临床，影像，病理结果：电磁场治疗对恢复从缺血性中风的大鼠中风模型的影响

抽象

中风是死亡和残疾的主要原因。中风的影响包括感觉运动技能和认知能力的显著缺陷。目前，对卒中后患者的有效干预措施有限。在这项初步研究中，我们研究了一种新的无创、低强度、低频、电磁场治疗(VLIFE)，目标是神经网络，在体内中风大鼠模型。将18只大鼠分为3组:sham组(M1)和VLIFE组(M2)， VLIFE组暴露4周，其中1组为theta波(M2)，另1组为beta波(M3);所有的组都进行了额外一个月的随访。结果显示，M2和M3治疗组的感觉运动功能缺损均得到恢复，这是通过改良的神经系统严重程度评分和前肢放置测试得到的结果。脑磁共振成像结果显示，治疗组的淋巴管周围水肿和侧脑室变宽。纤维束的成像，在VLIFE处理后，显示出较高的白质完整性比对照组。组织学结果支持神经再生过程。 Our data suggest that VLIFE treatment, targeting a specific functional neural network by frequency rather than location, promotes neuronal plasticity after stroke and, as a result, improves clinical recovery. Further studies will investigate the full potential of the treatment.

1.简介

中风是由人类，家庭和卫生系统的角度昂贵的疾病。中风是导致死亡的主要原因第四和残疾在美国的主要原因[1]。中风的后果包括在感觉运动和认知功能方面的显著缺陷。中风幸存者的康复和长期护理是一个持续的重大经济负担。由于人口老化，中风的负担在未来20年将会增加，而到2030年，脑血管疾病的增加预计会导致中风的医疗费用增加两倍[2]。

目前，对急性卒中后患者的有效干预措施有限[3.]。因此，大多数脑卒中患者的管理仍主要集中于二级预防和康复。

在过去的二十年里，现代的非侵入性脑刺激(NIBS)技术对神经科学做出了显著的贡献。经颅磁刺激(Transcranial magnetic stimulation, TMS)是一种非侵入性的方法，可以引起大脑神经元的去极化或超极化。经颅磁刺激使用电磁感应，利用快速变化的磁场来诱导微弱的电流;这可以引起大脑的特定或一般部分的活动，几乎没有不适。该方法已被用于脑功能研究，并作为各种神经和精神疾病的治疗工具[4- - - - - -6]。

NIBS的两种最常用的形式是重复经颅磁刺激（磁刺激）和经颅直流电刺激（TDCS）。磁刺激可以增加或减少取决于刺激，线圈方向和频率的强度的皮质脊髓束的兴奋性。这些作用的机理尚不清楚，虽然人们普遍认为，以反映突触效能的变化，其结果在长时程增强（LTP）或长期抑制（LTD）7]。与经颅磁刺激相比，tDCS更安全、更易于使用，与经颅磁刺激相比，tDCS不导致动作电位的诱导;tDCS似乎可以改变皮质神经元放电的阈值[8]。尽管多项研究显示TDCS的好处，它在中风康复有效性有待进一步证明。当与身体康复相结合，可能通过帮助马达网络“微调”一种运动，从而提高其效力[它可以具有治疗优势9]。

迄今为止的结果表明，如上所述，脑刺激对偏瘫脑卒中患者的运动恢复仅显示出适度的有益作用，其改善幅度在假手术治疗的10% - 30%之间[10- - - - - -12]。

Cherry的早期作品[13]表现出强烈的科学证据表明，人的脑电波的频率是高度相关的舒曼共振（SR）信号。SRS的是在地球的电磁场频谱的极低频率（ELF）部分的一组光谱峰。SR的是全球性的电磁谐振，雷电放电由地球表面和电离层形成的空腔兴奋。SRs are the principal background in the electromagnetic spectrum beginning at 3 Hz and extend to 60 Hz, appearing as distinct peaks at extremely low frequencies (ELF) around 7.83 (fundamental), 14.3, 20.8, 27.3, and 33.8 Hz.

电磁场处理提出了一种新的方法，以非侵入性的脑刺激。

VLIFE（非常低的强度和频率电磁场）装置，在该研究测试，产生均匀的交变电磁场，提供全脑刺激。传输频率的选择根据所期望的神经网络的自然操作频率，假定工作频率的诱导在一定的神经网络将促进可塑性机制，包括神经发生和迁移，在一个特定的网络。治疗目的用于功能网络，不同于瞄准脑位置的其他刺激方法。

我们假设VLIFE治疗可能会促进脑卒中后的恢复，从而改善临床结果。这是一个概念验证研究。

2。材料和方法

2.1。动物及外科手术

所有实验均按照1986年11月24日欧洲理事会指令(86/609/EEC)进行，并获得当地动物伦理委员会批准。这些动物被分组饲养(每4型Makrolon笼2至4只动物;60厘米长，38厘米宽，20厘米高)在14小时的光10小时的黑暗循环下，食物和自来水随意供应。共18只雄性斯普拉格-道利大鼠，体重220-230克。死亡的动物或明显疼痛或表现出严重和持久痛苦迹象的动物按Pharmaseed SOP 005(安乐死啮齿动物)安乐死。死亡时间被尽可能精确地记录下来。没有发现奄奄一息或处于严重危难状态的动物。

单侧大脑中动脉闭塞（MCAO），缺血性中风的在人类和啮齿动物显著原因，产生对身体同侧的较少受损侧到受伤的脑神经对侧传感器的运动障碍和补偿性依赖。大鼠使用tMCAO手术，短暂大脑中动脉闭塞呈现偏瘫。

闭塞大鼠再麻醉一个半小时后，抽出单丝进行再灌注，关闭手术创口，将大鼠放回笼子(受影响的动物)。

要监视的最常用的方法，这些感觉运动功能包括修改神经严重性评分（MNSS-a的神经学神经行为试验纲要），后肢放置和前肢足失误和前肢放置汽缸行为[14,15]。

所述tMCAO手术当天被定义为“第1天”，第一次治疗当天定义为“第1天”，并终止当天定义为“第57天”1-30天为治疗期;30-57天为随访期。这项研究是在三个周期执行。

手术过程中有2只动物死亡，闭塞后和分组前有7只动物死亡。VLIFE治疗期间无动物死亡。

2.2。VLIFE(甚低强度及频率电动势)治疗

这些动物被分为三组。对照组接受假治疗（放置在VLIFE设备而不经受其交变电磁场），和两个处理组（M2，M3）。我们开始疗程tMCAO操作（1天），然后隔日4周后两天。每次会议持续了两分钟。动物s in group M2 were treated with alternating electromagnetic field in the frequency of theta waves (3.93 Hz) and animals in group M3 were treated with electromagnetic field in the frequency of beta waves (15.72 Hz) as described in Table1。假手术组中，将动物置于在VLIFE设备，但不进行任何电磁场。在该实验中病变涉及的锥体马达神经网络;从而治疗频率被相应地选择。以往的研究表明，有在各种运动神经活动的比较普遍的趋势[16,17]。

VLIFE设备产生均匀的交变电磁场，并与大脑中的特定神经网络同步。因此，整个大脑受到电磁场的作用，只有目标神经网络被激活。该设备使用亥姆霍兹线圈[18]。

在本研究中，VLIFE在动物周围产生了一个电磁场，其强度范围在±0.5高斯范围内，与地磁场强度相似[19)(见图1)。

2.3。体重和神经系统评分

2.3.1。体重

体重tMCAO前和天11，19，27，35，43，和57监测。

2.3.2。改性神经严重性评分（MNSS）

所述MNSS是复合马达（肌肉状态，异常的运动），感觉（视觉，触觉，和本体），以及反射的测试。在天1，11，19进行改性NSS评价，和27是在治疗期间和天35，43，和57，其是在随访期间，如在为了如前所述地级卒中后感觉运动神经赤字[20.]。

总体得分低于10分的动物被排除在研究之外。配对,双尾-治疗组与sham组比较。

2.3.3。前肢放置试验(FPT)

FPT，测试检测感觉运动缺陷以及纵裂感觉运动整合的严重损失，测定/刻划在天1，11，19，27，35，43，和57之后。Each rat was placed in an upright Plexiglas cylinder open at both ends and measuring 30 cm high by 20 cm in diameter placed open end down on a table (i.e., confining the rat being tested within). The number of each forelimb, or both forelimb placements on the wall of the cylinder, was recorded [21]。配对,双尾-治疗组与sham组比较。

2.4。大脑切片和染色

2.4.1。BrdU染色

溴脱氧尿苷(BrdU)按照Pharmaseed SOP #037 (BrdU处理)给药。在第4-8天和第32天，每日两次腹腔注射BrdU (IP)，间隔约8小时。剂量体积为1 mL/kg。

未使用BrdU对动物进行核磁共振测量。

On day 57 animals were anesthetized by Pental (60 mg/kg) and perfusion was performed as follows: 500 mL/kg of cold heparinized saline (10 Unit/mL), followed by 250 mL/kg of cold 4% Paraformaldehyde (PFA).

2.4.2。组织学和IF免疫组织化学(IHC)的组织收集和处理

收集了9只动物的大脑，并将其浸泡在4%新鲜制备的PFA中24小时。然后将脑组织转移到1.25%的PFA溶液中。

2.4.3。脑为IHC

大鼠大脑按10%蔗糖溶液顺序浸泡1小时后冷冻保存;20%蔗糖溶液1小时;30%的蔗糖持续一小时或直到大脑完全下沉(对于较大的大脑来说，下沉的时间可能更长)。最后，大脑被放置在50/50(30%蔗糖/O.C.T.植入介质)15分钟。大鼠大脑被系统地切成横截面。剖面被保存在24孔板中，并被划分为坐标以供以后定位。

所有玻片用BrdU IHC染色结合标记GFAP，巢蛋白，或双肾上腺皮质激素之一，采用自由浮动部分和一个病理学家检查。增殖得分等级从0到4日：0 =增殖级是可比的阴性对照组。1 =非常轻微的增殖，每HPF可使细胞数量增加1 - 25%。2 =轻度增殖，每HPF细胞数增加26-50%。3 =中度增殖，每HPF可使细胞数量增加51-75%。4 =强增殖多达76-100％的增加在每HPF细胞数目。

除BrdU外，GFAP、Nestin、double - cortin等标记均为双染色。评分如下:0 =完全没有阳性反应。1 =反应非常轻微(1 - 5个阳性细胞/ 20x HPF)。2 =轻度反应（每20倍HPF 5-10阳性细胞）。3 =中度反应(每20x HPF 10-20个阳性细胞)。4 =反应强烈(每20x HPF 20-50个阳性细胞)。

2.5。成像:MRI协议和分析

大鼠在MRI进行扫描，在四个时间点：tMCAO 1天后这是VLIFE治疗的前一天开始（TP1），第一次治疗（TP3）后的第一次治疗（TP2），1个月后两个星期，2这是最后的治疗会话（TP4）一个月后第一次治疗后几个月。

Three rats were scanned in a 7 T MRI system, Bruker, Germany using a quadrate head coil. T2 weighted imaging was performed in a T2 parameters: MSME sequence, TR = 3500 ms, 16 different TE (ms): 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, and 160, and spatial resolution:毫米。弥散张量成像(Diffusion tensor imaging, DTI)采用如下参数:TR/TE = 7500/25 ms, 4个EPI段，= 10/4.5 ms, 15 noncollinear gradient directions with a singlevalue shell at 1000 sec/mm²和一个图像与value of 0 sec/mm²(称为),2 - 3个重复。几何参数为30个0.8 mm厚度(脑容量)的切片，平面分辨率为 mm²(矩阵的大小和FOV of 16 mm²)。

光纤跟踪采用Explore DTI软件[22]。将得到的张量进行了本征分解。本征值用于计算FA地图[23]。束成像使用确定性（流线）纤维跟踪施加，在体素与FA终止低于0.15或以下道方向的改变高于20°。通过感兴趣的手动选择的种子区域（ROI）通过纤维作图。这些纤维被绘制为流线。得到的面具被覆盖在颜色编码的图像FA。整体四个光纤束绘制为在每个时间点各大鼠：胼胝体，内囊（左和右），穹窿-伞，和前连合（左和右）。平均FA和MD值在各纤维束萃取。进行脑的四个根光纤的跟踪系统的重建，采用先进的图像后处理分析：胼胝体，内囊，穹窿-伞，和前连合（未示出）。

图像分析使用MATLAB(©Mathworks, USA)计算T2弛豫图、ADC和FA图，使用BioImage软件。为了进行ROI分析，使用BioImage软件在MATLAB(©Mathworks，美国)中手动勾画感兴趣的水肿和区域(ROI)。在T2高的区域手工勾画水肿轮廓，并在左半球标记相应区域。提取所有轮廓区域的平均T2和DTI值。利用BioImage软件在T2图上进行各时间点轮廓测量脑室、水肿、对侧脑室容积。

3.结果

3.1。体重

体重各组与组之间无统计学差异显著上升。

3.2。临床试验

修正的反映运动缺陷恢复的NSS评分如图所示2。M2和M3处理组的感觉-运动功能缺陷的恢复显著增加(,，RESP）。

FPT的结果，如图所示3.，表明在M2和M3处理的大鼠的感觉运动赤字显著恢复（,，RESP）。这些结果支持，与图一起2结果，一个显著的临床改善。

3.3。MRI图像与分析

3.3.1。容量分析

水肿和心室容积分析如图所示4。

结果显示，与假手术(sham, M1)相比，治疗组大鼠(M2, M3)的水肿和右心室容积均明显减少。

数字5对不同时间点的MRI T2序列和ADC序列进行定量评价。如本节所述，在TP1-TP4时间点比较受影响半球和未受影响半球2.5。人们可以在未受影响的半球没有显著值这两个参数在所有时间点和所有的动物中观察到的变化，而受影响的半球，T2和ADC测量是在过去的两年时间点在未经处理的动物高。

数字6对3组大鼠在3个时间点的胼胝体白质系统进行重建。纤维追踪显示未处理的大鼠比处理的大鼠纤维更少。未处理大鼠M1脑胼胝体弥散性参数升高，处理大鼠M2、M3脑胼胝体弥散性参数降低。

数字7对3组大鼠(M1、M2、M3)穹窿-fimbria白质系统(a)进行重建，见表1）在3个时间点（TP1，TP2，TP4和根据章节所述2.5)。纤维追踪显示未处理的大鼠比处理的大鼠纤维更少。所有大鼠穹窿-fimbria的扩散系数均下降，但未治疗组大鼠不明显。

数字8呈现在表中描述的3个检查大鼠组（M1，M2和M3的内囊的白质系统（a）中的一个重建1）在3个时间点（TP1，TP2，TP4和根据章节所述2.5)。纤维追踪显示未处理的大鼠比处理的大鼠纤维更少。穹窿-伞的扩散参数在对照大鼠降低并且在处理的大鼠增加。

3.4。组织病理学研究

表2总结所有的组织病理学发现。每组5只动物中随机抽取3只进行组织病理学检查。

BrdU的在梗死的所有动物和脑室周围地区的强烈表达。GFAP仅在所有动物的梗死面积表示。粗略估计显示，转身出了BrdU阳性细胞的40-70％是GFAP阳性细胞。少数细胞巢蛋白阳性的两个和三个动物被发现分别从处理组M2和M3，在梗死和脑室周围地区。此外，发现少数细胞为DC是正的在脑室周围区域，在从M2组一只动物和从M3组之一。结果显示迁移到治疗组受灾地区的边缘是祖细胞。

4.讨论

在验证的概念这项研究中，我们研究了多区段低的强度和频率的电磁场的影响，在体内以少年大鼠中风模型，临床改善和大脑响应于刺激，使用MRI成像和组织学染色技术。

本研究表明，接受NSS和前肢放置试验的3.93 Hz和15.72 Hz治疗组的临床症状有显著改善，这些试验结果反映了感觉-运动功能缺陷的恢复。

脑磁共振成像显示，两组都有令人鼓舞的结果。检测到淋巴管周围水肿体积减少和侧脑室变宽(作为继发性脑萎缩的标志)。如图所示，与对照组相比，VLIFE处理后的纤维束成像显示出更高的白质完整性6,7和8。组织学结果支持神经再生过程，显示处理组中Nestin和Double-Cortin (DCX)阳性细胞，均为神经祖细胞标记物，如表所示2。

随着时间的推移，白质完整性的改善可能是由于轴突的生长和髓鞘完整性的增加产生了新的髓鞘。结果也可以解释为减少水肿，这是以前基于T2图像量化。髓鞘碱性蛋白的组织学染色可以进一步支持这些假说。

组织学研究结果,结合临床改善建议,即使新的脑细胞和新白质连接位于相似的大脑区域,改进的活动不同,支持假设每个神经系统作用于不同的频率,和被一个不同的增强处理相应的频率。这可能在未来导致个人专门的治疗方案作为中风后康复程序的一部分。

初步调查结果在这里提出，进一步的研究可能允许更好地了解有关的脑卒中VLIFE电磁场处理及其潜在增强大脑恢复机制。

我们的数据可能表明，VLIFE治疗可以促进中风后神经元的可塑性，从而促进感觉运动的恢复。

VLIFE和VLIFE treatment正在申请专利。

泄露

这项研究由BrainQ有限公司赞助。

利益冲突

亚龙西格尔博士是VLIFE和CEO的发明者和奠基人BrainQ的。李尔西格尔，诺亚布雷格曼博士和Ariela阿尔特博士被BrainQ使用。博士添马舰布鲁门菲尔德 - 卡齐尔和埃弗拉特萨松博士通过生物影像使用。弗拉基米尔Poliansky先生，伊曼纽尔勒布博士和阿哈利维教授被Pharmaseed有限公司使用

作者的贡献

Y. Segal和L. Segal发展了理论和实验设计;Y. Segal是VLIFE设备的发明者，开发了治疗方案;T. Blumenfeld-Katzir和E. Sasson进行了MRI扫描并进行了分析;V. Poliansky, E. Loeb, A. Levy进行了临床卒中模型，监督动物护理，进行了临床试验，并分析了临床结果。N. Bregman写了论文的初稿，A. Alter修改了论文并写出了最终版本。

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版权

Y. Segal等人版权所有这是一篇开放获取的文章创作共用署名许可，其允许在任何介质无限制地使用，分发和再现时，所提供的原始工作正确的引用。