Lentiviral-Mediated PDE4D基因的shRNA沉默抑制血小板源生长因素鼠主动脉平滑肌细胞增殖和迁移

文摘

磷酸二酯酶4 d (PDE4D)是磷酸二酯酶的大总科的一员。已发现PDE4D多态性与缺血性中风。血管平滑肌细胞的增殖和迁移(VSMCs)在动脉粥样硬化的发病机制中扮演重要角色。在这项研究中,感染的VSMCs lentivrius粒子携带shRNA针对PDE4D显著抑制血小板源生长因素VSMC增殖和迁移,和抑制效果不与全球细胞内营的水平。我们的研究结果表明,PDE4D VSMC增殖和迁移的重要作用可以解释其遗传易感性缺血性中风。

1。介绍

中风,一种复杂的疾病,第三常见的死因仍是仅次于心脏病和癌症和残疾的主要原因在发达国家以及中国。缺血性中风占80%的中风。环境因素和基因变异导致中风。虽然遗传缺陷几件物品已经被确认在罕见形式的中风,常见形式的缺血性中风的遗传原因仍然是难以捉摸的。最近,PDE4D已被确定为第一个基因与中风的常见形式(1]。然而,随后的研究已经产生了不一致的结果协会(2- - - - - -9]。由于变量的结果,完成了荟萃分析的基因,这也吸引了相互矛盾的结论(10- - - - - -13]。种族差异可能负责不一致的结果。因此,实验研究的函数PDE4D将有助于揭开这个谜团。

PDE4D属于一个大总科唯一的pde营地和关键信号转导分子的水解酶在多种细胞类型,包括血管平滑肌细胞。十一个家庭(PDE1-PDE11)已确定在pd的大总科14]。有四个主要的家庭中发现VSMCs: PDE1, PDE5 PDE3, PDE4。PDE1 PDE5主要负责cGMP-hydrolyzing活动,而PDE3和PDE4导致大多数cAMP-hydrolyzing活动(15,16]。PDE4有四个亚科:PDE4A 4 b, 4 c、4 d,不同局部细胞之间(17]。PDE4D广泛表达在多种细胞(18,19]。在动脉VSMCs, PDE4D主导性表达和降低第二信使营(20.]。最近的研究表明,PDE4D可能在动脉粥样硬化有至关重要的作用。例如,PDE4D很大程度上是与动脉粥样硬化相关中风等心原性的和颈动脉中风1]。此外,减少营水平被发现与增加血管平滑肌细胞的增殖和迁移,中央事件在动脉粥样硬化的发展21,22]。更重要的是,PDE4拮抗剂可以显著抑制平滑肌增殖在大鼠颈动脉balloon-injury模型(23- - - - - -25]。然而,他们使用的试剂不具体针对PDE4D抑制剂,这使得它很难确定的功能角色PDE4D同种型。因此,遗传方法专门针对PDE4D基因如使用shRNA击倒它的表达式将需要解决这个问题。

目前的研究调查的差别是否对这些PDE4D可以抑制VSMC增殖和迁移。慢病毒粒子携带小发夹RNA对PDE4D应用特别减少PDE4D表达鼠主动脉平滑肌细胞。我们发现PDE4D沉默在大鼠主动脉平滑肌细胞明显抑制其增殖和迁移引起的血小板源生长因子(PDGF),抑制并不是与全球细胞内营的水平。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

人类hek - 293 - t细胞系来自美国类型文化集合(写明ATCC)和生长在RPMI 1640补充10%的边后卫(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)。

VSMCs孤立从胸降主动脉的男性Sprague-Dawley老鼠重约150克,形态学和免疫组织化学特点如前所述[26]。细胞生长在杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM), 10%胎牛血清的边后卫,1更易/ L谷酰胺,100 U /毫升青霉素,100在37°C / g / mL链霉素,5%的公司₂。细胞被胰蛋白酶通道10天后,然后在95%融合(Jinuo生物学和医学公司,中国)。所有实验进行细胞通道4到6和60%到90%的融合。在所有的实验中,进行了细胞静止无血清培养系统通过孵化24小时之前使用。

2.2。老鼠VMSCs PDE4D基因沉默

慢病毒载体系统用于实验是购自上海Genchem公司(上海,中国),这是由三个plasmids-pGCL-GFP pHelper1.0, pHelper2.0。的质粒pGCL-GFP U6启动子和GFP报告基因。

寡核苷酸序列的四种不同PDE4D-shRNAs和控制意义成分如表所示1。所有的成分都是由上海Genchem公司合成。这四个21个核苷酸成分工器四个不同地区的PDE4D mRNA(创银行加入。NM_017032)被设计使用特定设计指南shRNA发夹由shRNA编码表达式向量和成分表达式Ambion公司的磁带。使用免疫印迹的序列检测PDE4D击倒,序列定位在181达到了最佳干扰效果和随后克隆shRNA-pGCL-GFP慢病毒载体。荒谬成分作为控制。传染性病毒是由cotransfecting慢病毒载体和包装构造成293英尺细胞使用Lipofectamine试剂(表达载体)。

重组lentviruses包含shRNA PDE4D和毫无意义的成分是来自Genchem公司。VSMCs感染了纯化慢病毒在莫伊(感染的多样性)获得95 - 100%的效率,由GFP表达后24小时内感染。

2.3。免疫印迹

VSMCs收集,用超声发生器。蛋白质提取溶菌产物和sds - page分离(十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶electrohoresis)。电泳后,蛋白质被转移到PVDF膜,膜被孵化了TBST(三羟甲基氨基甲烷缓冲液盐水渐变)含5%脱脂牛奶1小时。墨迹孵化了一个适当的稀释初级抗体鼠PDE4D (Abcam)和α肌动蛋白(Santacruz) 2小时,与TBST冲洗三次。冲洗屁股孵化了第二抗体(Santacruz) 2小时和TBST冲洗。由化学发光免疫反应性检测(Amersham ECL加上工具包)。

2.4。细胞生存和增殖

细胞生存和增殖是衡量评估线粒体的活性VSMCs使用MTT工具包(σ)。采用无血清细胞growth-arrested 24小时,然后用0.5%的边后卫和PDGF-BB在培养基培养(Pepro科技,20 ng / mL) 24小时之前的MTT(5毫克/毫升,勃利公司,中国)。MTT的解决方案(5毫克/毫升MTT介质无酚红)添加到培养液体积等于10%。进一步孵化37°C四个小时产生紫色MTT甲瓒晶体。一旦随着DMSO,每个文化中的吸光度测量与背景在570海里(650海里)减去。

2.5。迁移分析

VSMCs迁移进行了分析使用修改后的Boyden室装有8 -μ米孔膜(康宁)。简而言之,VSMCs resuspended在无血清培养基的浓度1×10⁵细胞/毫升。一卷200L细胞悬液的添加到上层Boyden的井室,和0.5% FBS-medium有或没有PDGF (20 ng / mL)添加到众议院。迁移被允许进行12小时37°C, 5%的公司₂,湿润的氛围。然后,细胞保持膜的上表面与棉花棒刮掉。细胞的迁移到下表面与多聚甲醛固定(广州试剂厂)与DAPI染色(杰克逊)和结晶紫(Weijia技术公司、广州)。迁移能力被染色的细胞的平均数量在6个随机领域来看,每膜(放大×400)。实验重复三次。

2.6。测量营地

培养的细胞内营水平VSMCs营地RIA测定检测组件从上海中医药大学购买装备后指令(上海,中国)。营的检测极限是0.08 pmol / L,和国米,intra-assay变异系数< 10%。饥饿细胞孵化0.5% FBS-medium有或没有PDGF (20 ng / mL)另一个24小时。细胞细胞溶解在酸/酒精(750毫升乙醇:248.5毫升的重蒸馏的H₂O: 1.5毫升的浓盐酸)包含IBMX (50010 M)。溶菌产物乙酰化了L体积的1:2 (v: v)乙酸酐加三乙胺的混合物。乙酰化后,样本preincubated 1小时在室温下与100年L anti-cAMP前增加100l^125年难民营和孵化一夜之间在4°C。与吸附材料分离后,样本离心机在3000 rpm,持续15分钟。浮在表面的液体是吸气,沉淀的放射性计数γ计数器,营水平测定标准曲线比较。

2.7。统计分析

所有数据用SPSS 12.0统计软件进行处理。所有结果都表示为±SEM手段。数据分析使用单向方差分析和Student-Newman-Keuls测试多个比较。在所有情况下,作为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。筛选基因的shRNA沉默后PDE4D感染Lentivrius粒子携带成分对PDE4D VSMCs

确定PDE4D基因沉默效果,VSMCs是暂时性的转染lentivrius粒子携带shrna PDE4D。四个不同的shRNA工器,称为不。1,没有。2,没有。3,没有。4,设计针对不同地区的鼠PDE4D (NM_017032):开始的181年,368年,357年和1499年(表1)。所有四个不同的成分可以抑制PDE4D转录和蛋白质含量由实时rt - pcr和免疫印迹(数据没有显示)。这些成分工器显示不同程度的PDE4D基因沉默效率从53%到72%不等(数据没有显示)。没有。1序列定位在181年取得了最佳干扰效果72%左右,随后克隆到shRNA-pGCL-GFP慢病毒载体(图1)。废话成分治疗没有显著改变PDE4D转录和蛋白质的水平,随后克隆到shRNA——pGCL-GFP慢病毒载体成分控制(图1)。

3.2。PDE4D基因沉默抑制PDGF-Induced VSMC增殖而不影响细胞的生存能力

确定PDE4D参与PDGF-induced VSMC增殖,我们治疗细胞PDGF和扩散是化验使用MTT PDGF刺激后24小时。如图2未感染控制,细胞和细胞慢病毒颗粒感染携带shRNA直接反对PDE4D或废话shRNA增长与出口增速。细胞PDGF处理和未经处理的细胞相比,增长了近3倍。感染的VSMCs lentivius粒子携带shRNA针对PDE4D显著减少PDGF-induced扩散导致约30%。相比之下,感染的VSMCs慢病毒粒子携带荒谬成分没有显著影响PDGF-induced扩散。这个结果说明了一个重要的角色PDE4D PDGF定向VSMC增殖。

3.3。PDE4D基因沉默抑制迁移

确定PDE4D基因有助于VSMC迁移,我们沉默基因表达对PDE4D使用慢病毒粒子携带成分和评估迁移使用Boyden室。大鼠主动脉VSMCs是静止24小时治疗无血清培养基。如图3未感染控制慢病毒感染细胞和细胞编码对PDE4D shRNA直接或荒谬成分有类似的迁移率。治疗PDGF显著增加VSMC迁移到6倍相比,未经处理的细胞。与慢病毒感染VSMCs粒子携带shRNA针对PDE4D显著减少PDGF-induced迁移导致近39%。相比之下,感染的VSMCs慢病毒携带荒谬成分没有明显影响PDGF-induced迁移。

3.4。细胞内营级

检查是否抑制PDE4D基因沉默对VSMC增殖和迁移的影响是通过介导的细胞内营,我们测量营地水平酶免疫测定感染后的VSMCs lentivrus携带shRNA PDE4D基因(图4)。感染的VSMCs lentivrus粒子携带对PDE4D基因的shRNA或荒谬成分不会引起任何显著改变VSMC基准面的阵营。添加PDGF (20 ng / mL)刺激营地的显著积累VSMCs与控制。然而,感染与慢病毒粒子携带shRNA VSMCs反对PDE4D基因或荒谬成分不会引起任何显著改变PDGF-stimulated积累的阵营。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们研究的功能结果PDE4D击倒的RNA干扰PDGF-induced VSMC增殖和迁移。我们发现击倒的内生PDE4D大大降低大鼠主动脉VSMC增殖和迁移。然而,抑制不会导致改变全球细胞内营的水平,这表明抑制不太可能通过介导的阵营。

动脉粥样硬化是缺血性中风的主要原因[27]。血管内皮细胞损伤和随后的迁移和扩散VSMCs早期动脉粥样硬化的关键事件。我们这里习惯培养VSMCs后三个段落作为模型来研究VSMC增殖和迁移,因为他们代表VSMCs合成表型,类似于平滑肌细胞体内迁移。血小板源生长因子(PDGF),其中一个最强大的有丝分裂原及化学引诱物VSMCs由血小板,VSMCs,受伤和内皮细胞在血管壁,扮演着核心作用在血管疾病的发生和发展28,29日]。因此,在本研究诱导VSMC增殖和迁移的有效因子PDGF和病理生理相关的趋化作用。如图2,我们证实,PDGF在老鼠VSMCs引起扩散。另外,我们观察到约减少30%的PDGF-induced细胞增殖PDE4D VSMCs不足。我们相信PDGF-induced细胞增殖的减少PDE4D缺乏VSMCs特定因为击倒PDE4D没有影响静VSMCs PDGF在缺席。Rolipram这一发现与之前的研究一致,一般PDE4抑制剂,可以抑制扩散VSMCs从26%降至37±6%30.- - - - - -32]。它不是惊奇地注意击倒PDE4D没有实现全面抑制VSMC增殖,因为多个信号参与PDGF-induced VSMC增殖。此外,PDE的家人除了PDE4D已被证明与VSMC增殖密切关联。例如,抑制PDE3 PDE1A也减少VSMC增殖(33,34]。然而,我们的数据表明PDE4D重要PDGF-induced VSMC增殖。

虽然VSMC迁移在动脉硬化的发病机制中起着举足轻重的作用,在VSMC PDE4D迁移的作用受到更少的关注。很少有调查研究对VSMC PDE4D迁移的影响。这些有限的结果不一致的报告。例如,Goncharova和他的同事们发现,cilomolast PDE4抑制剂可以抑制基底(如果)和PDGF-stimulated气管平滑肌的迁移和肺血管平滑肌细胞(35]。帕默和他的同事报道,Ro 20 - 1724,另一个PDE4抑制剂对PDE4D强有力的影响,强antimigratory效应引起的forskolin [25]。然而,无论是cilomolast还是Ro 20 - 1724是具体针对PDE4D抑制剂。因此,缺乏选择性抑制剂对PDE4D很难确定的功能角色PDE4D同种型。要解决这个问题,我们使用shRNA技术选择性地击倒在VMSCs PDE4D表达式。我们发现击倒PDE4D显著抑制PDGF-induced迁移。这种效果是在平行于PDE4D在VMSC增殖的抑制作用。

众所周知,营地及其信号起到至关重要的作用在调节VSMC增殖和迁移21,22,36]。此外,营地是唯一PDE4D衬底。因此,我们假设击倒PDE4D可能介导的抑制效应通过其监管的阵营。尽管PDGF-induced强劲的生产营VMSC细胞,我们未能发现任何重大变化的营地水平PDGF-induced PDE4D VMSC不足与一些先前的报道是一致的(28,29日]。鉴于细胞内营水平由PDE家人调制,这是合理的抑制PDE4或独自PDE4D可能无法影响全球的营地在细胞水平。另一个可能的解释是,PDE4家庭对VSMC增殖和迁移的影响可能不是完全由细胞内营浓度的变化。除了行动cAMP-signaling, PDE4D也有相声extracellular-signal-regulated激酶(ERK)在回应cAMP-dependent和non-cAMP-dependent代理。ERK据报道是重要的PDGF -刺激VSMC的增殖和迁移。此外,营与空间梯度分布,不自由37,38]。因此,营地PDE4或其他家庭成员可以引起高度封闭和不足以增加总细胞阵营。这也可能解释未能检测到显著改变单一抑制PDE4后营。因此,我们推测,击倒PDE4D会改变当地的阵营,从而调节其信号局部浓度抑制细胞的增殖和迁移。

5。结论

在这项研究中,我们用lentivrius感染VSMC粒子携带shRNA直接反对PDE4D。因此,显著地抑制VSMC增殖和迁移,抑制效果不与全球细胞内营的水平。我们的研究结果表明,PDE4D VSMC增殖和迁移的重要作用可以解释其遗传易感性缺血性中风。

承认

作者想提供特别感谢钟南山裴手稿准备。本研究由国家自然科学基金支持的中国没有。39700048、30271378 l, 30271378 / H0905)、广东省自然科学基金(没有。06021225,021866,980066,974151)、《广东省科学技术委员会的关键项目(2002号。2005 b31201013 2002 b50301009 c30603),和特殊研究基金会博士学科的学院和大学(没有。20070558234)。资金来源没有参与研究设计;收集、分析和解释数据;报告的写作;提交投稿或决定。

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