文摘

本研究旨在调查的分子机制LncRNA NKILA潜在促进心肌细胞凋亡和相关糖尿病心肌病。我们利用高浓度的葡萄糖诱导人类心肌细胞细胞系AC16模仿糖尿病心肌病。然后,我们进行高通量大数据分析,rt - pcr和免疫印迹分析评估相关的mRNA和蛋白的表达水平。细胞凋亡的检测是通过膜联蛋白V-FITC。AC16细胞的增殖、迁移和入侵被CCK8化验检查,集落形成试验,EdU化验,伤口愈合测试和transwell室试验。我们利用统计分析和荧光素酶活性测定分析相关基因之间的相互作用。LncRNA NKILA AC16中高度表达的细胞引起的高葡萄糖和抑制AC16细胞增殖,迁移和入侵通过诱导细胞凋亡。荧光素酶活性测定表明,LncRNA NKILA miR22-3p结合。的影响LncRNA NKILA AC16细胞增殖,迁移和入侵miR22-3p可以逆转。荧光素酶活性测定表明,TXNIP在AC16 miR-22-3p的目标细胞,和所有的影响TXNIP AC16细胞增殖,迁移和入侵miR22-3p可以废除。 These results provided comprehensive data about a novel molecular mechanism of LncRNA NKILA promoting cardiomyocytes apoptosis: LncRNA NKILA performed its function in AC16 cells under high glucose-induced condition by targeting mir-22-3p-TXNIP signal axis, which indicated that LncRNA NKILA may play a crucial role in diabetic cardiomyopathy.

1。介绍

糖尿病的发展和进步将会导致一系列的并发症,影响人体的主要器官(大部分1]。大数据统计分析显示有越来越多的证据表明,糖尿病并发症是死亡的主要原因之一,在许多国家(2,3]。糖尿病的并发症,糖尿病心肌病(DCM)是一个独立的危险因素与心脏衰竭,甚至在治疗冠心病(CAD),高血压、心脏病或血管(4]。提高研究和统计分析表明,扩张型心肌病的发展是一个过程涉及多个代谢紊乱,包括心肌胰岛素抵抗和抑制葡萄糖的氧化,导致增加脂质代谢、高脂血症、心肌胰岛素抵抗和高胰岛素血症(5]。临床研究表明,扩张型心肌病是一个重要的风险因素和严重心力衰竭的主要原因之一,全世界约有12%的糖尿病患者(6,7]。扭转DCM可以防止心脏病发作,减少心血管疾病(CVD)的发生率。由于缺少对扩张型心肌病发病机制的基本机制的理解,这导致缺乏一个有效的临床预后和治疗策略。

目前,大量的努力表明,非编码RNA (ncRNAs)是糖尿病血管并发症的关键因素8]。ncRNAs的子群,长非编码rna (lncRNAs)大于200个核苷酸长度(9]。最近,随着越来越多的lncRNAs证明DCM的关键参与者,他们的监管可能导致这种疾病的控制(10,11]。核因子-κB (NF -κB)交互长非编码RNA (LncRNA NKILA)是研究肿瘤抑制LncRNA在多种恶性肿瘤(12,13]。NF -κB lncRNA互动(NKILA)在乳腺癌首次发现,位于细胞质(14]。在细胞质中,NKILA NF -绑定κB复杂,形成一个稳定的三元复杂,阻碍了我κB磷酸化的网站,导致我的抑制κ磷酸化和NF - BκB激活。

小分子核糖核酸(microrna)是一种内源性小分子发挥重要的监管作用的非编码rna在许多重要的生物过程15]。目前,microrna在糖尿病及其心血管并发症中的作用尚未完全研究[16- - - - - -18]。然而,随着越来越多的证据显示microrna的重要作用,它的重要性在糖尿病及其心血管并发症正收到越来越多的关注。例如,循环microrna目前视为潜在生物标志物为各种不同的疾病,包括糖尿病(19]。硫氧还蛋白相互作用蛋白基因(TXNIP)是参与调节氧化物信号通路与胰岛素抵抗和胰岛细胞功能受损(20.,21]。因为在胰岛素抵抗和胰岛细胞功能的作用,它被认为是参与扩张型心肌病发病机制。

在这项研究中,我们利用高浓度的葡萄糖诱导人类心肌细胞细胞系AC16模仿糖尿病心肌病。我们调查的角色LncRNA NKILA在促进体外心肌细胞凋亡和发现LncRNA NKILA执行其功能在促进AC16轴瞄准mir-22-3p-TXNIP细胞凋亡的信号,提出了一个新的治疗策略对糖尿病心肌病。

2。材料和方法

2.1。试剂

DMEM培养基(SH30022.01 B)的边后卫(SH30087.01)、青霉素(SH30010)和PBS (SH30256.01 B)从通用电气™Hyclone公司。Lipofectamine™RNAiMAX转染试剂是英杰公司(美国13778 - 075年)。抗体:反β肌动蛋白(ab8227) anti-Bax (ab32503) anti-Bcl-2 (ab32124) anti-cleaved caspase-3 (ab2302) anti-cleaved caspase-9 (ab2324) anti-COX-2 (ab15191) anti-MMP-2 (ab97779) anti-MMP-9 (ab38898)和anti-TXNIP (ab188865)从Abcam购买有限公司,有限公司,英国剑桥。

2.2。细胞培养和矢量转染

AC16细胞保持在DMEM培养基(美国Hyclone SH30022.01 B)包含有10%的边后卫(美国Hyclone SH30087.01), 100 U /毫升青霉素(美国Hyclone SH30010),和100毫克/毫升链霉素在湿润的气氛中在37°C公司为5%2。转染前24小时,AC16细胞转移到Opti-MEM培养基。NKILA成分或miR22-3p超表达载体或都转染到AC16细胞沉默表达式使用Lipofectamine 2000(猫。美国11668019号英杰公司)根据制造商的指示。总之,1.25μl NKILA成分(20μ米)或1μ与100年g miR22-3p向量的稀释μl Opti-MEM,称为流体a液B是Opti-MEM包含1μl Lipofectamine 2000和溶解5分钟之前与流体混合a .转染试剂添加到AC16细胞和镀在24-well板块(猫。美国康宁公司3548号),这是转移到Opti-MEM中转染前24小时。4到6小时的反应后,培养基是变成DMEM full-culture媒介。基因表达试验是由qPCR转染后36个小时。细胞功能的测试,增殖,细胞周期,迁移在48小时内进行。

2.3。实时聚合酶链反应

实时PCR验证执行的效率相关的成分或超表达向量AC16细胞。总mRNA隔绝AC16细胞使用试剂盒试剂(# 15596018)(美国生活技术),然后反向转录的QuantiTect逆转录工具包(# 205313)(试剂盒、上海、中国)。实时PCR是由StepOnePlus系统(美国应用生物系统)使用热费希尔科学Maxima SYBR绿色/火箭qPCR大师混合试验(2×)(# K0221)。引物序列中演示了表1。

表1
引物序列。
2.4。免疫印迹

检测目标蛋白的细胞水平、蛋白质提取AC16细胞被免疫印迹检测。完整的细胞溶解产物提取利用裂解缓冲:50毫米三pH值7.4,150毫米氯化钠,1毫米EDTA, 1% Triton, 10%甘油蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(罗氏、巴塞尔、瑞士)。由布拉德福德测定蛋白质浓度测定。可溶性蛋白(30 - 40μg)受到SDS-polyacrylamide凝胶电泳。分离蛋白质是electrophoretically转移到聚乙二烯二氟化物薄膜(PVDF)(美国微孔,Billerica的)。主要抗体用于本研究被稀释到5%脱脂乳1:500。

2.5。细胞增殖试验

细胞增殖试验执行根据CCK8手稿在第0天,第一天,第二天,转染后第四天。

2.6。集落形成实验

胰蛋白酶消化成单个细胞和悬浮在培养基。每组接种10毫升每道菜与200细胞培养基,细胞被温柔的摇晃均匀分散。执行日常文化为3周。当可见克隆出现在培养皿中,介质被丢弃,和4%多聚甲醛固定15分钟,染色有0.1%结晶紫染料10分钟,用PBS洗净;克隆的数量统计。

2.7。EdU染色试验

5×104细胞接种于96孔板。48小时后,细胞消化和收集,然后在中包含EdU孵化2 h。PBS洗涤后,4%多聚甲醛固定30分钟。然后,试剂B,C,D,E分别添加,根据指令的装备(广州Ruibo生物技术有限公司)孵化,其次是PBS洗涤。最后,它孵化hoechst33342染色溶液在室温下30分钟,用PBS,荧光显微镜下观察和拍照,并与图像分析J。

2.8。细胞凋亡PI-Annexin V化验

转染后的细胞凋亡比例被PI-Annexin V测试分析并显示通过流式细胞术。总之,细胞在对数生长阶段被播种在6-well板密度2×105/好,培养48 h。洗后预冷PBS两次,4000 g离心后的上层清液被丢弃的细胞悬液3分钟,和400年µl膜联蛋白v-FITC染色的解决方案是添加和孵化在冰暗了15分钟。然后,10µlπ染料溶液添加和混合和孵化黑暗5分钟。流式细胞术检测细胞凋亡,激发光波长为488 nm。实验重复3次,三个实验数据的平均值。

2.9。伤口愈合实验

伤口愈合试验进行了如前所述[22]。

2.10。Transwell室试验

细胞对数生长阶段被饥饿24小时第二天和消化,使离心,resuspended,最后2×10的浓度5/毫升。0.2毫升的悬架是添加到transwell上院,和700毫升的预冷DMEM细胞培养基含有10%的边后卫是添加到众议院。包含5%的细胞在细胞培养孵化器有限公司2的温度37°C。24小时后,transwell室被参议院中的细胞和基底膜与湿棉签擦洗。这些细胞被固定为甲醇30分钟,沾0.1%结晶紫染料为20分钟。五个字段(100×)随机选择计算跨膜细胞的数量。

2.11。核和胞质分离测定

细胞与低渗的缓冲区resuspended含有蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂(n8080119热费希尔科学)(10毫米玫瑰(pH值7.5),0.5毫米德勤,10毫米氯化钾,MgCl和1.5毫米2)。孵化后冰10分钟,离心机在1000 g在4°10分钟。上层清液进一步离心机在15000克15分钟获得细胞质。沉淀与低渗的冲洗两次缓冲区B(10毫米玫瑰(pH值7.5),氯化钾10毫米,1.5毫米MgCl2,0.5毫米德勤,0.5%诺乃清洁剂p 40),在4°C的环境为30分钟,轻轻旋转,离心机在4°C 6000克10分钟,冲洗一次,低渗的缓冲区,里帕缓冲含有蛋白酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂(50毫米三羟甲基氨基甲烷HCl液pH值(7.5),1500毫米氯化钾,1%诺乃清洁剂p 40, 0.5%氢氧化钠,0.1% SDS, EDTA和1毫米,pH值8.0)重悬。在4°C孵化了30分钟,同时轻轻旋转,使离心,享年15000岁 20分钟,上层的是核的部分。

2.12。荧光素酶报告基因技术

双荧光素酶基因记者化验之前描述(23]。

2.13。统计分析

所有本研究实验至少重复两次,和三个实验的平均值作为均值标准差(SD)方差计算公式在Excel中。所有数据的重要性被图基的多重比较检验估计方差分析分析使用SigmaStat 3.5软件。重要的是,统计学意义时接受了 。

3所示。结果

3.1。LncRNA NKILA AC16中高度表达的细胞引起的高葡萄糖

我们进行rt - pcr检测分析NKILA mRNA的表达水平AC16细胞高glucose-induced条件下。发现NKILA mRNA的表达水平显著增加,高血糖诱导时间的增加(图1(一))。此外,人们发现NKILA mRNA表达水平的增加对葡萄糖浓度(图摄入量有关1 (b))。没有意外,sh-NKILA能够击倒NKILA mRNA表达水平高glucose-induced条件下(图1 (c))。

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图1
LncRNA NKILA AC16中高度表达的细胞引起的高葡萄糖。(a)的表达水平LncRNA NKILA信使rna通过rt - pcr检测诱导后30 mM AC16细胞葡萄糖在表示时间;(b)的表达水平LncRNA NKILA mRNA rt - pcr与不同浓度的葡萄糖诱导后探测到(0、5、10、20和30毫米)48 h AC16细胞;(c)的表达水平LncRNA NKILA mRNA使转染后通过rt - pcr检测表明质粒在AC16细胞在高glucose-induced条件。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。
3.2。推倒LncRNA NKILA逆转AC16细胞的凋亡诱导高葡萄糖和促进其增殖

发现推倒LncRNA NKILA逆转AC16细胞活力的抑制引起的高葡萄糖,当我们执行CCK8化验(图2(一个))。这个降级观察AC16细胞集落形成能力和AC16细胞增殖能力(数据2 (b)和2 (c))。评价细胞凋亡,我们执行膜联蛋白V-FITC化验,发现高葡萄糖诱导AC16细胞凋亡可以废除的sh-NKLA(图2 (d))。此外,细胞凋亡蛋白生产商:伯灵顿,caspase-3裂解,和裂解caspase-9被高葡萄糖诱导,而抗凋亡蛋白Bcl2抑制(图2 (e))。所有这些影响蛋白质可以逆转推倒LncRNA NKILA。综上所述,这些数据表明高glucose-induced AC16细胞凋亡和抑制AC16细胞增殖通过增加NKLA表达式。

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图2
推倒LncRNA NKILA逆转AC16细胞的凋亡诱导高葡萄糖和促进其增殖。(一)AC16 CCK8测定细胞活力检测的推倒LncRNA NKILA高glucose-induced条件下,表示质粒转染在AC16细胞;(b, c) AC16细胞集落形成能力和扩散能力检测集落形成试验和EDU分析推倒LncRNA NKILA高glucose-induced条件下,表示质粒转染在AC16细胞;(d) AC16细胞凋亡的检测膜联蛋白V-FITC化验的推倒LncRNA NKILA高glucose-induced条件下,表示质粒转染在AC16细胞;(e)细胞凋亡蛋白生产商表达水平的检测使转染后免疫印迹试验表明质粒在AC16细胞并表示抗体免疫印迹试验中加入。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。
3.3。推倒LncRNA NKILA提升AC16高Glucose-Induced条件下细胞迁移和入侵

评估的影响,推倒LncRNA NKILA AC16细胞迁移和入侵高glucose-induced条件下,我们进行了伤口愈合测试和transwell室试验。如数据所示3(一个)和3 (b)、高glucose-induced (HG)显著抑制细胞迁移和入侵与对照组相比,这种抑制被推倒了LncRNA NKILA (HG + sh-NKILA)。此外,迁移和入侵蛋白质制造商:cox - 2, MMP-2,和MMP-9被HG与对照组相比显著地抑制,而所有这些影响蛋白质可以逆转推倒LncRNA NKILA(图3 (c))。综上所述,这些数据表明高葡萄糖抑制AC16细胞迁移和入侵通过增加NKLA表达式。

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图3
推倒LncRNA NKILA提升AC16高glucose-induced条件下细胞迁移和入侵。(a, b) AC16细胞迁移和入侵检测的伤口愈合试验和transwall室测定推倒LncRNA NKILA高glucose-induced条件下,表示质粒转染在AC16细胞;制造商(c)细胞迁移和入侵蛋白质表达水平的检测使转染后免疫印迹试验表明质粒在AC16细胞并表示抗体免疫印迹试验中加入。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。
3.4。LncRNA NKILA执行其功能在AC16 miR22-3p细胞高Glucose-Induced条件下绑定

算出的分子机制LncRNA NKILA调节AC16细胞增殖,迁移和入侵,我们搜查了母星和发现之间的匹配区域LncRNA NKILA和miR22-3p(图4 (b))。这结果是相互支持的高表达LncRNA NKILA在细胞质中(图4(一))。此外,我们利用荧光素酶活性测定分析之间的交互LncRNA NKILA miR22-3p。与对照组(NC模仿)相比,miR22-3p overexpressing (miR22-3p模仿)显著地抑制NKILA荧光素酶活性,由NKILA废除变异(图4 (b)),这表明LncRNA NKILA结合miR22-3p(图4 (c))。miR22-3p mRNA的表达水平显著下降随着时间的增加高葡萄糖感应(图4 (d)),减少miR22-3p mRNA表达水平对葡萄糖浓度(图摄入量有关4 (e))。与此一致的是,推倒LncRNA NKILA miR22-3p mRNA表达水平显著增加(图4 (f))。

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图4
LncRNA NKILA调节AC16细胞增殖,迁移和入侵。(a)在高glucose-induced条件、表达水平的LncRNA NKILA mRNA在AC16细胞。细胞核和细胞质被rt - pcr检测到核和胞质分离后测定;(b)序列之间的对齐区域LncRNA NKILA miR22-3p和序列LncRNA NKILA突变(NKILA狗);(c)荧光素酶活性测定分析之间的交互LncRNA NKILA (wt:野生型或傻瓜:突变)和高glucose-induced条件下miR22-3p;(d) miR22-3p mRNA的表达水平通过rt - pcr检测诱导后30 mM AC16细胞葡萄糖在表示时间;(e) miR22-3p mRNA的表达水平检测到rt - pcr与不同浓度的葡萄糖诱导后(0、5、10、20和30毫米)48 h AC16细胞;(f) miR22-3p mRNA的表达水平检测到rt - pcr在AC16表示使转染质粒后细胞在高glucose-induced条件。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。

这些数据表明,LncRNA NKILA执行其功能在AC16 miR22-3p细胞高glucose-induced条件下绑定。来证明这一假设,我们评估的影响miR22-3p AC16细胞增殖,迁移和入侵高glucose-induced条件下。首先,我们在AC16细胞中过表达miR22-3p(图5(一个))。然后,我们执行CCK8化验,发现,在高glucose-induced条件,miR22-3p overexpressing (HG + miR22-3p模仿)显著增加AC16细胞生存能力与对照组相比(HG +数控模拟(图)5 (b))。观察,这种程度的增加cautilized miR22-3p AC16细胞集落形成能力和AC16细胞增殖能力(数据5 (c)和5 (d))。评价细胞凋亡,我们执行膜联蛋白V-FITC化验,发现高glucose-induced AC16细胞凋亡可能获救miR22-3p overexpressing(图5 (e))。此外,高glucose-induced条件下,细胞凋亡蛋白的表达制造商:伯灵顿,caspase-3裂解,裂解和caspase-9被显著抑制miR22-3p overexpressing (HG + miR22-3p模仿)AC16细胞与对照组相比(HG +数控模拟),而抗凋亡蛋白的表达Bcl2诱导(图5 (f))。

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图5
miR22-3p AC16细胞增殖、迁移的影响,和高glucose-induced条件下入侵。(一)高glucose-induced条件下,miR22-3p mRNA的表达水平AC16细胞后,rt - pcr检测表明质粒转染在AC16细胞;(b) AC16细胞生存能力的检测CCK8高glucose-induced条件下分析后表明质粒转染在AC16细胞;(c, d) AC16细胞集落形成能力和扩散能力检测集落形成试验和EDU分析推倒LncRNA NKILA高glucose-induced条件下,并表示质粒转染在AC16细胞;(e) AC16细胞凋亡的检测膜联蛋白V-FITC高glucose-induced条件下分析后表明质粒转染在AC16细胞;(f)细胞凋亡蛋白生产商表达水平的检测使转染后免疫印迹试验表明质粒在AC16细胞并表示抗体免疫印迹试验中加入。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。

接下来,我们进行伤口愈合试验箱试验分析miR22-3p影响迁移和入侵AC16细胞高glucose-induced条件下。如数据所示6(一)和6 (b)、高glucose-induced (HG)组显著抑制细胞迁移和入侵与对照组相比,这救了抑制miR22-3p overexpressing (HG + miR22-3p模仿)。此外,迁移和入侵蛋白质制造商:cox - 2, MMP-2,和MMP-9显著抑制HG组与对照组相比,尽管所有这些影响对蛋白质可以逆转miR22-3p overexpressing (HG + miR22-3p模仿)(图6 (c))。综上所述,这些数据表明,在高glucose-induced条件,LncRNA NKILA抑制增殖、迁移,并通过绑定miR22-3p AC16细胞的入侵。

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图6
MiR22-3p影响迁移和入侵AC16细胞高glucose-induced条件下。(a, b) AC16伤口愈合细胞迁移和入侵检测的试验箱试验后高glucose-induced条件下使转染质粒表示AC16细胞;制造商(c)细胞迁移和入侵蛋白质表达水平的检测使转染后免疫印迹试验表明质粒在AC16细胞并表示抗体在免疫印迹试验过程中添加。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。
3.5。TXNIP是AC16 miR-22-3p的目标细胞

然后我们问miR-22-3p-induced扩散背后的分子机制,AC16细胞的迁移和入侵。通过搜索母星,对齐的区域被发现之间的序列miR-22-3p和TXNIP forward链(图7(一))。此外,我们利用荧光素酶活性测定分析miR-22-3p和TXNIP之间的交互。miR-22-3p overexpressing (miR-22-3p模仿)显著地抑制TXNIP荧光素酶活性与对照组(NC模仿)相比,由TXNIP废除变异(图7(一)),表明TXNIP miR-22-3p的目标(图7 (b))。TXNIP mRNA的表达水平显著增加随着时间的增加高葡萄糖感应(图7 (c)),TXNIP mRNA表达水平的增加对葡萄糖浓度(图摄入量有关7 (d))。并与对照组(NC模仿),miR-22-3p overexpressing (miR-22-3p模仿)显著地抑制TXNIP mRNA和蛋白表达水平(数字7 (e)和7 (f)),表明TXNIP miR-22-3p的目标。

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TXNIP是AC16 miR-22-3p的目标细胞。(一)对齐的区域之间的序列TXNIP miR22-3p和TXNIP突变序列(TXNIP狗);(b)荧光素酶活性测定分析之间的交互TXNIP (wt:野生型或傻瓜:突变)和miR22-3p高glucose-induced条件下;(c) TXNIP mRNA的表达水平通过rt - pcr检测诱导后30 mM AC16细胞葡萄糖在表示时间;(d) TXNIP mRNA的表达水平检测到rt - pcr与不同浓度的葡萄糖诱导后(0、5、10、20和30毫米)48 h AC16细胞;(e, f) TXNIP mRNA和蛋白表达水平被miR22-3p mRNA, mRNA和蛋白表达水平检测使转染后通过rt - pcr和免疫印迹试验表明质粒在AC16细胞高glucose-induced条件下,表示抗体免疫印迹试验中加入。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。
3.6。LncRNA NKILA执行其功能在AC16细胞高Glucose-Induced条件下通过瞄准轴miR-22-3p-TXNIP信号

上述数据表明,TXNIP miR-22-3p目标,表明LncRNA NKILA高glucose-induced条件下执行其功能在AC16细胞定位轴miR-22-3p-TXNIP信号。为了证明这个假设,我们第一次验证的效率LncRNA NKILA shRNA(图8(一个))。然后,我们执行CCK8化验,发现,在高glucose-induced条件,推倒LncRNA NKILA (HG + sh-NKILA + NC抑制剂)显著增加AC16细胞生存能力与对照组相比(HG + sh-NC + NC抑制剂)(图8 (b))。这种程度的增加细胞生存能力时抑制miR-22-3p抑制剂添加(HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂),这可能是被推倒拯救TXNIP (HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂+ sh-TXNIP)(图8 (b))。评价细胞增殖,我们执行EDU化验,发现,在高glucose-induced条件,推倒LncRNA NKILA (HG + sh-NKILA + NC抑制剂)显著地抑制AC16细胞增殖与对照组相比(HG + sh-NKILA + NC抑制剂)(图8 (c))。这种程度的抑制细胞增殖时恢复miR-22-3p抑制剂添加(HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂),这可能是记录下推倒TXNIP (HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂+ sh-TXNIP)(图8 (c))。当我们进行膜联蛋白V-FITC化验,这些结果观察AC16细胞凋亡(图8 (d))。接下来,我们进行伤口愈合试验和transwell室试验来评估影响迁移和入侵。如数据所示8 (e)和8 (f)高glucose-induced条件下,推倒LncRNA NKILA (HG + sh-NKILA + NC抑制剂)显著增加AC16细胞迁移和入侵与对照组相比(HG + sh-NC + NC抑制剂)(数据8 (e)和8 (f))。和这种程度增加,细胞迁移和入侵时抑制miR-22-3p抑制剂添加(HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂),这可能是被推倒拯救TXNIP (HG + sh-NKILA + miR-22-3p抑制剂+ sh-TXNIP)(数据8 (e)和8 (f))。综上所述,这些数据表明LncRNA NKILA执行其功能在AC16细胞高glucose-induced条件下通过瞄准轴miR-22-3p-TXNIP信号。

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图8
LncRNA NKILA执行其功能在AC16细胞高glucose-induced条件下通过瞄准轴mir-22-3p-TXNIP信号。(a) LncRNA NKILA mRNA表达水平使转染后被rt - pcr检测表明质粒在AC16细胞在高葡萄糖(b)和(c) AC16细胞生存能力和扩散能力的检测CCK8化验和EDU =高葡萄糖诱导条件下分析后表明质粒转染在AC16细胞;(d) AC16细胞凋亡的检测膜联蛋白V-FITC高glucose-induced条件下分析后表明质粒转染在AC16细胞;(e, f) AC16伤口愈合细胞迁移和入侵检测的测试和transwall室测定高glucose-induced条件下使转染质粒表示后AC16细胞。数据代表三个独立的实验,分析了未配对t以及。误差棒表示SD。 ; ; 。

4所示。讨论

尽管重大进展的临床治疗扩张型心肌病近年来,DCM患者的死亡率仍高得令人无法接受,导致它从糖尿病患者死亡的主要原因之一complication-related全球疾病(24]。治疗扩张型心肌病患者的困难源于我们有限的理解其发病机制在分子水平上,它一直是近年来密集的研究领域。阐明分子机制控制重视DCM的扩张型心肌病的发病机制。

提供了一些证据在过去的监管角色lncRNAs对心脏发育和疾病(10]。目前,LncRNA NKILA已经在几个恶性肿瘤广泛研究了其抗癌效果。我们最好的知识,参与lncRNA NKILA糖尿病并发症仍然知之甚少。细胞凋亡的心肌细胞在高糖环境参与扩张型心肌病的发病机制(25,抑制这种病理生理过程被认为是一种很有前途的治疗扩张型心肌病的目标(26]。在我们的研究中,我们发现lncRNA NKILA glucose-induced条件在DCM细胞高表达关系。DCM的表达lncRNA NKILA水平细胞显著调节高glucose-induced条件下。和lncRNA NKILA击倒的加速和抑制细胞凋亡在心肌细胞在高glucose-induced条件。此外,我们的研究结果表明,lncRNA NKILA提升DCM细胞凋亡和抑制DCM细胞增殖,迁移和入侵miR-22-3p-dependent的方式。我们也证明了lncRNA NKILA可以直接绑定到miR-22-3p,这赋予了miR22-3p能够扭转的影响lncRNA NKILA DCM细胞增殖,迁移和入侵。荧光素酶活性测定表明,TXNIP miR-22-3p在DCM细胞的目标;因此,所有的影响TXNIP DCM细胞增殖,迁移,并通过miR22-3p入侵可以废除。

总之,目前的研究展示了一种新颖的分子机制LncRNA NKILA促进心肌细胞凋亡:LncRNA NKILA执行其功能在DCM细胞高glucose-induced条件下通过瞄准轴miR-22-3p-TXNIP信号,这表明LncRNA NKILA可能在糖尿病心肌病起到至关重要的作用。综上所述,我们的数据表明LncRNA NKILA治疗扩张型心肌病可能是一个有前途的治疗目标。

数据可用性

所有数据用于支持本研究的结果包括在手稿中。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

这项工作是支持的上海浦东新区峰会(急诊医学和急救护理)建设项目(批准号PWYgf2018-05)。