即使具有更敏感的技术，诊断肺结核诊断需要清晨痰样品：乌干达青少年的青少年TB嫌疑人的前瞻性队列研究

摘要

世界卫生组织（世卫组织）建议收集两种用于结核病（TB）诊断的痰样品，其中至少有一个是使用涂片显微镜的清晨（EM）。即使使用痰培养，仍然尚不清楚这是必要的。在这里，我们确定从乌干达农村农村TB疑似青少年的EM痰样品培养物的诊断产量和增量产量。从1862年的青少年（LJ）和分枝杆菌生长指示管（MGIT）方法培养了来自1862年青少年的痰样品（斑点和早晨）。对于斑点样品，TB的诊断产率分别为LJ和MGIT的19.0％和57.1％，而早盘样品的增量产量（不是总数）为9.5％和42.9％（)，分别与LJ和MGIT。在乌干达农村地区疑似结核病的青少年中，EM痰培养具有较高的增量诊断产量。因此，除斑点标本培养外，EM痰液对改进结核病例的检测也是必要的。

背景

结核病（TB）仍然是全球急诊症，尤其是在撒哈拉以南非洲的高死亡率和发病率[1］.一些研究表明，青少年TB的发病率（12-18岁）增加了22％，而少于5岁的儿童减少38％[2］.

尽管在乌干达和全世界的青少年中缺乏关于结核病的数据，但他们对结核病的保护性反应结核分枝杆菌(MTB)感染似乎没有那么有效[3.］.青少年也有结核病的独特临床表现;他们更无症状，更有可能患有蛀牙疾病[4］.报告指出，许多患有活动性结核病的青少年是在疾病晚期被诊断出来的[2］.此外，青少年结核病患者的人口统计学和临床特征与成人和儿童不同[5］.此外，很难获得高质量的痰样本，这使得青少年结核病诊断具有挑战性。事实上，许多患有结核病的青少年容易产生涂片阴性痰样本[6］.

世界卫生组织(世卫组织)和国际抗结核病和肺病联盟(IUATLD)建议收集两份痰样本用于涂片镜检，其中至少一份为清晨(EM)样本。这是为了减少每个被检查的连续样本的工作量[7，8］.但是，这些建议似乎在为服务提供外部质量保证（EQA）方法的一般人群的设置中工作。因此，这些建议可能无法解决痰培养的其他情况下所需的样品数量。

TB的明确诊断主要取决于临床样本中MTB的培养[9］.根据Dowdy等人的数学模型。，扩大使用结核病文化可能对TB负担产生直接影响，因为它可以降低高负荷国家的结核病率[10.］.然而，这一概念在资源有限、结核病负担最重的国家应用较少。这主要是由于所需基础设施的高昂费用和成本[11.］.例如，乌干达只有一个公共结核所文化设施，位于首都坎帕拉。

尽管已采取行动扩大和改善开展结核病培养的实验室能力[12.]以及需要减少劳动力的自动液体培养系统的可用性[13.]但很少完成，以评估在资源有限国家在资源有限国家进行TB文化的运营研究的影响和成本效益。当青少年参与文化时，这种情况更糟糕的是最适合的诊断[14.］.

虽然涂片显微镜所需的痰样品的数量和类型已经标准化，但培养所需的痰样品的数量和类型尚未得到很好的标准化。此外，虽然当使用涂片显微镜时，来自EM痰样品的显着诊断增益，但是当使用更敏感的技术（例如培养），尤其是青少年时，尤其是在青少年中使用更敏感的技术，这是不明确的。因此，该研究旨在确定乌干达农村青少年中TB诊断TB的诊断产量和增量产量。

2.方法

2.1。学习设计与环境

这项研究是Makerere大学公共卫生学院进行的一项大型观察性研究的一个次级组成部分，该研究在乌干达农村招收了5000名青少年，为结核病疫苗试验做准备。这项研究是在位于乌干达东部Iganga和Mayuge地区(距首都坎帕拉约150公里)的人口监测站(DSS)进行的。

青少年结核病队列(12-18岁)招募了来自DSS范围内中小学的5,000名参与者。该研究招募了结核菌素皮肤试验(TST)阳性、至少有一种结核病相关症状或与结核病患者有过接触史的参与者。在研究期间有搬迁计划或医学上不适合收集痰液的参与者被排除在外。结核病的临床评价包括提供两份痰标本;一份是在第一天的监督下现场采集的(现场样本)，另一份是在第二天由没有监督的参与者采集的(EM样本)。

每天由护士采集受试者的痰液样本，冷藏箱(温度≤8℃)运送至分支杆菌实验室(生物安全3级)进行培养分析。该实验室位于坎帕拉Makerere大学卫生科学学院医学微生物系。中午之后采集的样本被冷藏到第二天。

因此，研究分析包括研究参与者的EM和点痰样本提交培养。

2.1.1。实验室程序

按标准程序处理痰样品[15.]并同时接种在Lowenstein Jensen（LJ）（Becton和Dickson，Franklin Lakes，NJ，USA）和分枝杆菌生长指标管（MGIT）（Becton和Dickson，NJ，USA）培养瓶，如其他地方所述[15.，16.］.荧光显微镜的涂片也根据标准程序进行[15.］.

为了纯度，在37℃下进一步培养MgIT阳性培养物24小时，并完成Ziehl Neelsen（Zn）涂片。患有Zn阳性和纯度（即血琼脂的生长）的培养物进行Capilia TB Neo（Taun，Numazu，Japan）以识别MTBC [17.］.如上所述再次培养血液琼脂（Zn阳性）的培养物，也是Zn阳性的培养物;持续的Zn阴性培养含有生长的血液琼脂被认为是污染的。所有Zn阳性，血液琼脂阴性和Capilia TB Neo阴性样品都被鉴于结核病（Mott）以外的分枝杆菌;这些患有基因型作为测定（Hain LifeScience，Nehren，German）进行物种。否则认为，MGIT中的LJ或荧光的含有菌落被认为是阴性的。数据被输入到与患者记录相关的计算机化实验室访问数据库上，在样本报告表单上。

2.1.2。数据分析

我们分析的主要结果是培养阳性TB，定义为LJ或来自任何斑点或EM样品的MGET培养物的MTBC阳性。分析实验室数据以诊断产量;这提及每个痰样品类型（点或Em）检测到的Tb病例的数量，而不管比较器是否为正。分析数据进行增量诊断产量;当来自同一情况的斑点样品为阴性时，在检测到的TB病例方面，这提及培养阳性EM样品的产量。污染率被计算为在接种每种样品类型的培养物总数上污染的每个样品的总培养物总数。

统计分析与Stata SE软件版本11（Stata Corp LP，大学站TX，USA）进行。分析单位是样品类型，显示用于培养的EM痰样品的每种诊断产量和增量产量。一种-05的值被认为是统计学意义。

2.1.3。道德考虑因素

本研究在豁免同意后经营，因为它涉及来自先前获得了Makerere大学卫生科学学院公共荒藏机构审查委员会（IRB）和乌干达全国科学和技术委员会的惯例（uncst）。

3.结果

对于TB，共有5000名青少年参与者，其中2418（48.4％）达到了TB嫌疑人的研究标准。在2418 TB嫌疑人的情况下，803（33.2％）具有阳性TST，237（57.0％）与TB患者接触，1378（57.0％）至少有一个结核病症状。此外，由于样品收集挑战，556（22.9％）被排除在外;50（2.1％）已干咳，因此未提供痰，301（12.4％）未能在痰收集之前迁移110（4.5％），而95（3.9％）错过了该系列的研究访问观点。因此，分析仅限于1862个符合条件的参与者，他们拥有EM和现场样本，图1．

在1862名参赛者中，六（0.3％）是基于涂片显微镜的MTBC阳性，而21（1.1％）基于培养物（如方法中所述，通过Capilia Neo TB测定证实）因此被视为真实的TB案例（表格1）.

3.1。现场和清晨痰样品的分枝杆菌产量

基于LJ培养，只有六（0.4％）样品是MTBC阳性意义，基于LJ阳性培养的TB病例检测是6例：这些涂片显微镜也是阳性的。在六种LJ阳性病例中，一（0.1％）来自点样品，来自EM的两（0.2％），（<0.001），而三（0.5％）来自点和EM样品。斑点样品的LJ污染率为1.6％，而EM样品为2.9％（）.

MGIT培养检测21例结核病例(包括6例lj阳性);现场6个(0.3%)，EM 12个(0.6%)，现场和EM样本均为3个(0.2%)(）.MGIT检出MOTT 225例(12.1%)，其中106例(5.7%)，119例(6.4%)。）分别来自现场和EM样品（表2）.

莫特的种类如下:M. Fortuitum.143（63.6％）;m . Szugai32 (14.2%);m . gordonae21 (9.3%);m . intracellulare11 (4.9%);M. scrofulaceum.7（3.1％）;M. Lentiflavum.7（3.1％）;m . peregrinum4（1.8％）。

总体而言，436/1862（23.4％）现场和499/1862（26.8％）（）EM样品培养物被污染（表2）.最常见的污染物是克阳性COCC1。

３．２．结核病现场诊断产量和早期痰标本培养的增量产量

点样品的TB诊断产量分别为4（19.0％）和12（57.1％）的LJ和MGIT。EM样品的增量诊断产量（不是总计）为2（9.5％）和12（42.9％）（)，分别在LJ和MGIT(表3.）.

4.讨论

本研究表明，在乌干达农村的青少年结核病嫌疑人中，EM痰样品培养具有更高的增量诊断产量。然而，该研究还发现，与点样品相比，EM培养物也检测更多薄荷。在LJ培养物上给出负点痰样品培养的EM痰培养的诊断增益为9.5％，夹昔含有42.9％。

鉴于痰培养的敏感性，尤其是涂抹显微镜的液体系统（MGIT），可以想象EM痰样品的增量诊断产量可忽略不计;然而，这与我们的发现与先前的研究通过显微镜或文化进行了相同的结果相反[7，18.- - - - - -20.］.本研究中的调查结果进一步同意以前的研究，其中报告了EM样本的显着增益[21.- - - - - -23.］.这可能部分是由于夜间痰液在肺部积聚，导致EM样本中杆菌浓度升高。相反，患者可能在白天更活跃，并可能间歇性地排出杆菌，从而减少了痰液斑点标本中杆菌的数量。这些事实进一步支持了在宣布结核可疑者为肺结核阴性之前，除了发现痰样本外，还要检查EM样本的指南。

固体培养检测到较少的结核病病例，与MGIT相比，污染较少，并且在样品类型方面，与先前的研究一致[21.，24.，25.］.然而，Tortoli等人。记录与LJ文化相反[26.］.与MGIT相比，LJ的低收率不太可能归因于去污程序，因为样品使用相同的程序和相同的均质痰样品接种在两种培养基中。较低的污染率可能是由于我们使用了商业制备的LJ，它是适当的质量控制，不太可能吸引污染物。

MGIT的高污染率可能部分是由于这种方法使用了高营养的培养基，很容易支持其他细菌的生长。另一种可能是，从痰标本采集点(3小时车程)到实验室的距离较远，促进了正常菌群的快速增殖，这些菌群主要是革兰氏阳性球菌[26.］.我们观察到，与EM样本(在收集地点不受监督)相比，现场样本(在收集地点受监督)的污染更少;然而，这可能并不重要，因为我们没有给患者提供水或其他材料，以减少痰前的正常菌群。然而，这一发现得到了之前一项类似研究的支持[27.］.值得注意的是，高污染率可能导致粉丝低估Tb病例，并增加了测试的成本。此外，第二痰培养的产量增加可能部分原因是检测到在斑点污染的那些的EM样品;然而，由于以前的污染率的研究还记录了类似的增加的产量，因此污染不太可能解释EM培养的产量增加，因为之前的污染率低的研究[21.，22.］.

与先前的研究一致[28.]，我们发现LJ可能有一个不利的环境来支持Mott增长，因为所有孤立的分枝杆菌都是MTBC [28.]和MGIT分离出大量的MOT。这主要是由于MGIT更敏感，并且有助于快速增长的MOTT比LJ快速增长。这就是为什么强调在报告结果之前识别Zn阳性的任何MGIT的快速鉴定的原因[29.］.然而，这与另一项研究相反，该研究记录了在LJ和MGIT培养物上分离出的几乎相似数量的MOTT [26.］.这可能归因于莫斯特分布的区域差异，因为来自该研究的大多数Mott物种不同于我们所确定的那些。

由于大多数分枝杆菌是类似的表型，因此在这项研究人群中莫特的患病率令人担忧，因为它们可能会扭曲计划的TB疫苗试验中的免疫原性数据。此外，由于我们没有由于斑驳感染没有记录任何疾病，因此需要对MOT的研究，因为在其他环境中记录了由于这些生物引起的疾病[30.］.此外，由于本研究中未能携带EM样本返回的参与者人数高达301/2418(12.4%)，因此，考虑到其他痰样本采集策略，如“前负荷”策略，未来的研究也将非常重要。

我们的研究有一些局限性;首先，我们并没有将斑点的分枝杆菌产量分开，并在基线和随访中收集的EM痰样品;因此，在研究期间的不同时间点可能发生样品组合物的差异。此外，主要研究记录了少数实验室证实的结核病病例。当考虑包括临床诊断的其他形式的TB诊断，这可能是不同的。然而，考虑到更大的样本大小，我们的研究结果为青少年中的TB研究提供了重要信息。

分析的样品在研究环境中采集，并在现场样品采集监督下进行，同时在纯研究性质的BSL-3 TB培养设施中进行分析;因此，尽管我们的发现对临床试验等受控研究设置有很大的影响，但它们可能并不代表日常实践中发生的情况。

此外，我们将MTBC与Capilia TB Neo识别，这可能会使以前研究记录的假底片[30.，31.］;然而，所有的MOTT和MTBC均通过Line Probe Hain CM和AS基因型检测再次确认。

总之，清晨痰培养物在乌干达青少年中具有高增量诊断产量。在TB怀疑青少年中，清晨痰除了点发现样品培养，对于更好的TB案例检测是必要的。MGIT系统培养了所有MTBC病例以及MOTT和大多数来自清晨痰样品。

致谢

作者感谢来自Iganga / Mayuge Iganga / Mayuge人口监测网站（DSS）和Makerere大学健康科学学院的实验室技术团队的参与者。本研究由欧洲和发展中国家的临床试验伙伴关系（EDCTP）提供资助，来自传染病学院（IDI）和Iganga / Makerere大学健康科学学院的Iganga / Mayuge DS的行政支持。

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