胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷类似物的设计GYDF4.Y2.Ba结核分枝杆菌GYDF4.Y2.Ba

摘要GYDF4.Y2.Ba

我们在这里设计了新的纳摩尔抗结核药物，抗结核药物的抑制剂GYDF4.Y2.Ba结核分枝杆菌GYDF4.Y2.Ba胸苷激酶(TMPK)GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba），通过基于结构的分子设计。3D TMPK模型GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba-利用TMPK的晶体结构制备了抑制剂配合物GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba与天然底物脱氧胸苷单磷酸（dTMP）（1GSI）共结晶，用于15个胸苷类似物（TMD）的训练集以已知活性制备相互作用的QSAR模型，建立络合自由能与生物活性之间的相关性。随后，通过3D QSAR药效团生成对模型的可预测性进行了验证。从模型中获得的结构信息用于设计新的亚硝酸钠nomolar胸腺嘧啶核苷类似物。从分子模拟研究，络合自由能(GYDF4.Y2.Ba)及GYDF4.Y2.Ba值解释了94%的TMPKGYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba抑制 （GYDF4.Y2.Ba)通过改变计算出的GYDF4.Y2.Ba和药效（PH4）模型92％（GYDF4.Y2.Ba）。从活性位点残基的贡献分析在在核糖的5'-位嘧啶环和各种基团的5-位的取代建议。最好抑制剂达到的预测GYDF4.Y2.Ba0.155 结合使用分子模型和PH4药效团的计算方法有助于靶向药物设计，为新型抗结核药物的合成和活性预测提供有价值的信息。GYDF4.Y2.Ba

1.导言GYDF4.Y2.Ba

世卫组织报告的大量甲型H1N1流感死亡个案发生在患有慢性呼吸系统疾病的病人身上，由此可见流感对活动性肺结核病人可能产生的影响[GYDF4.Y2.Ba1.GYDF4.Y2.Ba]．结核病杀死了200多万人[GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba并感染全世界约20亿人[GYDF4.Y2.Ba3.GYDF4.Y2.Ba]每年有超过900万例[GYDF4.Y2.Ba4.GYDF4.Y2.Ba]．据世卫组织称，在第二个千年十年(2020年)，将有超过10亿人新感染结核病，3600万人将死于结核病[GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba6.GYDF4.Y2.Ba使其成为导致死亡的主要传染病。在这方面，到2015年结核病死亡率较1990年水平减半的千年发展目标是有问题的[GYDF4.Y2.Ba7.GYDF4.Y2.Ba]第一，与1990年相比，死亡率略有下降，但在非洲没有[GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba]其次，耐多药和广泛耐药结核菌株的增加使目前已有40年历史的长期DOTS药物不合格：异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇[GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba]．因此，新的低成本和短期抗TB疗法的需求是不管当前在临床前或早期临床阶段的那些，因为大多数大多数都是对具有非阻染性抗性易感性的现有抗微生物化合物的改进。GYDF4.Y2.Ba

新药物的发展完全归属于履行特定的简介：效力和快速行动短期点对MDR-TB的短期点效率比现有的治疗在抗逆逆转录血管中具有易于使用的抗逆转录病毒的治疗方法作为活动形式[GYDF4.Y2.Ba8.GYDF4.Y2.Ba]．另一种要求是对与休眠期有关的疗效增加，并预防“不可渗透和背部复苏进入生长阶段”[GYDF4.Y2.Ba3.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

在即将可获得的适当的新靶标中，关注催化关键过程(如NAD供应)的酶[GYDF4.Y2.Ba9GYDF4.Y2.Ba]或ATP依赖的磷酸化[GYDF4.Y2.Ba10.GYDF4.Y2.Ba]．TMPKGYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba是合成dTTP的最后一种特异酶，催化dTMP转化为dTDP，使用ATP作为磷酰供体，使其抑制剂成为潜在的抗结核药物，靶向DNA复制[GYDF4.Y2.Ba11.GYDF4.Y2.Ba]．到目前为止，报道的最有效的胸苷激酶抑制剂是在低微摩尔范围内(3.5-5GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.Ba米)的活动。TMPK缺乏引线GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba抑制剂和酶的X射线晶体结构的可用性结合到衬底打开栅极以新的抗结核剂的设计与该脚手架[GYDF4.Y2.Ba12.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

TMPK的高分辨率三维结构GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba-dTMP复合物(GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM） 已在1.6版本发布 Å-1GSI[GYDF4.Y2.Ba13.GYDF4.Y2.Ba]及1.9 Å-1G3U [GYDF4.Y2.Ba14.GYDF4.Y2.Ba].图中第一个分辨率最高的显示为2D交互视图GYDF4.Y2.Ba1.GYDF4.Y2.Ba描绘胸腺嘧啶的嘧啶环的相互作用：与Phe70堆叠（GYDF4.Y2.Ba)和阳离子-GYDF4.Y2.Ba用Arg95(GYDF4.Y2.Ba Å). 与Arg74和Asn100的氢键保持嘧啶环的方向，而核糖环的羟基与Asp9结合。Arg95的取向也由它的HB与一个磷酸氧原子保持；该极性基团与Tyr39和Mg相互作用GYDF4.Y2.Ba^{2+GYDF4.Y2.Ba}离子。GYDF4.Y2.Ba

在这些相互作用的基础上，dTMP类似物被报道通过去除一磷酸对应物和嘧啶环上的Br取代来保持底物的效力[GYDF4.Y2.Ba15.GYDF4.Y2.Ba由于dTMP类似物的极性降低了它们的ADME谱线，因为它们不能跨细胞膜[GYDF4.Y2.Ba16.GYDF4.Y2.Ba].重点放在核苷上，而不是放在羟基取代的核苷酸上GYDF4.Y2.Ba对于dTMP，活性下降了六倍，但嘧啶环5位的简单溴取代保持了初始效力（TMD4，GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM）[GYDF4.Y2.Ba15.GYDF4.Y2.Ba]．这个位置是不适合于其他卤素F-212 μGYDF4.Y2.BaM、 Cl-10 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM、 I-33 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.Ba对羟基OH-270也没有GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM、 CHGYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}哦- 820GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM nor烷基链CHGYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}中国GYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}-1140年GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.Ba在基团大于CH的情况下，M作为斥力是预期的GYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}  [GYDF4.Y2.Ba15.GYDF4.Y2.Ba]．没有苯环已经尝试在那个位置为这个核苷，但在dTMP的情况下，苯(CGYDF4.Y2.Ba_{6.GYDF4.Y2.Ba}HGYDF4.Y2.Ba_{5.GYDF4.Y2.Ba}中国GYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}-28 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM）[GYDF4.Y2.Ba16.GYDF4.Y2.Ba]．在嘧啶环的5-位上的稳定特征是不是纯粹的疏水性的，和的取向部分具有被考虑。为此，我们在这里探讨，设计不同的小团体类似物到位上面引用组轴承两方面的要求的可能性。GYDF4.Y2.Ba

核糖环上的2 '位置已被羟基和卤素所占据，其效能也没有明显提高。3 '中的各种替换并没有提高效力。不同的是，5′位是继嘧啶环上的第二个富集位。在OH: N旁边很少有替代品GYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}，NHCOCHGYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}，NH.GYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}，卤素通常保持dTMP类似物中涉及磷酸基团的相互作用。最近尝试用苯基取代核糖环[GYDF4.Y2.Ba17.GYDF4.Y2.Ba]没有真正的改善，随后是双环糖衍生物[GYDF4.Y2.Ba18.GYDF4.Y2.Ba]达到3.5. μGYDF4.Y2.BaM，然后是一个以非环核苷类似物为末端的间隔基，探索萘基和Tyr39之间的边对面相互作用，结果为0.27 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM效价[GYDF4.Y2.Ba19.GYDF4.Y2.Ba]．TMPK抑制剂双环胸腺嘧啶类似物的计算机辅助组合设计GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba作者:Frecer等[GYDF4.Y2.Ba20.GYDF4.Y2.Ba]确定了具有良好ADME曲线的亚微摩尔浓度范围抑制剂。GYDF4.Y2.Ba

在本文报道的研究中，考虑到训练集(TS)的结构，胸苷激酶支架在苯环的5号位置、核糖环上的2 '、3 '和最后在5 ' -位置被替换为小尺寸基团。与TMPK相互作用的QSAR模型GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba从上述1GSI.pdb 3D结构开始，从15个TMD的TS构建，以计算络合自由能，同时考虑相互作用能、溶剂化自由能、泊松-玻尔兹曼方案的数值解，最后是抑制剂结合时的构象熵变化。该模型的可预测性进一步与用于筛选亚纳摩尔范围类似物的胸苷类似物（TMAs）文库的PH4 3D QSAR模型交叉。从络合QSAR方程中确定的命中率最终达到皮摩尔浓度范围内的预测活性。GYDF4.Y2.Ba

2.材料和方法GYDF4.Y2.Ba

2.1.培训和验证集GYDF4.Y2.Ba

TMPK胸腺嘧啶核苷类似物抑制剂的训练和验证集GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba本研究使用的文献均来自文献[GYDF4.Y2.Ba15.GYDF4.Y2.Ba–GYDF4.Y2.Ba17.GYDF4.Y2.Ba]这些衍生物的抑制效力涵盖了足够广泛的活性范围，以便建立可靠的QSAR模型(GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM）。GYDF4.Y2.Ba

2.2. 模型制作GYDF4.Y2.Ba

酶-抑制剂复合物的分子模型(GYDF4.Y2.Ba），免费TMPKGYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba(GYDF4.Y2.Ba)和抑制剂(GYDF4.Y2.Ba)由含有脱氧胸苷单磷酸TMPK的参考配合物的高分辨率晶体结构制备GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba : dTMP[GYDF4.Y2.Ba13.GYDF4.Y2.Ba]（b）蛋白质数据库[GYDF4.Y2.Ba21.GYDF4.Y2.Ba]输入代码1GSI，分辨率1.6 Å)，使用Insight-II分子建模程序[GYDF4.Y2.Ba22.GYDF4.Y2.Ba].委员会的结构GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba配合物的pH值为7，中性N端和C端残基以及所有可质子化和可电离残基带电。模型中未包含结晶水分子。通过以下方法将抑制剂构建到参考结构复合体中：GYDF4.Y2.Ba原位GYDF4.Y2.Ba取代dTMP部分（支架）的衍生R-基团。对取代功能基团的所有可旋转键进行彻底的构象搜索，并小心地逐步最小化修饰抑制剂和TMPK的能量GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba位于抑制剂附近的活性中心残留物（5 Å距离）来确定改性抑制剂的低能结合构象GYDF4.Y2.Ba复合物，然后小心地将整个复杂的最小化精制而成。此过程已成功地用于病毒和原生动物蛋白酶抑制剂复合物的模型构建和肽模拟物和羟萘抑制剂的设计[GYDF4.Y2.Ba23.GYDF4.Y2.Ba–GYDF4.Y2.Ba27.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

２．３．分子力学GYDF4.Y2.Ba

抑制剂TMPK模型的模拟GYDF4.Y2.Bamt，GYDF4.Y2.Ba利用II类一致力场CFF91的原子参数和电荷参数，以全原子表示进行了配合物的研究[GYDF4.Y2.Ba28.GYDF4.Y2.Ba]为了考虑蛋白质的介电屏蔽效应，所有分子力学（MM）计算均采用介电常数为4GYDF4.Y2.Ba复合物，免费GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba在所有的几何优化中，使用了足够数量的最速下降和共轭梯度迭代循环，并将收敛准则用于平均梯度设置为0.01 千卡GYDF4.Y2.Ba摩尔GYDF4.Y2.Ba^{−1.GYDF4.Y2.Ba} ÅGYDF4.Y2.Ba^{−1.GYDF4.Y2.Ba}．GYDF4.Y2.Ba

２.４.构象搜索GYDF4.Y2.Ba

免费抑制剂构象从他们的束缚构象衍生GYDF4.Y2.Ba通过逐渐松弛到最接近的局部能量最小值，然后使用铈对所有可旋转键（环中的键除外）的低能构象进行蒙特卡罗搜索（上限为50000次迭代）GYDF4.Y2.Ba^{2.GYDF4.Y2.Ba}分子模拟软件包[GYDF4.Y2.Ba29.GYDF4.Y2.Ba]．通过在5000 K下随机改变最后一个可接受的构象的扭转角±15°，然后进行能量最小化，每种抑制剂产生了200种独特的构象。在最小化过程中，有一个介电常数GYDF4.Y2.Ba用以近似解释水合作用对生成的构象的介电屏蔽效应。选择总能量最低的构象，并在GYDF4.Y2.Ba．GYDF4.Y2.Ba

2.5.溶剂化吉布斯自由能GYDF4.Y2.Ba

溶剂化吉布斯自由能的静电分量，通过非线性泊松-玻尔兹曼方程的解，也考虑了离子强度的影响[GYDF4.Y2.Ba30.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba31.GYDF4.Y2.Ba]由Discovery Studio中的DelPhi模块计算[GYDF4.Y2.Ba32.GYDF4.Y2.Ba]程序将溶剂视为高介电常数的连续介质GYDF4.Y2.Ba并且溶质作为具有低电介质的腔GYDF4.Y2.Ba边界与溶质的分子表面相连，将溶质的原子电荷包围起来。程序采用有限差分法数值求解了分子静电势和溶质周围的反应场。DelPhi计算在一个(GYDF4.Y2.Ba）立方格格栅GYDF4.Y2.Ba复合物和游离物GYDF4.Y2.Ba和(GYDF4.Y2.Ba）网格的免费GYDF4.Y2.Ba完全库仑边界条件。在这两种情况下，随后的两个聚焦步骤导致了大约0.3的相似最终分辨率 溶质填充网格70%时，每网格单位为Å。生理离子强度为0.145 摩尔GYDF4.Y2.BadmGYDF4.Y2.Ba^{−3.GYDF4.Y2.Ba}在CFF91参数集定义的原子的部分电荷和半径[GYDF4.Y2.Ba28.GYDF4.Y2.Ba] 和A.probe sphere radius of 1.4 Å were used. The electrostatic component of the solvation Gibbs free energy was calculated as the reaction field energy [30.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba33.GYDF4.Y2.Ba–GYDF4.Y2.Ba35.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

2.6。熵术语GYDF4.Y2.Ba

缓蚀剂与基体结合时的振动熵变GYDF4.Y2.Ba使用Fischer等人的简化方法，通过对抑制剂振动的正态模式分析计算[GYDF4.Y2.Ba36.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba37.GYDF4.Y2.Ba].在这种方法中，对结合在“冷冻”受体活性部位的抑制剂进行振动分析(GYDF4.Y2.Ba）和不含抑制剂的低能量构象异构体被计算用于使用查询[充分最小结构GYDF4.Y2.Ba22.GYDF4.Y2.Ba] 和GYDF4.Y2.Ba先前已经证明，对于较小且相对刚性的配体，该方法给出了完全柔性系统的振动熵变的良好近似，即，包括蛋白质受体的自由度[GYDF4.Y2.Ba36.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba37.GYDF4.Y2.Ba]．这GYDF4.Y2.Ba术语占不含抑制剂的振动运动和表示的分子的构象柔性的指标。即，低频振动，其对应于多个具有较大振幅，即，构象变化原子的集体运动，最有助于该术语。相对值GYDF4.Y2.Ba对于参比物，使用抑制剂部分补偿其受限的灵活性GYDF4.Y2.Ba．虽然焓对结合亲和力的贡献是重要的，但焓/熵平衡越来越多地作为选择性描述符，将药物优化到一个多维方法[GYDF4.Y2.Ba38.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

2.7.结合亲和力的计算GYDF4.Y2.Ba

抑制常数(GYDF4.Y2.Ba)可逆缓蚀剂的合成GYDF4.Y2.Ba是与标准吉布斯自由能（GFE）的变化有关的形成GYDF4.Y2.Ba复杂的(GYDF4.Y2.Ba)在溶剂中。这个GYDF4.Y2.Ba因此，可以通过络合GFE预测值GYDF4.Y2.Ba假设以下平衡：GYDF4.Y2.Ba 在哪里  表明溶剂化的物种。标准GFE反应变化(GYDF4.Y2.Ba1.GYDF4.Y2.Ba)可通过络合物和游离反应物的分子模拟得出：GYDF4.Y2.Ba 在这项工作中，我们通过表达[GYDF4.Y2.Ba25.GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba26.GYDF4.Y2.Ba]:GYDF4.Y2.Ba 在哪里GYDF4.Y2.Ba表示复合物的分子力学总能量（包括成键和非成键贡献），以及GYDF4.Y2.Ba溶剂化是GFE和GYDF4.Y2.Ba熵项：GYDF4.Y2.Ba 由转化，旋转和振动运动产生的贡献的总和组成GYDF4.Y2.Ba.假设trans和rot术语为自由GYDF4.Y2.Ba和复杂的GYDF4.Y2.Ba近似相等，我们得到GYDF4.Y2.Ba 在哪里GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba描述了不含抑制剂的平移和旋转熵项，和GYDF4.Y2.Ba表示络合物形成时的振动熵变。GYDF4.Y2.Ba

通过络合GFE相对于参考抑制剂的相对变化对不同抑制剂进行比较，GYDF4.Y2.Ba，假设抑制物的旋转和平移运动的理想气体行为:GYDF4.Y2.Ba

相对变化的评估是可取的，因为它预计将导致部分消除分子力学方法的近似性质以及溶剂和熵效应描述所引起的误差。GYDF4.Y2.Ba

2.8。相互作用能GYDF4.Y2.Ba

计算MM相互作用能(GYDF4.Y2.Ba)在酶残基和抑制剂之间，Discovery Studio提供了一个协议[GYDF4.Y2.Ba32.GYDF4.Y2.Ba]使用了计算定义的原子组之间的非键相互作用（范德华和静电项）的方法。使用CFF91力场进行计算[GYDF4.Y2.Ba28.GYDF4.Y2.Ba]介电常数为(GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba）。GYDF4.Y2.Ba

2.9。药效团的一代GYDF4.Y2.Ba

的模型中抑制剂的结合构象GYDF4.Y2.Ba配合物通过Catalyst HypoGen算法构建3D QSAR药效团[GYDF4.Y2.Ba39.GYDF4.Y2.Ba]在探索工作室实施[GYDF4.Y2.Ba32.GYDF4.Y2.Ba]．顶部评分药长假设由来自大多数活性抑制剂组的三个步骤（结构，减去和优化步骤）建立三个步骤。非活动分子用于定义排除的卷。基于Pharmacore生成的TMD支架和取代基选择低算法允许的最大五个特征，即：疏水性芳族（HADAL），疏水脂肪族（HYD），氢键供体，（HBD），氢键受体（HBA）和环芳香（AR）。协议的可调节参数以其默认值保存，除了活动上的不确定性，该值设置为1.5而不是3.这最后选择从大型的实验活动中带来不确定性间隔GYDF4.Y2.Ba相对狭窄的GYDF4.Y2.Ba考虑到这种方法的准确性和同质性的抑制活性，因为他们来自同一实验室的相同工作。在生成10个药效团的过程中，将缺失特征数设为0，并从中选出最佳特征。GYDF4.Y2.Ba

3.结果与讨论GYDF4.Y2.Ba

从同一实验室测定活性的3组化合物中选择了15个tmd的训练集和6个tmv的验证集[GYDF4.Y2.Ba14.GYDF4.Y2.Ba–GYDF4.Y2.Ba16.GYDF4.Y2.Ba]．它们列于表中GYDF4.Y2.Ba1.GYDF4.Y2.Ba以及他们的实验活动（5-1900年） GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM） 涵盖的范围足以建立可靠的QSAR模型。GYDF4.Y2.Ba

３．１．构象模型GYDF4.Y2.Ba

相对吉布斯自由能(GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba）被计算为复合物GYDF4.Y2.Ba原位GYDF4.Y2.Ba材料和方法中所述的dTMP修改。表GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba列出了吉布斯自由能及其组成GYDF4.Y2.Ba反映酶和抑制剂之间的相互亲和力。由于它是通过模拟以近似方式计算的，因此通过回归分析评估绑定模型的一致性，从而得出与实验活动的线性相关性GYDF4.Y2.Ba。这些回归的统计数据如图所示GYDF4.Y2.Ba3.GYDF4.Y2.Ba并在表中列出GYDF4.Y2.Ba3.GYDF4.Y2.Ba.根据回归方程，计算出GYDF4.Y2.Ba对于一种类似TMDs的新化合物，我们用它来预测其酶抑制活性GYDF4.Y2.Ba如果它们具有相同的结合模式。与传统的合成方法相比，该方法通常可以将过滤器缩小到新的先导化合物，并节省时间。从络合模型结构计算出每个TMPK的贡献分解GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba与TMD4相互作用的活性位点残基(GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.Ba米)GYDF4.Y2.Ba将其与TMA12中的一个进行比较(GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.Ba米)GYDF4.Y2.Ba在图中GYDF4.Y2.Ba4.GYDF4.Y2.Ba.从TMD4到TMA12可以清楚地看出，除Tyr39外，与TMD4强烈相互作用的所有残基都与TMA12保持密切接触（图GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba(c)捐款显著增加GYDF4.Y2.Ba对于Phe70、Pro37、Arg74和Tyr165。GYDF4.Y2.Ba

３．２．抑制剂的结合方式GYDF4.Y2.Ba

从络合模型中衍生自络合模型的TMD的结合模式在图中示出GYDF4.Y2.Ba1.GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba．先前从x射线结构中报道的活性位点上的主要相互作用是保守的，除了与Arg95、Tyr39、OH核糖与Asp9的单磷酸部分的HBs，而与Ala49和Asp163的HBs建立。吡啶环的堆积相互作用与阳离子保持一致GYDF4.Y2.Ba与Arg95交互。最后一种相互作用是tmd类基片取向的主要驱动力。的绑定模式dTMP脚手架报道从x射线结构复制我们的模型基于胸苷支架制作浓缩新替换简单的交互提供了预测方程的准确性是足够稳定的摩尔范围与假设结构相似的配体以类似的方式绑定。对训练集的快速分析表明，嘧啶环上5位的卤素并不是TMD2-3活性相对较低所证实的效价的主要特征。在另一端的5’位，只有N3能显著提高效价。从图中药效基因的特征可以看出，这两个位置对活性非常重要GYDF4.Y2Ba6.GYDF4.Y2.Ba。很容易理解每个特征的重量，因为大多数抑制剂中5位的CH3没有提高抑制效力，导致TMD15降低5倍（27） GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM） 与TMD4中的Br相比（5 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM）。该阳离子GYDF4.Y2.BaπGYDF4.Y2.Ba嘧啶环与ag95相互作用的32%GYDF4.Y2.Ba）与保守的沿GYDF4.Y2.Ba-GYDF4.Y2.Ba涉及Phe70的堆叠(10%GYDF4.Y2.Ba)，如图所示GYDF4.Y2.Ba5 (c)GYDF4.Y2.Ba．GYDF4.Y2.Ba

3.3.抑制活性的药效团模型GYDF4.Y2.Ba

3D QSAR PH4生成过程遵循三个主要步骤，构造、减法和优化步骤。HypoGen的构造相自动选择为先导化合物(GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM) for which (GYDF4.Y2.BaTMD4和TMD5使用这两个最上面的两个来生成所有的起始PH4特性，并只保留那些适合其余引线的特性。非活性化合物(log(GYDF4.Y2.Ba) - - -GYDF4.Y2.Ba)用于删除映射其中超过50%的特征，这些特征保留了所选五个特征的全部代表性。在模拟退火算法的优化阶段，根据其基于概率函数的代价保留得分最高的ph4。总共产生了10个假设，所有假设都显示了4个特征。成本从55.1 (Hypo1)到75.2 (Hypo10)不等。这种短间隔支持了假设的同质性和训练集的充分性。固定成本(45.9)比零成本(157.4)低GYDF4.Y2.Ba．这种差异是PH4预测的主要质量指标;GYDF4.Y2.Ba对应于模型代表真实相关性的极好机会或高于90%的概率[GYDF4.Y2.Ba32.GYDF4.Y2.Ba]．是统计学显著假设必须尽量靠近给固定和进一步地从零成本，对于该组10个假设GYDF4.Y2.Ba≥  82.2证明了模型的质量。标准指标如均方根偏差（RMSD）和相关系数(GYDF4.Y2.Ba)范围分别为1.126至2.036和0.96至0.88。由于整套pH4的闭合值，第一个假设（Hypo1）已保留以供进一步分析。GYDF4.Y2.Ba

假设集的数据（成本、RMSD、，GYDF4.Y2.BaRGYDF4.Y2.Ba)表中列出了这些参数GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba.Hypo1的统计数据；GYDF4.Y2.Ba= 1.0206×GYDF4.Y2.Ba  (GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba,GYDF4.Y2.Ba在显著性水平>95%时，图中的相关图说明了这一点GYDF4.Y2.Ba6.GYDF4.Y2.Ba还显示了药效团的几何结构以及TMD4和TMD5对其的映射。为了检验模型的一致性，我们预测了活动(GYDF4.Y2.Ba)验证集（TMVs:TMV1-1.65；TMV2-1.16、TMV3-1.56、TMV4-1.26、TMV5-0.82、TMV6-1.02）的所有部分都接近一个，TMV1和TMV3除外。GYDF4.Y2.Ba

在Catalyst中使用CatScramble算法对PH4模型进行了随机验证(Fisher方法)，根据98%的置信度选取49次随机运行，每次创建10个有效假设。最后，它们中的任何一个都没有表中列出的最低的10个具有预测性GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba，他们的花费在56 - 87之间(最近的)，116 - 135之间(最高的);两者的相关性和RMSD均不佳。综上所述，选择的假说有98%的可能性提供了与tmd生物活性的络合模型相同水平的可预测性。本工作的新类似物的设计部分是基于表征CH的疏水特征GYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}这也是Gopalakrishnan等人观察到的独特特征[GYDF4.Y2.Ba12.GYDF4.Y2.Ba]在TMPK的虚拟筛选方法中GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba抑制剂。在其壳体中的差异和固定成本之间的差异低于良好可预测性质量所需的70阈值。在模型中的HYD中将三个HBA和一个HBD功能添加到HYD中。互动距离是不同的;在我们的模型中，最接近HY的HBA为2.995Å而不是4.43Å，而不是6.88。还必须表明HBD特征与核糖环的羟基有关，因此预计来自其PH4模型的角度的角度的粘合性与自由配体不同的结合构象是一个完全比较困难。GYDF4.Y2Ba

新的抑制剂是针对PH4设计的。最近对取代基的3D药效团研究GYDF4.Y2.BaαGYDF4.Y2.BaTMPK的-胸苷激酶类似物抑制剂GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba使用优化的受体独立(RI) 4D QSAR形式[GYDF4.Y2.Ba40GYDF4.Y2.Ba]确定了五个网格细胞占用描述符（GCODs），用于与Arg95和Tyr103-Arg74-Asp163、Asp9和Arg95-Ala35、Phe36、Pro37以及Arg160-Met66和Phe70密切相互作用。一个是抑制增强（接近四位嘧啶环羰基）另外四种抑制作用减弱。在我们的QSAR模型列表中，只有Ala35和Met66在与抑制剂密切相互作用的活性位点残基中缺失。GCODs的位置与我们生成的PH4模型特征在全球范围内一致。GYDF4.Y2.Ba

3．4．新的抑制剂GYDF4.Y2.Ba

新的类似物主要基于嘧啶环上的5位取代，核糖的2′和3′。更多的全球替代，如核糖→ 环戊烷和5′端的封端羧酸盐。它们列在表中GYDF4.Y2.Ba4.GYDF4.Y2.Ba（另见图GYDF4.Y2.Ba5.GYDF4.Y2.Ba)，活性最强的达到皮摩尔浓度范围。GYDF4.Y2.Ba

3.4.1.5′端的替换（RGYDF4.Y2.Ba_{4.GYDF4.Y2.Ba})GYDF4.Y2.Ba

在保持所有剩余部分不变的情况下，将训练集中的5 '羟基替换为各种极性基团(TMA1-6, TMA18)，其中羧酸COOGYDF4.Y2.Ba^-GYDF4.Y2.Ba表现最好，但药效下降了五倍(GYDF4.Y2.Ba = 24 nM）来自TMD4。如图所示GYDF4.Y2.Ba5 (b)GYDF4.Y2.Ba，通过两个HB与Arg95和Tyr39带来实质性的亲和力朝向TMPK羧酸相互作用GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba.前OH不参与任何HB（图GYDF4.Y2.Ba2.GYDF4.Y2.Ba).关于Tyr39的额外HB，有趣的是，在TMPK结合位点的少数差异中GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba和TMPKGYDF4.Y2.BaHGYDF4.Y2.Ba（人类对应的酶PDB代码1E99），其中Arg14、Tyr39和Asn100在最后一个酶中分别被Ser20、Arg45和Gly102取代[GYDF4.Y2.Ba41.GYDF4.Y2.Ba，这是利用这种结构和功能差异(与Tyr39相互作用)设计选择性TMPK抑制剂的关键机会GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba．最近尝试通过替换羧酸COO来扩展GYDF4.Y2.Ba^-GYDF4.Y2.Ba与其他组相比，产生5′-修饰的胸腺嘧啶是有希望的[GYDF4.Y2.Ba42.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

3.4.2.嘧啶环（R）5-位的取代GYDF4.Y2.Ba_{1.GYDF4.Y2.Ba})GYDF4.Y2.Ba

保留羧基和核糖环（RGYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}= h和rGYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}=OH)，取代溴在5位(TMA7-17)导致明显增加的效力，TMA12 RGYDF4.Y2.Ba_{1.GYDF4.Y2.Ba}= CFGYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}-GYDF4.Y2.Ba 纳米，TMA16RGYDF4.Y2.Ba_{1.GYDF4.Y2.Ba}= CHGYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}-NH-CHO-GYDF4.Y2.Ba nM, and TMA17 R_{1.GYDF4.Y2.Ba}= NH-COCHGYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba}-GYDF4.Y2.Ba．三氟甲基是与Arg74的补充HB接触，加入阳离子 -GYDF4.Y2.BaπGYDF4.Y2.Ba（arg95）和GYDF4.Y2.BaπGYDF4.Y2.Ba-GYDF4.Y2.BaπGYDF4.Y2.Ba相互作用(Phe70)(图GYDF4.Y2.Ba5 (b)GYDF4.Y2.Ba）。GYDF4.Y2.Ba

3.4.3.核糖环（R）3′位的取代GYDF4.Y2.Ba_{3.GYDF4.Y2.Ba})GYDF4.Y2.Ba

为了提高NH替代OH的TMA12、16和17的预测效力GYDF4.Y2.Ba_{2.GYDF4.Y2.Ba}在核糖环上，预测的抑制活性不会增加，最好的一个是TMA37GYDF4.Y2.Ba nM的效力是TMA12的六倍。任何其他设计修改，例如用环戊烷替换核糖，都会导致效力降低（TMA19-27和TMA41-47）。GYDF4.Y2.Ba

数据GYDF4.Y2.Ba5 (b)GYDF4.Y2.Ba和GYDF4.Y2.Ba5 (c)GYDF4.Y2.Ba显示支持TMA12的亲和力的主要交互与来自我们QSAR模型的TMDS出来的那些。图中呈现的康诺蒂表面GYDF4.Y2.Ba图5（d）GYDF4.Y2.Ba建议进一步的设计机会，如双环2'，TMPK的3'-环抑制剂GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba[GYDF4.Y2.Ba20.GYDF4.Y2.Ba]和羧酸端延伸到(Z)丁烯基链4位携带萘内酰胺或萘磺酰胺部分的衍生物[GYDF4.Y2.Ba43.GYDF4.Y2.Ba]．这类抑制剂的设计需要适当的可用训练集(GYDF4.Y2.Ba: 0.42–0.75 GYDF4.Y2.BaμGYDF4.Y2.BaM） 我们正在建立QSAR模型，新的类似物将在适当的时候发布[GYDF4.Y2.Ba44.GYDF4.Y2.Ba]．GYDF4.Y2.Ba

TMPK特异性残基的贡献GYDF4.Y2.Ba太GYDF4.Y2.Ba到GYDF4.Y2.Ba（图GYDF4.Y2.Ba4.GYDF4.Y2.Ba)在全球范围内，15%的Arg14（9%）、Tyr39（2%）和Asn100（4%）与它们的价值相比是令人鼓舞的GYDF4.Y2.Ba在全球范围内，最活跃的训练集抑制剂的3.5%限制在100 Asn100（3%）。GYDF4.Y2.Ba

4。结论GYDF4.Y2.Ba

基于络合法建立的相互作用模型经PH4分析验证，为新型类似物的设计提供了结构信息。它们的结构接近报道的dTMP类似物。在这里，一个羧酸取代5 '位置羟基提高了他们的抑制能力，达到亚纳米摩尔范围(1-0.155 nM)。最有效的新类似物之一TMA12是与选择性Tyr39结合的HB，使TMAs成为合成和评价的最佳组合。通过组合文库的筛选和酶学分析的后续评估，更系统的搜索将导致更有效的类似物。GYDF4.Y2.Ba

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