小分子phosphor-donors乙酰磷酸等也可以使磷酸化NarL在体外(12]。NarL暴露的phosphorylation-dependent激活c端域绑定到DNA转录激活或抑制(13]。在厌氧生长、硝酸盐行为通过NarL基因表达激活和抑制厌氧呼吸(9]。为narL蛋白质编码的基因narL调节固定相文化MTB[末四倍14]。有35%的总氨基酸之间的身份大肠杆菌MTB NarL和其积极的网站完全重叠和活性位点残基的位置是几乎相同的30.]。根据这个序列同源性,NarL一直预测参与结核分枝杆菌的厌氧氮代谢的调节(Tuberculist网站:http://genolist.pasteur.fr/TubercuList/),被认为是潜在的药物目标(http://www.uniprot.org/uniprot/O53856)。阻止活性部位将抑制结核分枝杆菌NarL和负面影响的磷酸化活动适应。

2。材料和方法

Protein-ligand乙基naphtho的交互(2,1 b) furan-2-carbothioate (C1), 2-naphtho (2, 1 b) furan-2-yl-5-phenyl-1, 3,则对(C2),乙8-nitronaphtho (2, 1 b) furan-2-carboxylate (C3), 1 - (2-chlorophenyl) 1 - (8-nitronaphtho [2, 1 b] furan-2-yl)尿素(C4), (4-nitrophenyl) 1 - (8-nitronaphtho [2, 1 b] furan-2-yl)尿素(C5),乙3-amino-5-bromo-1-benzofuran-2-carboxylate (C6),乙5-bromo-3-ethoxycarbonyl amino-1-benzofuran-2-carboxylate (C7)和乙naphtho (2, 1 b) furan-2-carboxylate目标NarL (C8)和蛋白质结核分枝杆菌进行了了解其抗结核的活动。

2.1。香豆酮抗结核的活动和Naphthofuran衍生品

分子对接的分析,新合成呋喃衍生物被认为是分析抗结核的活动。在这些合成呋喃衍生物,两个化合物结构主要解决了结晶学,C6 (15]和C7 [16]。C6、C7的三维原子坐标是准备使用WinGX [17]。因为香豆酮的构象和naphthofuran衍生品从单晶x射线衍射确定,看看他们绑定模式是值得为这些实验确定构象来获得有意义的见解。这些研究也为药物设计提供输入,揭示蛋白质构象活性位点的变异(18]。这些化合物的坐标以及其他衍生品进一步对接研究推断。

2.2。NarL结构

NarL蛋白(在不对称单位)是一个homotetramer包含4相同的子单元自己独立活动网站每个子单元,B, C和D,分别。这个结构代表了n端信号接收器域包含4相同的链。晶体结构的坐标1.9的信号接收域的假定的响应监管机构NarL结核分枝杆菌(PDB ID: 3 eul)得到的蛋白质数据银行。尽管蛋白质homotetramer,决定晶体生物活性单体的形式被认为是对接动力学仿真研究。图1显示了活性部位残留Asp15、Asp16 Arg63, Ser89, Lys111和磷酸化的asp - 61 (30.]。快速地等人指出,从本地页面分析和洗脱图尺寸排阻色谱法和凝胶过滤色谱法,NarL-N单体溶液中,在本机凝胶迁移作为一个定义良好的乐队。因此,生物活性单元已经考虑对接和分子动力学。


图1
活性位点残基的NarL表示在球棍。
2.3。分子对接处理

拓扑文件和其他力场参数为配体生成使用PRODRG程序(19]。Kollman指控被添加到蛋白质原子和Gasteiger部分指控被分配使用程序AutoDock配体原子。所有的配体被转换为。0.8使用OpenBabel pdbqt格式工具建在PyRx对接工具。灵活的配体都是使用AUTOTORS定义扭力。配体的对接网站3日eul被定义在活性部位网格框的大小 ,间距0.375,和网格中心−9.584,3.945和15.45。autogrid模块计算静电映射所有原子和原子交互地图类型的配体分子。拉马克学说的遗传算法(LGA)被选中的人口规模150人一代又一代的最大数量和能源评估27000年和250万年,分别。缺省参数如精英主义(1)突变(0.02),和交叉率(0.8)被认为是。配体绑定(估计自由能的 ),抑制常数( 计算配体)。AutoDock运行的结果进行了分析使用分子图形学实验室(球型)工具(20.和最好的构象至少使用Ligplot结合能互动进行了分析+(21]。PyMOL用于对接构象表示(22]。

为了克服任何意外,积极控制,如乙酰磷酸[氨基甲酰磷酸,dihydroxyacetone-P, phosphoramidate, monophosphoimidazole对接过程中使用。自然phospho-donors交互配置文件包括在表中1。

表1
小分子phospho-donors能源的状况。
2.4。分子动力学

进行了分子动力学模拟研究的实时交互和稳定性最高得分化合物在生物环境。研究也给出了详细描述溶剂分子相互作用的环境,这是非常接近现实。分子动力学模拟进行了10 ns使用4.5.5 Gromacs版本。

2.5。Premolecular动态处理

系统包含蛋白质,水分子和适当数量的钠离子都封装在一个周期性的盒子。氢和费用增加和蛋白质定义使用琥珀- 99某人力场参数。

使用UCSF嵌合体可视化工具(23),蛋白质被显式地添加氢和准备排练AM1-BCC部分费用。蛋白质被定义使用琥珀- 99某人力场参数(24]。配体是使用广义定义琥珀力场(赌博)参数25)和AM1-BCC部分指控被添加使用前厅[26]其次是转换GROMACS兼容使用ACPYPE[的拓扑27]。复杂的是准备生产运行使用妄想。

2.6。分子动力学模拟

MD模拟都是使用4.5.5 GROMACS版本编译执行单精确模式(28,29日]。创建一个模拟细胞在一个立方周期10箱的最小距离蛋白质和盒子之间的墙壁。蛋白质与TIP3P沐浴水分子和四钠离子中和系统(图2)。


图2
系统通过添加四个钠离子的中和。球棍模型代表了水分子和模型代表钠离子(蓝色)和蛋白质显示为带与二级结构色素附在盒子里面。

能量最小化是由使用5000步的最陡下降加上共轭梯度法在每一个100步或者直到最大的力小于100 kJ摩尔−1纳米−1。静电相互作用,特别是远程计算使用Particle-Mesh埃瓦尔德(中外)方法。截止距离是1纳米。色散相互作用,短程排斥力和吸引力,正如Lennard-Jones截止1海里。距离算法被用来限制债券允许1 fs的时间步。在每一个10步,邻居搜索。一个Parrinello-Rahman恒压器压力1酒吧使用的耦合常数Tau_P = 0.5 ps和压缩系数4.5 e-5(酒吧−1)。水、蛋白质、离子和配体分子分别耦合到热浴在300 K,使用v-rescale耦合常数Tau_T = 0.1 ps。最初准备竞选500 ps进行让周围水分子的随机化蛋白质。位置约束使用mdrun程序进行了分子动力学。isobaric-isothermal合奏仿真执行10 ns。结果分析和Gromacs VMD工具。

3所示。结果和讨论

3.1。香豆酮的分子对接研究,Naphthofuran衍生品

香豆酮的化学结构和naphthofuran衍生品考虑对接图中列出3。


图3
香豆酮用于对接和naphthofuran衍生品结构研究。
3.2。香豆酮和Naphthofuran衍生品研究抗结核的活动

的在网上交互的phospho-donors NarL进行观察,所有化合物都绑定到活跃的网站,尽管盲目进行对接。所有自然phospho-donors(乙酰磷酸,[氨基甲酰磷酸、phosphoramidate monophosphoimidazole)结合活性部位与结合能从−3.32−3.93千卡/摩尔和抑制常数从1.31毫米到3.67毫米(表1)。

至少结合能和最稳定的构象基于聚类分析了对接分析。对接互动细节表表示2。8个化合物停靠,C1显示至少结合能−6.99千卡/摩尔和C3最高结合能−3.76千卡每摩尔。从估计的抑制常数可以看出微摩尔的所有化合物的浓度足以抑制蛋白质活性50% (IC50)。7.54毫米的数量就越少需要所需的集成电路50效果相比,C7需要940毫米。从Ligplot+图(图4),可以看出化合物C1, C3, C5、C8疏水作用。一个h⋯O氢键在C2、C4 C6, C7 NarL的活性部位。配体的氮或氮的活性位点残基参与债券形成。化合物C6、C7与磷酸化的残留Asp16形成氢键,溴原子,和羧基显示疏水作用的活性部位。C2和C4氢保税Lys111和Arg63,分别。类似h⋯O分子间氢键观察C6、C7的水晶包装15,16]。

表2
分子对接的交互细节香豆酮和naphthofuran衍生品对NarL蛋白质。

图4
使用Ligplot 2 d表示+所有化合物的相互作用在NarL的活性部位。氢键是由虚线表示。

在分子间N1-H1A C7⋯O2(对称代码: 与邦德)是观察到的距离为2.977(4),171(3)°角。然而,对接的结果与分子内氢键N1-H1B更相关⋯O3与邦德距离为2.835(4),123(3)°角。C6、C7的氢键长度和角度在图表示5。羟基似乎也具有较强的分子内氢键特性观察晶体结构的配体。虽然结合能,抑制常数作为重要指标分子对接研究,他们不能提供完整的交互特征在所有的情况下,因此,使用动态仿真变得不可避免。

(一)
(一)
(b)
(b)
图5
- h⋯分子间氢键阿C6 (a)和C7 (b)与晶体相比,包装。

图6单独显示化合物6的分子对接互动进一步外推到动力学仿真。图7描述了所有的配体之间的相互作用的活性部位NarL。这表明,这些团体负责稳定活性位点的相互作用和阻塞NarL的磷酸化。


图6
交互的C6 NarL的活性部位。

图7
相互作用的配体在NarL的活性部位。
3.3。分子动力学仿真分析

结晶学解决(C7)结构进一步外推到动力学研究。分子动力学模拟表明氢键的大部分地区10 ns(图运行8)。尽管复合固定在活动网站(Pocket-1),搬到另一个(pocket-2)和与Leu47, Met67 Gln71, Ala75, Ser78 Tyr79(图9)。有一个循环区域和局部结构差异 螺旋的NarL地区从64年到77年结核分枝杆菌和大肠杆菌。残留Met67有7.7的最大位移CαNarL相比的地位结核分枝杆菌和大肠杆菌。甚至从结晶学目前尚不清楚这个循环区域差异是由于晶格或它反映了任何生物相关循环构象(30.]。这场运动可能是由于减少了阿拉巴马州44位阻,遇到了67年,阿拉巴马州74 - 75和协助配体在配位体的疏水口袋,其余部分在极地地区的蛋白质。图10代表C7的交互作用的活性部位NarL后分子动态模拟。


图8
距离情节C7的活性部位残留asp通过10 ns - 61。

图9
运动的配体C7交互pocket-1(橙色)pocket-2(蓝色)。

图10
交互的活性部位的C7 NarL后分子动态模拟。

4所示。结论

对接研究,它可以注意到C6、C7的结晶学确定结构拥有一个溴原子的香豆酮环。它表明,疏水作用的活性部位和与天冬氨酸16硝基形成氢键,从而稳定复杂。从分子动力学模拟研究化合物,它可以建议所有香豆酮和naphthofuran衍生品有亲和力NarL活性部位的交互并有潜力作为铅分子。从分子动力学研究,观察到局部结构差异的循环和α-helix地区从64年到77年残留对Met67运动灵活的配体。这场运动可能是由于减少了阿拉巴马州44位阻,遇到了67年,阿拉巴马州74 - 75和协助配体在配位体的疏水口袋,其余部分在极地地区的蛋白质。同样,没有氢键和配体之间的NarL蛋白质。另一个结晶学确定结构C8显示只在对接研究疏水作用。

从对接naphthofuran和香豆酮衍生品的分析,可以得出结论,在大多数与Asp16硝基形成氢键的相互作用,溴原子,和羧酸盐集团显示出疏水作用的活性部位。结合能和抑制常数也最小,表明这些化合物对NarL蛋白有很高的亲和力。这表明,这些团体负责稳定活性位点的相互作用,从而阻止NarL的磷酸化。因此,这些化合物可以作为一种潜在的抗结核的主要分子。

利益冲突

作者宣称没有利益冲突有关的出版。

确认

作者感谢教授v . p . Vaidya化学系,Kuvempu大学Shankaraghatta,印度,提供分子对接研究呋喃衍生物和罗山Makam博士,生物技术、PES理工学院,班加罗尔,印度为他有用的交互动态研究。