文摘

本研究旨在评估的影响过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR)γ基因抑制脂肪形成的差异化的兔骨髓间充质干细胞(bmsc)。主要bmsc从兔骨髓,分离培养,细胞表面标记bmsc的使用流式细胞仪进行了分析。实验涉及五组,即控制:未经处理的综合;模型:bmsc乙醇处理;空核:bmsc处理乙醇+空核;PPARγ:bmsc与乙醇+ PPAR治疗γ核;和PPARγ抑制剂:bmsc与乙醇+ T0070907治疗。rt - pcr和免疫印迹检测PPAR的表达水平的变化γ,PETALA2 (AP2)、脂蛋白脂肪酶(LPL),脂肪酸运输蛋白(FATP) 1,脂肪酸转运体(脂肪)。脂肪细胞计数和三酰甘油的内容模型和空核组显著大于对照组( )。后PPAR的抑制γ或T0070907,脂肪细胞计数和三酰甘油PPAR的内容γ和T0070907组显著降低( ),比对照组无统计上显著差异( )。PPAR的表达水平γ基因和蛋白质模型和空核组比对照组(不幸的是增强 ),并与PPAR后抑制γ或T0070907 PPARγPPAR的基因或蛋白表达水平γ和T0070907组显著降低( ),与对照组相比没有显著差异( )。Ap2的表达水平,LPL、FATP1和脂肪基因模型和空核组对照组相比要大得多( )。抑制与PPARγ或PPAR T0070907γ和T0070907组,分别导致显著降低脂肪形成的基因表达水平( ),相比无统计学意义差异控制( )。抑制PPARγ基因会使bmsc分化为脂肪细胞,表明其假定的角色在脂肪形成的基因的表达。

1。介绍

骨髓基质系统是一个网络组成的基质细胞和细胞外基质(1,2]。骨髓基质细胞包含骨髓多能间充质干细胞具有高增殖率和multilineage分化能力(3,4]。当暴露于酒精、分化的骨髓间充质干细胞(bmsc)成骨细胞明显减少,但其分化成脂肪细胞是大大增加5,6]。脂肪细胞计数和细胞三酰甘油含量显著增加,延长作用时间和浓度的酒精,表明酒精可以向脂肪细胞分化诱导bmsc以剂量依赖的方式(7- - - - - -10]。

酒精还可以促进脂肪形成的基因的表达,诱导多能基质干细胞分化成脂肪细胞在骨的bmsc在某个阶段(11]。增加脂类物质在血液循环导致脂肪小滴的积累,最终可导致的股骨头缺血性坏死(ANFH)通过各种途径。本研究证实了过氧物酶体的作用和分子机制proliferator-activated受体γ抑制剂T0070907饮酒导致的骨髓基质细胞分化为脂肪细胞使用培养的bmsc收获从正常兔股骨骨髓。

2。实验

2.1。隔离、文化和bmsc细胞的识别

总共20六个新西兰白兔牺牲,和四肢的骨头被移除在无菌操作。长骨髓腔开放使用咬骨钳,和髓腔冲洗与血清高糖DMEM培养基来获取骨髓和悬挂在3000转离心3分钟。上层的丢弃,4毫升的杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)添加到小球,和解决方案是用移液器吸取反复产生单个细胞悬液。随后,骨髓细胞接种到培养瓶6×10的浓度⁶/厘米²,紧随其后的是添加完整的DMEM培养基、细胞培养在37°C公司5%₂孵化器。培养基是改变了每隔一天,4天之后,上层清液被获得越来越多的细胞紧靠着墙,即。伴着。细胞的形态和生长在倒置显微镜下观察;主细胞通道后,bmsc通道2被接种到6-well文化板块,1×10的密度⁴每口井的细胞,标记为天0的实验。约1×10⁶细胞通过5被移除和resuspended在100年μL磷酸缓冲盐(PBS)、补充与相应的抗体和孵化在室温下30分钟。收获细胞然后用PBS洗净去除游离抗体,在PBS resuspended,使用流式细胞分析仪检测。所有动物实验动物伦理委员会批准的宁夏医科大学总医院。

2.2。实验分组

在五组实验进行,每3井文化。控制:bmsc没有接受任何治疗。模型:bmsc处理0.09 mol / L乙醇。空核:bmsc处理0.09 mol / L乙醇+空核。PPARγ:bmsc 0.09 mol / L乙醇+ PPAR对待γ核。PPARγ抑制剂:bmsc处理0.09 mol / L乙醇+ T0070907(开曼化工、MI、美国)。

2.3。rt - pcr

rt - pcr分析进行检测PPAR的表达水平γ,LPL Ap2 FATP1,和脂肪基因ethanol-induced bmsc的文化后7天,PPARγ治疗6周后的股骨头组织使用一个ANFH模型。总RNA分离试剂试剂盒用于获得标本组织总RNA;1μ总RNA的L和0.5μL lamv逆转录酶逆转录;和2.5μL模板cDNA、0.1μL聚合酶Taq海关,和0.1μL正向和反向引物。PCR参数如下:最初的变性在94°C 2分钟,35周期在94°C的变性40年代,退火在50 - 65°C 40年代,在72°C和扩展了1分钟,其次是最终在72°C扩展了5分钟。PCR产品保持在−20°C到进一步分析。β肌动蛋白作为内部参考,所有PCR扩增在相同的条件下进行。随后,6μL的PCR产物分离用2%琼脂糖凝胶电泳在120 V, 100毫安,30分钟。这种凝胶被和EB染色前5分钟到图像分析的解决方案。rt - PCR结果解释:一个明确的乐队匹配目标的预期大小片段被认为是PCR阳性结果。灰色进行扫描,数量一个软件(Bio-Rad Inc .)是用于分析PCR产物分离的乐队。目标基因之间的灰度值比和内部引用(β肌动蛋白)是用来计算的相对表达目标基因的mRNA的产品样本。

2.4。免疫印迹

7天后ethanol-induced文化的bmsc,总细胞蛋白提取。蛋白质洗提分离使用sds - page分析,样品在80 V 12%琼脂糖凝胶上分离的初始加载120 V紧随其后,直到跟踪染料1厘米的低端凝胶。一个适当大小的PVDF膜在甲醇浸泡5分钟,然后浸泡在传输缓冲区(pH值8.3,192年25更易/ L Tris-HCl更易与甘氨酸,20%甲醇)10分钟;然后,页面上的分离蛋白样品凝胶涂抹到PVDF膜使用100 V的electrotransfer设置为70分钟。PVDF膜被5%的牛血清白蛋白在一夜之间/ PBS溶液在4°C。相应的抗体主要包括CD90-FITC、CD73-FITC CD105-FITC, CD13-FITC, CD45-FITC, CD34-FITC,稀释1:2000年,增加了;那么,解决方案是允许在室温下站3分钟,和0.05%的渐变膜被20 PBS溶液10分钟,重复两次。之后,山羊anti-mouse免疫球蛋白二次抗体稀释1:8000年,被添加,和解决方案被允许站在室温下对3 h,和0.05%的渐变膜被20 PBS溶液10分钟,重复两次。电化学发光(ECL)试剂显色:细胞膜是孵化相同比例的解决方案A和B的ECL工具包开发化学发光信号为1分钟,它是使用凝胶成像系统检测和分析。发达的电影使用图像扫描和分析J 1.44版本软件,和平均密度值(副词)测定,及其比例β肌动蛋白作为每组的相对吸光度值的产品。

2.5。统计分析

的t以及、单向和卡方检验是用来确定统计对比表达和荧光强度,并使用了SPSS(19.0版)。所有结果与误差柱状图描述了平均值和标准误差。 在统计学上意义重大。

3所示。结果与讨论

3.1。bmsc的形态学、流式细胞术分析

形态学的培养兔bmsc如图1。表面抗原的表达是通过测量流仪评估和结果进行了比较和评价。所有表面抗原CD90 (89.05%)、CD105(90.88%),和CD73(95.07%)的bmsc显示阳性表达;CD13 (0.80%)、CD34(1.06%),和CD45(1.30%)(图没有显示表达式2),和支持先前的报道是一致的。

3.2。脂肪细胞计数比较,三酰甘油含量、PPARΓ基因和蛋白表达之间的组织

脂肪细胞是宽容的存储仓库甘油三酯和二次能源生产。的脂肪细胞计数和三酰甘油内容模型和空核组对照组相比要大得多( )。脂肪细胞计数和三酰甘油PPAR的内容γ和T0070907组显著降低( )后抑制PPARγ或添加T0070907,没有统计上实质性的差异相比,对照组( )。PPAR的表达水平γ基因和蛋白质模型和空核组对照组相比要大得多( )。添加T0070907 PPAR的表达水平γPPAR基因或蛋白质γ和T0070907组显著降低( ),没有统计学上的实质性差异相对于对照组( )(图3)。

3.3。组间比较脂肪形成的基因的转录水平

脂肪形成的基因的基因转录评估了不同群体的相对比较。,LPL基因表达水平的Ap2 FATP1、和脂肪的模型和空核组对照组相比要大得多( );后抑制PPARγ或添加T0070907, PPAR脂肪形成的基因的表达水平γ和T0070907组显著降低( ),相比没有统计学上的实质性区别控制( )(图4)。

3.4。讨论

bmsc的主要组成是细胞自我复制能力和高multilineage分化潜力,可以分化成各种组织细胞发展。他们不仅可以分化成软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、肌肉细胞、造血细胞还成神经细胞,如神经元和星形胶质细胞(12,13]。理想的识别标记bmsc尚未发现。因此,特征的细胞只能基于蛋白质的表达细胞的表面标记在附件的后期,如积极CD44、CD13、CD105, CD59, CD166 HLA-ABC或负面CD34, CD80、CD45、CD117和HLA-DR [14,15];但这些表面抗原并非bmsc独有,这是相同的间皮的表面抗原的特点,上皮和内皮细胞。然而,这仍然是一个相对可靠的方法来反向识别细胞根据其表型,增长概况,培养bmsc的生物学特性12- - - - - -16]。bmsc表面抗原的表达水平在这个研究结果是相似的在文献中报道,一贯支持先前的文献[17- - - - - -21]。

核糖核酸干扰(RNAi)提供高效的优点和精致的特异性。目前,RNAi-based遗传疾病基因治疗的实验研究。研究结果从临床和实验研究表明,ANFH归因于病理生理变化是由于脂肪的积累在骨髓和脂肪代谢异常22,23]。体外实验证实,乙醇可以上调PPAR的表达γ信使rna在bmsc,加快bmsc成脂肪细胞的分化,最终导致了大量脂肪细胞的增殖和积累。股骨头骨细胞的死亡由于脂质沉积和脂肪变性23,24]。有研究报道,PPARγ导致ANFH基因可能是一个重要目标,并通过阻断其表达式,ethanol-induced bmsc可能是异常的脂肪细胞的分化,以及防止形成ethanolic ANFH具有显著的应用前景[25- - - - - -27]。本研究表明,核和T0070907治疗达到相同的治疗效果通过抑制PPAR的表达γbmsc的基因或蛋白质,从而,表达下调bmsc的分化成脂肪细胞。

Ap2成熟脂肪细胞的形成是一个重要的标志。它位于PPAR的下游γ。它主要用作目标基因脂肪存储和脂肪分解代谢。研究表明,PPAR的表达γ和Ap2 mRNA在肥胖老鼠的脂肪组织是显著增加(28),显著提高脂肪合成。本研究表明,影响PPAR的表达γ基因或T0070907治疗可以显著降低Ap2下游基因的表达水平,这与研究是一致的。LPL是一个关键酶,水解三酰甘油为乳糜微粒和极低密度脂蛋白。脂蛋白代谢调控通过酶的催化活性,从而,实现调节血脂的影响。血脂不规则可能导致严重的头处理并发症。研究表明,LPL酶是一个重要的lipo-regulating PPAR的下游γ。当PPARγ身体活动减少,LPL分泌的量和身体的酶活性显著降低(29日]。脂肪,lipotransferase,最初从小鼠脂肪组织分离。它在运输起着至关重要的作用,调节脂肪酸的吸收在骨骼肌细胞膜(30.]。FATP1 PPAR的结合位点γ目标基因。在脂肪细胞,PPARγ上调表达的FATP1 coregulates脂肪酸和蛋白质的跨膜运输的因素,脂肪(31日- - - - - -33]。当前的消极后果的研究工作显示,可以减少脂肪形成的基因的转录抑制PPAR的表达γ基因,从而实现有前途的治疗效果。

4所示。结论

抑制PPARγ基因会使bmsc分化为脂肪细胞,表明其假定的角色在脂肪形成的基因的表达。血液中脂质含量高导致脂肪小滴形式,从而导致的股骨头缺血性坏死(ANFH)通过一系列的机制。使用培养的bmsc取自正常兔股骨骨髓,这项工作验证了功能和分子机制的过氧物酶体proliferator-activated受体抑制剂T0070907在饮酒导致的骨髓基质细胞向脂肪细胞分化。减少脂肪形成的基因的转录可能是有用的在发展中一个标准的治疗选择。

数据可用性

和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

易董和长张同样对本文亦有贡献。

确认

这项工作是由宁夏的自然科学基金(2019 aac03207)。