实验使用的预处理血管内皮生长因子的影响在中风和蛛网膜下腔出血

文摘

血管内皮生长因子(VEGF)刺激血管生成被证实是一个潜在的新治疗方法的治疗缺血性血管疾病。本研究的目的是检查是否转染前VEGF主要中风的发生(第一部分)和实验性蛛网膜下腔出血后脑血管痉挛(SAH;第二部分)发展神经保护品质。总共25(第一部分),26日(第二部分)的大脑进行了分析,分别。在第一部分,显著减少VEGF-treated中风梗塞体积的动物(减少43%,)可以被检测出来。在第二部分,重要的血管痉挛是诱发出血组。灌注microperfusion分析,一个重要的血管可以被探测到,而对macroperfusion没有显著的影响可以被探测到。组织学检查没有观察到梗死VEGF-treated SAH组和sham-operated组。小梗死的vasospasm-induced小病变可以发现在控制向量转导组和saline-treated集团。目前的研究表明系统性的预处理影响肌内注射VEGF在动物主要的中风和诱导SAH后严重血管痉挛。

1。介绍

脑血管痉挛和延迟脑缺血后二次发病率和死亡率的主要部分严重的蛛网膜下腔出血(SAH) (1- - - - - -5]。尽管当前的治疗策略,有关永久性残疾的速度估计10%到20% (6- - - - - -9]。

血管内皮生长因子(VEGF)是参与神经发生,抑制细胞凋亡,学习和记忆10]。它可以直接促进神经保护,但首先VEGF是负责血管生成的主要因素,讨论了一种间接神经保护。VEGF表达增加在人类和动物脑缺血(11]。然而,内源性VEGF似乎完全不足以保护大脑免受缺血性损伤。有趣的是,它可以表明,外源性VEGF诱导血管生成管理变化,导致减少脑缺血性损伤(12,13]。为此采用VEGF小说作为一个潜在的治疗方法治疗缺血性血管疾病,特别是在缺血性中风(14- - - - - -18]。

本实验研究的目的是检查系统超表达的VEGF的影响之前,中风和SAH关于脑梗塞,血管痉挛和灌注。

2。材料和方法

本研究进行了严格按照指南中建议的实验动物保健和使用美国国立卫生研究院。实验研究是审查和批准的当地动物实验委员会雷克林豪森、德国(批准号8.87 50.10.34.08.246)。所有入侵程序下进行腹腔应用盐酸甲苯噻嗪和氯胺酮全身麻醉,和所有正在努力减少痛苦。动物们被安置在一个光/暗周期与免费的食物和水。

2.1。建筑的向量和转导

DNA转导是执行VEGF-containing表达载体。初始向量(pcDNA3.1 / B /;英杰公司、德国卡尔斯鲁厄)首次与EcoRI消化。EcoRI VEGF克隆(降序从全/ VEGF向量,请从研究所提供,Planegg-Martinsried,德国)被插入。控制动物被注入一个空的表达载体(pcDNA3.1 / B;英杰公司、德国卡尔斯鲁厄)。向量序列分析证实了完整性。大规模制备的质粒DNA进行EndoFree GigaPrep(试剂盒、希尔登,德国)。解决了DNA在0.9%无菌生理盐水和存储在整除−20°C。

每周基因转移到前胫骨肌肉与100年进行了三次μ每腿在一卷50 g的DNAμL生理盐水。

2.2。短暂性大脑中动脉闭塞

第一部分确定VEGF在中风保护的影响,以验证VEGF的影响主要中风。三组雄性Wistar鼠加权250 - 275 g ()收到肌肉内注射VEGF的矢量,控制向量,或盐水为三次每隔七天。七天过去的基因转移后,老鼠进行了45分钟的短暂性大脑中动脉闭塞(tMCAO)连续监测的激光多普勒流(沼泽仪器,阿,英国)19]。体温维持在°C。再灌注是由消除灯丝。动物牺牲后24小时再灌注时间。

2.3。双SAH模型大鼠

在第二部分80雄性Wistar鼠加权250 - 275克。动物被随机分为四组:组(1)接收肌内注射plasmid-containing VEGF,(2)接收免费VEGF质粒组,组(3)生理盐水组和组(4)sham-operated组。

在组1和2 VEGF或VEGF自由向量注入21日14和7天前血管痉挛的感应。

一周后最后一个基因转移(VEGF向量,控制向量和钠)双重血液注入引起的血管痉挛是小脑延髓池如前所述[20.- - - - - -22]。动物容易定位,atlantooccipital膜手术暴露出来。微观下的小脑延髓池被刺破使用27-gauge插管,和0.2毫升的脑脊液是送气音的第一,紧随其后的是注入0.2毫升的自体血。动物被放置的头10分钟,以避免泄漏注入血液,和手术伤口被关闭。这个过程是重复2天。在动物属于sham-operated组,atlantooccipital膜被曝光;0.2毫升的脑脊液是吸气和注入的。动物被定位头10分钟,手术伤口被关闭。这个过程重复了2天。在体温的过程控制和维护°C。

神经条件评估每天根据修改Bederson分级规模绕到一边(23]。

2.4。脑血管造影术和评价

血管造影进行五天之后直接血液注入小脑延髓池的两倍。

血管造影研究腹腔内全身麻醉下进行如上所述。定位后动物仰卧位,颈正中切口暴露双边颈总动脉。如前所述动脉是挖掘使用小套管连接microcatheter (27-gauge针,小偷14 microcatheter;美国佛罗里达州迈阿密心脏的血管内,湖泊,),和血管造影下进行自动化,控制注入总共0.1毫升的造影剂(Ultravist 300;先灵葆雅AG),柏林,德国;Integris虫;飞利浦医疗系统、最佳、荷兰)20.]。血管造影是重复四次达到最好的质量。一方面数码影像测量,软件基础,评估大型容器直径的减少所述前(24]。另一方面感兴趣的特定地区的低密度结构的可视化(力拓)决心为了获得信息关于使用灌注的最低强度投影(MinIP) [25]。从一开始就在时间方向MinIP动脉相进行了实质阶段。算法使用的所有数据预测感兴趣的卷到观察平面上。在对比剂到达之前,一个人确定基准图像和过滤来减少背景信息(OsiriX诉3.8.1,http://www.osirix-viewer.com/)。主要roi(包括血管摄影可见主要血管,例如,a carotis interna)和较小的皮质roi(血管改变的不可见的主要血管,例如,区域之间的a . carotis interna下结的大脑媒体)定义。由此产生的二维的图像代表contrast-perfused血管/组织。测量平均灰色水平的上述定义roi代表或高或低灌注。这些值最小的强烈的投影与灌注血管的数量具有负相关性。

血管造影后的动物被牺牲的腹腔内注射致命剂量的戊巴比妥钠(200毫克/公斤体重,赛诺菲-安万特,法兰克福,德国)。

2.5。组织学

一个12μm切片机是用于甲苯基紫染色和苏木精和伊红和TUNEL分析。日冕部分额叶、顶叶、枕叶脑被送往检测缺血性病变的形态学改变。在第1部分中记录的部分是通过数码相机。大脑梗塞面积和面积的概述了手动和体积计算,软件基础,在毫米³(徕卡QWin、徕卡、德国)。第2部分中每个部分的梗死灶是以前公布的评估和分为三组:(1)没有梗塞,(2)小梗死,和(3)领土梗塞[26]。第一部分检测凋亡细胞的原位检测细胞死亡工具包(罗氏诊断,曼海姆,德国)基于终端原位脱氧尿苷三磷酸尼克末端标记(TUNEL)技术使用。

3所示。结果

3.1。第一部分:减毒瞬态局部脑缺血后缺血性脑损伤

第一部分主要中风显示VEGF明显减少梗塞体积VEGF-treated动物(减少43%,,Mann-Whitney测试,图1)。五个动物由于蛛网膜下腔出血和去世两个中风的结果。25大脑进行分析(9 gene-transferred组10在对照组,生理盐水组和6)。TUNEL染色显示三组无显著差异。

3.2。第二部分

总共有80只动物。24动物死后立即注射双出血和12实验过程中。临床评估并没有发现延迟神经赤字超过5天观察期轻偏瘫。所有的动物都牺牲在第五天在最初出血。

3.2.1之上。血管造影分析Macroperfusion

总体而言,176年44血管造影检查属于4实验动物组。血管造影评估是不可能在18个动物由于技术问题或死亡率血管摄影本身。96系列在26个动物技术足够了。其中最高的血管造影对比每只动物被选为进一步评价由一个独立的观察者(SM)失明组。

显著减少动脉直径是诱导双出血模型(SAH组与虚假的组相比,,图2)。三个SAH组中,没有显著差异的相对颅内充填强度定义为macroperfusion (SAH / VEGF与长官/控制相比,;SAH / VEGF与SAH /生理盐水,,以及)。

3.2.2。血管造影分析Microperfusion

在26个动物,一个完整的动脉,静脉期(循环时间)(图进行3)。比较VEGF-treated SAH组(组1)控制向量治疗SAH组(组2)和NaCl-injected SAH组发现显著差异(主要投资回报:和;皮质ROI:和)。VEGF-treated和生理盐水组之间的差异没有SAH未达到统计上的显著水平(主要投资回报:;皮质ROI:)。

3.2.3。形态学检查

肉眼可见的病理评价显示清晰的残差SAH基底水池在26个动物属于SAH组和没有sham-operated组。组织学检查没有观察到梗死VEGF-treated组和sham-operated组。小梗死的vasospasm-induced小病变可以发现在控制向量转导集团()和saline-treated集团()(图4)。

4所示。讨论

4.1。第一部分

分析在实验性脑缺血治疗效果通常tMCAO模型(27,28]。因此发达VEGF基因最初是定义良好的条件下进行这个实验预计显然缺血性病变。VEGF水平不同,因此VEGF免疫组织化学分析没有实施,但对减少梗死体积明显影响VEGF-treated动物可以显示(减少43%)。基于这些结果假设肌内注射VEGF的脑缺血动物模型的神经保护作用。

4.2。第二部分

4.2.1。准备SAH模型

使用双出血模型,因为更高的血管痉挛的影响相比其他SAH模型描述(29日]。正如前面发表的,可衡量的血管收缩的最高水平是诱导感应的SAH后5天20.,30.]。因此,第五天被选为血管造影研究。死亡率在目前的审判是30%,这与先前发表的研究中使用双出血模型大鼠(20.,31日,32]。

4.2.2。宏观和Microperfusion功效

血管造影评价小型船舶的老鼠是复杂的,因此不同的技术报告(33- - - - - -35]。在目前的研究中,一个先前描述的基于软件的测量工具,分析脑小血管是用来检测血管痉挛24]。使用这种技术,显著诱导的血管痉挛SAH组可以被探测到,这是符合先前发表的研究(20.]。

VEGF-treated组大脑血管口径的显著差异(脑macroperfusion)相对于其他SAH组没有可衡量的。相比之下,大脑microperfusion使用血管密度的分析技术如前所述透露VEGF-treated组显著增加(25]。一种解释可能是由于VEGF neoangiogenesis的感应。这个观察结果符合实验动物脑缺血模型(后35]。两个主要的局限性必须提到。首先,在DSA不是测量血压,因此可能影响时间达到峰值和脑血流量值。然而,检测实际hyperperfusion或低灌注灌注成像灌注CT或灌注MRI是必要的。第二,限制是对比剂的浸泡时间。自动注射促进标准化的条件在我们的设置。

4.2.3。形态的影响

与长官在小动物实验模型的一个问题是缺乏明确的形态缺血性损伤所以第一部分为了评估执行效果主要中风(22]。同样,在目前的研究中,只有少数缺血性地区参与SAH组可以被探测到。

4.3。肌肉内的VEGF和限制试验的效率

缺氧本身诱导VEGF表达增加脑缺血的大脑区域,但这内源性VEGF分泌不足完全保护脑损伤(36]。基于显著减少梗塞体积的第一部分假设肌内注射VEGF的脑缺血动物模型的神经保护作用。

短半衰期和穷人似乎穿透血脑屏障的影响在这个模型低于经常描述(13,27]。这些发现证实了其他调查人员证实,高剂量的静脉输液后VEGF栓塞缺血诱发的脑血脑屏障的漏动物模型(37]。有争议的是,减少水肿形成后VEGF应用中风模型尽管漏血脑屏障被描述的38]。VEGF的详细活动,除了已知的neoangiogenesis和促有丝分裂的活动在中风和特别是长官,因此仍然主要是未知的。

尽管VEGF政府似乎有前途,必须提到的几个缺点。VEGF蛋白体内是不稳定的,它有一个短的半衰期。蛋白质直接植入到缺血性病变通过持续释放运载系统或焦病毒介导的超表达可能立即保护周围神经组织,和,因此,直接植入似乎是一个不错的方法定义缺血脑损伤(27,39]。在SAH,延迟脑缺血和梗死相关已知广泛地发生。因此,建议的治疗,治疗的目标应该解决整个大脑。结果,使用DNA基因转移系统增加VEGF可以讨论作为一个潜在的有益方法。

慢性阶段内的血管痉挛,脑微血管循环适应缺氧与血管生成和扩张(15]。然而,建议vasoconstrictive因素之间的关系(免费的血红蛋白,激活endothelin-1和氧自由基)通过物质(不)是不安的样子,和neoangiogenesis可能就太迟了。在这项研究中没有影响力的VEGF vasoconstrictive直接或通过元素可以被探测到。相反,显著增加灌注可被检测到。然而,无意义的趋势较小扩展缺血性病变的组织学检查可以确定,并显著增加microperfusion检测通过血管造影方法尽管证明血管痉挛。在此背景下的间接神经保护的血管生成似乎有很高的重要性。

upregulation VEGF可以触发这个血管新生血管痉挛的早期。这意味着预处理大脑缺血性事件即将通过改善血液供应。

目前的研究表明系统性的预处理影响VEGF注射诱导后大脑microperfusion和缺血性病变动物严重血管痉挛。这些结果证明进一步调查特别是关于方法的应用,注射剂量的VEGF,预处理的时间间隔,免疫组织化学检查(VEGF、CD 34),和详细的测量的行为变化。

信息披露

d . Hanggi边缘疗法是一种科学官和科德曼的顾问。作者没有财务或个人利益描述的材料和设备。

利益冲突

没有作者的利益存在冲突。

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