血管紧张素拮抗的神经血管保护作用基质金属蛋白酶活性的作用

抽象

背景与目的。氧化应激和基质金属蛋白酶(MMP)活性被认为是缺血性脑卒中后早期血管损伤的关键介质。有点令人惊讶的是，血管紧张素II型1受体(AT1)阻滞剂坎地沙坦，已被证明可以在提供神经血管保护的同时，急剧增加MMP活性。我们的目的是确定基质金属蛋白酶(MMP)和硝化应激对实验性中风中血管紧张素阻断作用的贡献。方法。Wistar鼠(n = 9–14/group; a total of 99) were treated in a factorial design with candesartan 1 mg/kg IV, alone or in combination with either a peroxynitrite decomposition catalyst, FeTPPs, 30 mg/kg IP or GM6001 50 mg/kg IP (MMP inhibitor). Neurological deficit, infarct, size and hemorrhagic transformation (HT) were measured after 3 h of middle cerebral artery occlusion (MCAO) and 21 h of reperfusion. MMP activity and nitrotyrosine expression were also measured.结果。当单独施用时坎地沙坦减小梗塞面积和HT（）并且与FeTPPs组合（)。GM6001单独给予时没有显著影响HT，但坎地沙坦联合导致增加HT（)和神经系统评分恶化()。结论。尽管增加MMP活性，可能通过抗氧化机理坎地沙坦急性施用减少中风后的伤害。

1.介绍

缺血性中风，在一个主要的脑血管血流障碍，仍然是成人残疾和死亡在美国的主要原因[1]。由于其复杂的病理，一个主要的研究和临床优先是发展治疗干预的缺血性脑的潜在机制的理解。

缺血再灌注引起一系列的病理生理过程，导致进一步的脑损伤。自由基、氧/氮(ROS/RNS)的积累，不仅增加脑组织对再灌注诱导的损伤的敏感性，还会引发大量的分子级联反应，导致血脑屏障(BBB)通透性增加、脑水肿、出血和炎症，以及脑死亡[2,3.]。包括过氧亚硝酸盐(ONOO -)在内的RNS作为自由基的重要组成部分，在脑缺血再灌注损伤过程中发挥重要作用。缺血再灌注导致缺血脑产生过氧亚硝酸盐，引发大量分子级联反应，导致血管损伤。在体外，过氧亚硝酸盐强烈激活基质金属蛋白酶(MMPs) [4,5]。脑缺血后微血管中过氧亚硝酸盐的形成与MMP-9的表达同步[2]。基质金属蛋白酶，尤其是MMP-9和MMP-2，是血管机能障碍的重要介质/冲程后重塑[6- - - - - -8]。最近的研究提示过氧化亚硝酸盐分解催化剂（FeTPPS）的施用降低脑缺血后的梗塞面积，MMP活化和神经血管损伤[9,10]。

AT1受体的阻断已经出现，以防止在实验性卒中神经元和血管损伤的有效策略[11- - - - - -13和其他血管事件的风险[14]。我们已经证明，坎地沙坦，一种AT1受体阻滞剂，具有神经保护和血管保护作用，并在永久性和暂时性中风模型中改善功能结果[11,15- - - - - -17]。坎地沙坦的这些有益作用是通过多种不同机制介导的，包括上调eNOS表达[18]，生长因子的表达的上调[12，以及改善氧化应激[19]。此外，我们最近证明了坎地沙坦在卒中后降低蛋白质硝化(硝基酪氨酸水平)的能力，以及在卒中细胞模型中对过氧亚硝酸盐处理的反应，再次暗示了其抗氧化和抗逆转作用[20]。不幸的是，当一个大型临床试验的负面结果发表坎地沙坦为脑卒中患者急性治疗策略的开发被叫停[21]。作者总结说，服用该药所达到的降压效果可能解释了所见益处的缺乏。需要确定在实验模型中使用坎地沙坦时所证明的强健血管保护作用的机制，以便寻求达到相同目的的替代策略。

坎地沙坦可减少实验性中风后出血的形成，但可显著增加基质mmp -2和-9的活化[15,17,22]。即使在组织型纤溶酶原激活剂（tPA），其中MMP-9活化已经与增加的出血性转化相关联的处理的栓塞性中风（HT）和动物中的结果恶化[23,24]和人类[25,26]，我们已经表明坎地是急性血管保护[22]。研究继续表现出各种各样的机制和途径，通过该坎地沙坦中风提供神经血管的保护;但是，仍然有许多需要解决的问题。为了检查机构和MMP活化和酪氨酸硝化在实验性卒中血管紧张素封锁的神经血管保护作用的贡献（图5），我们着手确定的（1）的影响单独的和与所述过氧亚硝酸盐分解催化剂，FeTPPs，和（2）组合坎地单独或与广谱MMP抑制剂组合坎地沙坦，GM6001，对梗死面积，HT，和缺血性卒中后神经功能缺损。

2。材料和方法

2.1。动物与治疗方案

Wistar雄性大鼠(270-300 g;根据查理·诺伍德VA医疗中心的机构动物护理和使用委员会(IACUC)批准的程序使用。

这项研究是在两个独立的实验进行。在两个实验中，所有的动物接受坎地沙坦或车辆与另外的化合物（FeTPPs或GM6001）或他们的车辆的腹膜内（IP）注射的静脉内（IV）注射（盐水和DMSO，RESP）。Experiment I was carried out to evaluate the effects of candesartan alone and in combination with FeTPPs on HT, infarct size, edema, functional outcome, and MMP activity at 24 h after tMCAO. The groups were transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO) + vehicle treatment group I (vehicle only;), tMCAO + candesartan (1 mg/kg) treatment group II (candesartan only;， tMCAO + FeTPPs 30 mg/kg IP处理III组(仅限FeTPPs;），以及tMCAO +坎地沙坦+ FeTPPs组IV（C和+ FeTPPs;)。实验II进行与广谱MMP抑制剂，GM6001（Calbiochem公司）单独和组合评估坎地沙坦的影响。基团是短暂大脑中动脉栓塞（tMCAO）+赋形剂（二甲亚砜 - DMSO +盐水）治疗组I（仅媒介物;), tMCAO + candesartan (1 mg/kg in saline) + DMSO treatment group II (candesartan only;)、tMCAO + GM6001 (50 mg/kg, DMSO, IP)处理组III(仅限GM6001;），以及tMCAO +坎地沙坦+ GM6001治疗组IV（C和+ GM6001;)。

2.2。大脑中动脉闭塞（tMCAO）

所有动物吸入2%异氟醚麻醉。采用脑内缝合中动脉闭塞(MCAO)模型诱发脑缺血[27]。The right MCA was occluded with a 19–21 mm 3-0 surgical nylon filament, which was introduced from the external carotid artery lumen into the internal carotid artery to block the origin of the MCA. The animals were anesthetized for only 10 min for the surgical procedure. The suture was removed after 3 h of occlusion and the animals were returned to their cages. At reperfusion, a single dose of 1 mg/kg candesartan or saline control was given intravenously through a tail vein at a volume of 1 mL/kg. The duration of occlusion (3 h) and reperfusion (21 h) and the dose of candesartan (1 mg/kg) were chosen based on our own published data demonstrating reliable vascular injury in this model and robust neurovascular protection with candesartan [11,16,17]。

2.3。神经系统检查

All animals underwent neurobehavioral testing before MCAO and at 24 h after MCAO. Tests that were used included Bederson score, beam walk, and paw grasp and were performed in a blinded fashion.

Bederson得分。Neurological function was measured before reperfusion and at 24 h (just before animals were killed) using the Bederson score [28]。动物们被分为0-3分。动物被给予一个点，为以下每一项:前肢屈曲时，尾巴悬吊;侧推阻力减小;和侧盘旋。3分符合MCAO。只有再灌注时得分为3的动物才被纳入梗死面积、血红蛋白和神经功能的分析。走横梁。Beam walking ability is graded 0 for a rat that readily traverses a 2.4 cm wide, 80 cm long beam to 3 for a rat unable to stay on the beam for 10 seconds.爪子抓。Bilateral forepaw grasp measures the ability to hold onto a 2 mm diameter steel rod, graded 0 for a rat with normal forepaw grasping behavior to 3 for a rat unable to grasp with the forepaws.

2.4。评估梗死面积、水肿和血红蛋白(Hb)含量

At 24 h after the onset of MCAO, the animals were anesthetized with ketamine 44 mg/kg and xylazine 13 mg/kg i.m. (cocktail), perfused with saline, and sacrificed and the brains were removed. The brain tissue was sliced into seven 2 mm thick slices in the coronal plane and stained with a 2% solution of 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, USA) for 15–20 min. Images of the stained sections were taken. Grossly visible infarction zones were quantified using Image J analysis software (Image J, NIH) and corrected for edema. Edema was quantified as the difference in area between the hemispheres and expressed as a percentage of the contralateral hemisphere.

酶联免疫吸附法(ELISA)切片的缺血半球和非缺血半球分离处理。将梗死中心的切片均质并收集上清液后，使用HB ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，根据说明书(BioAssay systems, Hayward, CA, USA)测定血红蛋白含量。

2.5。明胶Zymography

Substrate-specific zymography for determination of gelatinolytic activity of MMP-9 and MMP-2 was performed on brain homogenates taken 24 h after MCAO. The concentration of protein was adjusted equally in all of the tissue samples. Samples were then mixed 1 : 1 with loading buffer (80 mmol/L Tris-HCl [pH 6.8], 4% SDS, 10% glycerol, and 0.01% bromophenol blue) and left standing for 10 min at room temperature. Proteins were separated by electrophoresis in a 10% SDS-PAGE gel containing 0.1% gelatin at 125 volts constant current. Gels were then washed to remove SDS with 2.5% Triton X-100 (Sigma) for 1 h and incubated at 37°C with developing buffer (50 mmol/L Tris-HCl [pH 7.5], 10 mmol/L CaCl₂，0.02％的NaN_3.) 36小时。考马斯蓝(BioRad) R-250染色30min, 1 h后可见酶条带，甲醇:乙酸:水(50:10:40)三种变化去除条带。使用Image J分析软件(Image J, NIH)对凝胶进行扫描，并对活性条带进行量化。

2.6。硝基酪氨酸槽印迹

硝基酪氨酸(NT)免疫反应性的测量作为一个指标，过氧化亚硝酸根形成的槽blot分析。脑匀浆(20μ对于免疫印迹实验制备克）固定在使用狭缝印迹微滤单元PVD膜。用5％封闭脱脂乳后，膜与自Calbiochem抗硝基酪氨酸抗体一起温育，并用超级皮尔斯信号套件可视化。带的强度通过GelPro软件进行分析。

2.7。统计分析

数据以平均值±标准差表示。方差方差假设的正态性和同质性被评估和一个秩变换被使用，如果需要。数据分析采用2坎地沙坦(车辆对车辆)×2 FeTPPs或GM6001(车辆对车辆)方差分析，并使用SAS 9.3 (SAS Institute, Inc.， Cary, NC)进行交互。在= 0.05时判定有统计学意义。

3.结果

3.1。坎地沙坦模仿过氧清道夫在tMCAO后减少硝基酪氨酸

硝基酪氨酸（NT）是一氧化氮损伤自由基的氧化在多种疾病状况包括中风的产物[29]。FeTTPS管理显著（) reduced NT at 24 h after the onset of MCAO (Figure4)。独也显著坎地沙坦（)降低了NT，但联合用药与单独使用FeTTPs无显著差异。在GM6001实验中，仅坎地沙坦具有显著性(与所有组相比，减少了NT，但使用GM6001时没有减少(图3)1)。

3.2。GM6001减弱的坎地沙坦诱导MMP活化MCAO后

与我们之前的研究一致[16,17]，MCAO后明胶酶谱在赋形剂处理过的动物显示上调MMP-9和MMP-2与假手术对照组相比。正如我们以前报道17]，在再灌注坎地沙坦单一剂量显著增加MMP-9的活性（)出现在脑缺血的半球。正如预期的那样，GM6001管理显著降低了MMP-2和-9活性() at 24 h after the onset of MCAO (Figure2)。该组合的作用是中间，揭示GM6001对MMP-9活性的上调钝由于坎地沙坦的能力。

此外，我们和其他人报道[9,三十]，过氧化亚硝酸盐的分解催化剂防止脑缺血后MMP的活化。我们再次发现FeTPPs减少MMP-2和-9活化，单独和坎地沙坦的组合（图2)。

3.3。单独使用坎地沙坦和联合使用FeTPPS可改善tMCAO术后的功能结果

Both candesartan and FeTPPs significantly reduced bleeding (HT) at 24 h ()和FeTPPs单独或联合使用均可减少梗死面积()。与盐水治疗组相比，所有三个治疗组的行为都有所改善()。有坎地沙坦和FeTPPs（图之间没有检测到显著相互作用4)。坎地沙坦，然而，当与GM6001或它的车辆，DMSO相结合，造成了更高的显著梗塞大小（)和出血(HT)增加的趋势(图)3.)。这是表现在显著恶化功能结局神经得分方面（)及爪子抓法(）在坎地沙坦处理组（图3.)。任何治疗组的水肿形成均无显著差异。

4.讨论

血管紧张素受体拮抗剂的神经保护作用在实验性脑缺血是有据可查的[13，但它们对血管有强大的保护作用[11,17,31]似乎与增加MMP-2和MMP-9活性的表现出来的能力不相容17]。这里报道的实验试图确定坎地沙坦早期血管保护作用的机制，以便开发其他不具有降低血压特性的干预措施。

缺血再灌注会增加活性氧含量，包括超氧自由基[32]和一氧化氮（NO）[33]。缺血性卒中后MMPs的氧自由基激活触发器[34]。没有超反应形成过氧化亚硝酸盐。氧气 - 葡萄糖剥夺或再灌注后缺血的增加在脑血管内皮细胞和神经元[过氧亚硝酸盐35,36]。过氧亚硝酸盐比过氧化物更容易透过脂膜[37]并且更有毒的[38]。在体外，过氧亚硝酸盐强烈激活基质金属蛋白酶，包括MMP-9和MMP-2 [4,5]。缺血再灌注后，通过破坏微血管的完整性[过氧化亚硝酸盐的形成上微血管导致MMP-9的激活和神经血管损伤（出血和水肿）2]。此外，FeTPPS的施用降低MMP的活化和神经血管损伤通过脑缺血后decompositing过氧亚硝酸盐水平[9]。在本研究中，我们测试了单独或与缺血性卒中后坎地沙坦组合的过氧化亚硝酸盐分解催化剂的治疗是否使神经血管损伤。我们观察到，坎地模仿过亚硝酸盐的清除剂减少硝基酪氨酸。

广谱MMP抑制剂，如GM6001，在实验工作和治疗使用的效用已经严重限制了其水的不溶性。正如我们在这里报告的实验中所做的那样，在DMSO中溶解药剂的需要给载体本身带来了意想不到的后果。DMSO是一种非特异性自由基清除剂，已知具有神经保护作用[39]，所以涉及其作为溶剂使用的任何调查要求，我们已经做了DSMO对照组。DSMO对缺血后脑血管的影响目前还不太清楚。After 1.5 h of MCAO and 48 h of reperfusion in Wistar rats, DMSO reduced blood-brain barrier (BBB) disruption as measured by MRI [40] but in Sprague-Dawley rats subjected to 2 h of MCAO and 2 h of reperfusion, DMSO significantly reduced BBB integrity [41]。在我们的实验中，单独DMSO并没有对任何梗死面积或HT可测量的保护作用。然而，当DMSO同时IP施用如坎地沙坦IV导致增加在梗塞尺寸和恶化neurologic结果。如果我们已经研究了GM6001坎地沙坦的唯一组合，相比于单独地沙坦和生理盐水，我们会得出结论，坎地沙坦的血管保护作用是依赖于MMP激活。在DMSO器的使用，然而，清楚地表明，这种情况并非如此。GM6001和坎之间的负相互作用是完全由其中将其溶解在有机溶剂中进行说明。坎地沙坦的早期神经血管保护作用，在再灌注给药，尽管会出现，不是因为，在MMP活化的增加。

ARB急性保护作用的一个更可能的候选机制是其已知的抗氧化作用[42,43]。在本研究中，过氧亚硝酸盐分解催化剂FeTPPs在再灌注时提供了有效的神经血管保护，这与其他报道一致[9,10]。加入FeTPPs的，虽然有效独自一人，没有添加与坎地沙坦看到的好处。

在这项研究中，我们发现坎地沙坦的神经血管保护作用与单独使用和联合使用FeTPPs的效果是一致的，并得到了维持。尽管FeTPPs能够减少MMP的激活，但仍发生了这种情况。然而，当坎地沙坦与GM6001或其载体DMSO联合使用时，坎地沙坦的有益作用消失了，表现为梗死面积和HT的增加以及神经系统预后的恶化。尽管在接受gm6001治疗的组中MMP-9活性有效降低，但病情仍在恶化。

我们已经证明坎地沙坦在脑血管系统中的促血管生成和营养作用是通过AT2刺激介导的[44]。随后，我们提出了长期复苏增强后坎地沙坦[16]可以用直接AT2激动剂来实现，从而避免AT1受体阻断的降低血压作用。到AT2激动作用的发展为急性缺血性中风的治疗策略的一个重要的限制可能是缺乏急性抗氧化性能[的43]，虽然其他急性好处，可以实现和正在接受调查。这项研究集中在急性期治疗缺血性损伤，并没有包括长期随访。进一步的调查正在进行，以确定负责坎地沙坦的长期利益和中风后血管紧张素信号的其他调节机制。

总之，坎地沙坦的急性神经血管保护作用在MMP活性增加的情况下仍然存在，而且可能至少部分归因于急性抗氧化作用。坎地沙坦给药后MMP活性的增加可能对促进急性期后的长期恢复是必要的。

泄露

Susan C. Fagan是辉瑞公司的顾问，并得到了辉瑞公司的资助。内容不代表退伍军人事务部或美国政府的观点。

利益冲突

作者宣称没有关于本文的发布利益冲突。

致谢

这项研究部分得到了退伍军人事务评估(SCF, BX000891和AE, BX000347)和NIH-RO1 (SCF, NS063965;AE, NS054688;安倍,EY022408)。

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