COBAS Taqman PCR检测的临床评价结核分枝杆菌和M. Avium.复杂的

抽象的

进行回顾性观察研究以确定PCR检测的灵敏度和限制结核分枝杆菌和M. Avium.复杂。我们从呼吸道采集临床标本，进行培养结核分枝杆菌要么M. Avium.络合物，进行PCR分析。共299个样本(结核分枝杆菌, 177;M. Avium., 35岁;M.细胞内2007年4月至2011年3月，采用COBAS TaqMan PCR分析87)。涂片阴性组、涂片1+组、涂片2+组、涂片3+组PCR阳性率分别为50 ~ 55%、70 ~ 100%、88 ~ 98%和100%。涂片1+肺结核PCR阳性率为80.6%，差异有统计学意义(）低于涂片2+（97.3％）。从2005年1月到2007年3月，我们收集了另外138个样本（结核分枝杆菌，74;M. Avium.21岁;M.细胞内，43），由COBAS扩增器PCR分析。使用COBAS Taqman PCR和COBAS扩增器PCR获得的PCR阳性速率没有显着差异。在涂抹1+的情况下，分枝杆菌的PCR试验对分枝杆菌的敏感性是不够的。必须仔细考虑对涂片1+的阴性PCR试验结果的解释，因为涂片阳性结核是分离的标准。

1.介绍

聚合酶链式反应(PCR)是由Kary Banks Mullis发明的[1，2，广泛应用于基础和临床医学。尤其在临床医学领域，PCR在感染性疾病的早期诊断中发挥着重要作用[3.]，因为PCR可以从致病生物中检测到DNA片段的一份副本。诊断细胞病毒的诊断中还报告了PCR的效用[4，5]并且PCR广泛用于检测结核分枝杆菌和M. Avium.复杂(MAC)在日本。另一方面，一个标本的分枝杆菌涂片阳性和阴性结核分枝杆菌PCR检测有时可能呈阳性结核分枝杆菌文化的结果。这种假阴性结果是非常危险的，因为它们可能会导致具有感染控制风险的患者获释。评价了PCR检测方法的可靠性和局限性结核分枝杆菌，M. Avium.， 和M.细胞内与临床情况有关。我们发现PCR结果在涂片1+病例中有时不可靠。

2.方法

２.１.研究对象

从2005年1月到2011年3月分析了从呼吸道中收集的呼吸道（使用支气管坡（BF）获得的痰或样品）的临床标本。结核分枝杆菌，M. Avium.,或M.细胞内从这些标本中培养，并且在样品收集时进行分离的细菌的PCR。

２.２.数据收集

共299个样本(结核分枝杆菌, 177;M. Avium., 35岁;和M.细胞内，87）于2007年4月至2011年3月获得，138个样本（结核分枝杆菌，74;M. Avium.21岁;和M.细胞内从2005年1月到2007年3月。每个样品中的分枝杆菌通过auramine-rhodamine染色进行定量[6]根据美国胸部社会的陈述分类[7］．

为了评估假阳性结果，我们收集了2061份样品(COBAS TaqMan PCR)结核分枝杆菌, 1568;M.细胞内, 1593;M. Avium.1594;COBAS PCR扩增结核分枝杆菌, 505;M.细胞内，512;M. Avium.508)，细菌培养无分枝杆菌生长，PCR检测。从已知的分枝杆菌疾病患者的样本中剔除。简单地说，假阳性是指在没有已知分枝杆菌疾病的受试者中，培养结果为阴性，PCR结果为阳性。

本研究的有效性和伦理性得到我院机构审查委员会(IRB)的认可。

２.３.聚合酶链反应

如前所述，对2005年1月至2007年3月采集的样本进行COBAS扩增PCR [8，9］．COBAS Taqman PCR（结核分枝杆菌， COBAS TaqMan MTB;M. Avium.和M.细胞内， COBAS TaqMan MAI)对2007年4月至2011年3月收集的样本进行了研究，如前所述[10- - - - - -12］．临床标本DNA提取采用AMPLICOR呼吸标本制备试剂盒。

2.4。统计分析

采用卡方检验比较各组间阳性结果。

3.结果

3.1。结核分枝杆菌根据分枝杆菌涂片PCR阳性

桌子1表明结核分枝杆菌COBAS TaqMan PCR阳性。使用BF获得的样本数量非常少(4个样本);因此，总数主要反映痰检结果。涂片阴性组、1+组、2+组、3+组PCR阳性率分别为53.1%、80.6%、97.3%、100%。涂片1+组PCR阳性显著低于涂片2+组(，Chi-Square测试）和涂片3+组（，通过卡方检验)。涂片1+与整体结核之间的阳性率差异无统计学意义(80.6% vs . 86.4%，，通过卡方检验)。

3.2。M. Avium.根据分枝杆菌涂片PCR阳性

桌子2表明M. Avium.COBAS TaqMan PCR阳性。使用BF获得的样本数量很少(5个样本);因此，总数主要反映痰检结果。涂片阴性组、1+组、2+组、3+组PCR阳性率分别为50.0%、70.0%、91.7%、100%。观察到的趋势与结核分枝杆菌案例。

3.3。M.细胞内根据分枝杆菌涂片PCR阳性

桌子3.表明M.细胞内COBAS TaqMan PCR阳性。使用BF获得的样品数量小（15个样品）;因此，总数主要反映痰检结果。涂片阴性，1+，2+和3+基团的PCR阳性率分别为50.0％，100％，88.9％和100％。在BF衍生的样品中，涂片阴性组中的PCR阳性降至16.7％。另一方面，涂片阳性基团中的PCR阳性为100％。

3.4。PCR阳性与钴雪猫放大器方法

桌子4显示COBAS Amplicor PCR结果。PCR阳性率结核分枝杆菌，M. Avium.， 和M.细胞内，分枝杆菌数量与COBAS TaqMan PCR几乎相同，说明两种PCR检测方法的差异无统计学意义。

3．5．COBAS TaqMan PCR和COBAS Amplicor PCR假阳性结果

桌子5显示COBAS Taqman PCR和COBAS扩增器PCR的假阳性结果的结果。COBAS Taqman PCR的假阳性率为6/1568（0.38％），3/1593（0.19％）和10/1594（0.63％），在结核病中，M. Avium.， 和M.细胞内,分别。结核患者COBAS AMPLICOR PCR假阳性率分别为11/505(2.18%)、2/512(0.39%)和1/508(0.20%)。M. Avium.， 和M.细胞内,分别。

4。讨论

在该研究中，通过通过荧光染色分析临床样品的PCR阳性来检查新型PCR方法（COBAS Taqman测试）的敏感性。从COBAS Taqman测试中获得PCR阳性的详细数据。关于培养阳性结核，涂片1+的PCR阳性为80.6％，统计学上显着低于涂片2+的阳性（97.3％，)和涂片3+ (100%，）.涂片1+与整体结核之间的阳性率差异无统计学意义(80.6% vs . 86.4%，，通过卡方检验)。提示应注意对涂片1+ PCR阴性结果的解释。

COBAS Taqman PCR的PCR阳性结果呈现在表格中1- - - - - -3.．这结核分枝杆菌涂片1+组PCR阳性率为80.6%，显著低于涂片2+组97.3% (，通过卡方检验)。我们的结果表明，PCR结果并不总是准确的涂片阴性和1+病例。M. Avium.和M.细胞内荧光染色法检测，分枝杆菌数量越多，PCR阳性率越高(表)2和3.）.涂片1+组与涂片2+组PCR阳性率差异无统计学意义。样本量可能不足以发现微小的差异。

有四个M.细胞内涂片2+组中的PCR阴性样品，和M.细胞内涂片2+组中的PCR阳性为88.9％，略低于结核分枝杆菌和M. Avium.．然而，差异没有统计学意义(，经卡方检验)结核分枝杆菌PCR积极性。此外,M.细胞内涂片1+组PCR阳性与阴性组相同结核分枝杆菌和M. Avium.．因此，我们得出结论，PCR检测的灵敏性M.细胞内难道不比结核分枝杆菌和M. Avium.．

使用BF（4,5和15个样品获得的样品数量结核分枝杆菌，M. Avium.， 和M.细胞内不足以进行分析。BF的敏感性似乎低于痰液的总体结果，但PCR阳性在涂片阳性组似乎是好的。

Kim等人[12据报道，COBAS Taqman PCR的敏感性优于基础药物水平的COBAS扩增器PCR的敏感性。Yonemaru等人。[10]还报告了一种类似的优越性，基于发现COBAS Taqman PCR检测到的结核分枝杆菌COBAS Amplicor PCR结果为阴性的21份样品中，有12份为阴性。另一方面，我们的结果表明，COBAS TaqMan PCR(表1- - - - - -3.)和COBAS Amplicor PCR(表4）同样敏感。此外，Xpert MTB / RIF [13[检测通过PCR方法检测利福平耐结核的抗性结核，据报道较高的敏感性（涂抹阴性：124/171（72.5％），涂型阳性：551/561（98.2％））比我们研究的敏感性。然而，在比较不同PCR试验的功效时需要进一步研究，因为我们的结果不是基于相同样品的比较。

显然，PCR的阳性随着涂片评估的细菌量而增加。但是，最先前的研究[10，11，13未对涂片阳性病例进行进一步划分，并进行整体分析。这些研究认为PCR结果在涂片阳性病例中非常可靠。在本研究中，我们将PCR方法的局限性与临床情况联系起来，发现在涂片1+病例中，PCR结果有时不可靠。也就是说，将涂片和PCR检测相结合，可以提高肺结核诊断的敏感性，特别是在涂片1+病例中。临床医生确定释放分枝杆菌的患者是否患有结核或非结核分枝杆菌病是非常重要的。PCR肯定能预测涂片2+或更高病例的肺结核。在涂片1+病例中基于PCR阴性结果排除肺结核存在相当大的风险。我们必须使用其他检查(例如，Quantiferon和胸部CT)对此类病例作出仔细的决定。更敏感的方法，如嵌套PCR [14]，可能是有效和所需的涂片1+病例。

关于假阳性，由阴性培养和阳性PCR结果，COBAS Amplicor PCR为结核分枝杆菌表现出相对较高的（2.18％）假阳性率（表5）.COBAS TaqMan PCR和COBAS AMPLICOR PCRM. Avium.要么M.细胞内显示出低于1％的假阳性率。即使我们排除了已知的分析分析的病症，一些分枝杆菌（可怕的灭活）也可能存在于样品中并使阳性PCR结果。然而，我们的回顾性研究有限揭示了假阳性结果的原因。未来的前瞻性研究需要阐明虚假阳性结果的原因。

PCR技术随着时间的推移进行，速度和灵敏度大大提高。另一方面，在某些情况下可能不会执行来自临床医学的反馈。本研究是第一项分析COBAS Taqman PCR临床用途的实用性和限制的研究。

5.结论

我们使用COBAS TaqMan PCR方法，评估其在临床情况下的有效性和局限性。PCR阳性率为结核分枝杆菌在分枝杆菌涂片1+结核病例约80%。在基于PCR阴性结果排除肺结核之前，特别是当分枝杆菌涂片中有少量细菌时，我们必须仔细考虑。

利益冲突

本文的所有合唱者都没有利益冲突。

作者的贡献

S. Ikegame进行了数据收集和统计分析。Y. Sakoda和K. Taguchi参与了数据收集。N. Fujino进行分枝杆菌涂片，计数分枝杆菌数量，培养分枝杆菌，鉴定分离分枝杆菌。M. Kawasaki和A. Kajiki对研究组织有贡献。

参考

1. K. B. Mullis和F. a . Faloona，“通过聚合酶催化的链式反应在体外特异性合成DNA”，方法酶学，卷。155，pp。335-350,1987。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
2. R. K. Saiki, S. Scharf, F. Faloona, K. B. Mullis, G. T. Horn, H. A. Erlich等，“β球蛋白基因组序列的酶促扩增和限制性位点分析用于镰状细胞性贫血的诊断”，科学，卷。230，pp。1350-1354,1985。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
3. N. C. Engleberg和B. I. Eisenstein，《用于诊断目的的微生物核酸检测》，医学年度回顾，第43卷，第147-155页，1992。查看在：谷歌学术搜索
4. B. Boddinghaus, T. Rogall, T. Flohr, H. Blocker, E. C. Bottger，“通过rRNA扩增检测和鉴定分枝杆菌”，临床微生物学杂志第28卷第2期8，第1751-1759页，1990。查看在：谷歌学术搜索
5. P. M. W. Hermans, A. R. J. Schuitema, D. Van Soolingen et al，“特异性检测结核分枝杆菌聚合酶链反应的复杂菌株，“临床微生物学杂志第28卷第2期6，第1204-1213页，1990。查看在：谷歌学术搜索
6. J.P.Truant，W.A.Brett和W. Thomas Jr.，“结节芽孢杆菌的荧光显微镜用Auramine和Rhodamine染色”亨利·福特医院医疗公报，第10卷，第287-296页，1962。查看在：谷歌学术搜索
7. 美国胸部社会，“成人和儿童结核病的诊断标准和分类”，美国呼吸系统杂志CHINESS，第161卷，第1376 - 1395,2000页。查看在：谷歌学术搜索
8. T. Bodmer，A.Gurtner，M. Scholkmann和L.事项，“Cobas Amplicor MTB系统的评估”临床微生物学杂志，卷。35，不。6，PP。1604-1605,9997。查看在：谷歌学术搜索
9. B. Ninet，P.Rohner，C. MEDRAL和R. Auckenthaler，“COBAS放大器系统的使用与Bactec 12B培养物进行评估以快速检测经常鉴定的分枝杆菌”临床微生物学杂志，第37卷，第2期3，页782-784,1999。查看在：谷歌学术搜索
10. M. Yonemaru，M. Horiba，A. Tada和T. Nagai，“Cobas Taqman的评估”：Cobas Taqman的评价：基于实时PCR的分枝杆菌诊断套件，“Nihon Kokyūki Gakkai Zasshi，第47卷，第47期。12, pp. 1070-1076, 2009。查看在：谷歌学术搜索
11. S. P. Chandran和J. Kenneth，“对塔皮斯塔克曼的评估实时PCR测定诊断结核分枝杆菌，“印度医学研究第132卷第1期7，页100-102,2010。查看在：谷歌学术搜索
12. J. H. Kim，Y.J.Kim，C.S.Ki，J. Y.Kim和N. Y. Lee，Cobas Taqman MTB PCR检测的评价结核分枝杆菌，“临床微生物学杂志，卷。49，没有。1，pp。173-176,2011。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
13. C. C. Boehme，P. nabeta，D. Hillemann等，“结核病和利福平抗性的快速分子检测”新英格兰医学杂志，卷。363，没有。11，PP。1005-1015，2010。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索
14. T.Takahashi，T.Nakayama，M. Tamura等，“嵌套聚合酶链反应，用于评估结核性脑膜炎的临床进程”神经学号，第64卷。10，页1789-1793,2005。查看在：出版商的网站|谷歌学术搜索

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