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Scientifica/2020./文章

研究文章|开放获取

体积 2020. |文章的ID 1609473 | https://doi.org/10.1155/2020/1609473

Christian A. Lombogia，Jimmy Posangi，Hard N.Pollo，Max Tulung，Trina E. Tallei， ＂遗传变异评估Apis nigocincta.线粒体细胞色素氧化酶I基因部分序列揭示苏拉威西岛膜翅目:蜂科"，Scientifica， 卷。2020.， 文章的ID1609473， 8 页面， 2020.． https://doi.org/10.1155/2020/1609473

遗传变异评估Apis nigocincta.线粒体细胞色素氧化酶I基因部分序列揭示苏拉威西岛膜翅目:蜂科

基督教a Lombogia，1，2 吉米Posangi，3. 硬n .鸡肉，4 Max Tulung.，1 和 蒂娜·e·Tallei5

1昆虫学研究计划，研究生课程，大学大学萨姆拉鲁吉，Manado，北苏拉威西岛，印度尼西亚

2护理学习计划，护理学院，Universitas Katolik de La Salle，Manado，North Sulawesi，印度尼西亚

3.公共卫生学习计划，公共卫生，大学大学萨姆拉努拉兰尼，Manado，Manado，印度尼西亚

4林业科学研究计划，农业学院，大学大学萨姆拉鲁尼，Manado，North Sulawesi，印度尼西亚

5印度尼西亚北苏拉威西省，马纳多市，萨姆拉图兰吉大学数学和自然科学系生物学系

学术编辑器:杨曹
收到了 2019年12月12日
接受 2020年3月18日
发表 07年4月2020年

抽象的

亚洲洞巢蜜蜂Apis nigocincta.，来自苏拉威西地和菲律宾的天然蜜蜂种类在授粉在当地生态系统和农业中的开花植物中起着至关重要的作用。在这项研究中，我们评估了涉及的内部遗传变异A.纳米克特使用细胞色素C氧化酶亚基I（COI）的序列。分子系统发育分析表明有三种主要的碎片A.纳米克特根据各自的位置(北、中、南苏拉威西)，从苏拉威西岛采集标本。利用Kimura 2参数(K2P)模型进行遗传距离分析，结果表明，苏拉威西岛标本种内遗传距离为0.000 ~ 0.055。苏拉威西岛有26个核苷酸多态性位点A.纳米克特．变化以过渡T↔C为主。分子鉴定结果与形态学鉴定结果一致。两种方法的结果一致认为，所研究的试件为A.纳米克特．遗传距离计算的结果表明，尽管经测试的样本源自远程位置，但遗传变异仍然在内部变化范围内。

1.介绍

全世界大约有30,000种蜜蜂。其中大约17000个已被描述[1］．其中，约有20,000种属于超家族apoidea [2］．这种超家族内最大的家庭猿人含有至少5,700种蜜蜂[3.］．蜜蜂也属于这个属api．这些昆虫在重要作物的授粉中发挥着重要作用。目前，已知九种蜂蜜蜜蜂居住世界：api dorsata，答:laboriosa，蜜蜂，答:florea，答:andreniformis，答:cerana，答:koschevnikovi，A.纳米克特(印度尼西亚的苏拉威西岛和菲律宾的棉兰老岛)A. Nuluensis.(印度尼西亚加里曼丹)，约有44个亚种[4］．

蜜蜂由于其单倍二倍体的性别决定机制而濒临灭绝，由于人类活动而数量有限[5，种内遗传变异低。种内遗传变异A.纳米克特这方面的研究很少。近年来，分子方法被用于研究种内遗传变异、种鉴定和近缘类群间系统发育关系[6］．用于此目的的一种技术是DNA条形码。该方法已应用于保护生物领域，因为它提供与野生动物保护管理相关的信息[7］．对于动物，用于DNA条形码的区域是细胞色素C氧化酶I（COI）基因。在这项研究中，我们检查了内部的内部变化A.纳米克特以便于物种鉴定和分析它们的遗传距离。

2。材料和方法

2.1。样本集合

这些成年工蜂是在印尼北苏拉威西省马纳多市Mahakeret村(北纬1°28 ' 53 "，东经124°50 ' 21 ")的一个废弃花园中使用转网捕获的。事发地点位于海拔约40米的地方。2019年3月样品采集地点的平均温度在29°C至32°C之间，湿度在85-89%。植被覆盖率达80%。植被主要由灌木、草和野花等组成Sphagneticola trilobata(l)Pruski,Tachytarpheta jamaicensis（L.）VAHL。，和薇甘菊kunth。

2.2。的形态学分析

观察到的形态特征包括头部(HD)、触角(AT)、喙(PB)、胸部(TO)、腹部(AB)、前翅(FW)、后翅(FL)、中肢(ML)和后肢(HL)的长度[8］．

２.３.分子识别
2.3.1。样品制备、PCR和测序

使用Zr组织和昆虫DNA MinipRep TM（Zymo Research）从与腹部连接到腹部的Coxa中提取总DNA。用DNA清洁和浓缩器™-5（DCC™-5）（Zymo Research）用DNA清洁剂和浓缩器™-5（Zymo Research）清洁基因组DNA，用于产生高质量的PCR。使用Toyobo Kod FX Neo PCR主混合物与引物对LCO1490和HCO2198进行底漆区的DNA条形码扩增。6］．PCR条件包括在95°C初始变性2分钟，然后在98°C变性10秒，在54°C退火30秒，在68°C延伸45秒和在68°C额外延伸5分钟35个循环。PCR产物在马来西亚1base DNA测序服务公司使用相同的引物对进行双向测序。

2.3.2。COI数据分析

色谱图也像以前一样受到处理[9］．样本的干净COI序列保存在GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov）.使用同一平台提供的爆炸身份搜索进行识别。使用群集O（1.2.1）多序列对齐（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo)与从GenBank中检索的苏拉威西岛不同部位的其他同源蜜蜂COI序列进行比较。进化历史由基于Kimura 2参数(K2P)模型的最大似然(ML)方法推断[10］．在MEGA v10.0.4中进行了进化分析[11］．

3.结果

3．1.的形态学分析

从Manado Mahakeret获得的蜜蜂标本的照片如图所示1．该试件下文称为CAL01。蜜蜂的9个主要形态特征(头长(HD)、触角长(AT)、喙长(PB)、胸部长(TO)、腹部长(AB)、前翅长(FW)、后翅长(FL)、中肢长(ML)和后肢长(HL))的研究结果见表1．将这些性状与A.纳米克特由Hadisoesilo等人提供[12］．先前已经使用了形态学分析，以研究蜂蜜蜜蜂的遗传变异[13］．


图1
Apis nigocincta.CAL01captured Mahakeret。
人物 长度(毫米) 长度(毫米)12］
头(高清) 3.57±0.08 N/A
天线（AT） 3.06±0.08 N/A
长鼻(PB) 4.15±0.18. 4.98
胸腔() 3.03±0.04 N/A
腹部(AB) 6.04±0.04 N/A
前翼（FW） 8.03±0.10 8.12
后翅(FL) 3.30±0.40 2.73
midleg（ml） 3.50±0.09 N/A
后腿（HL） 8.04±0.14 7.31
表1
形态学分析Apis nigocincta.CAL01。
3.2。分子分析

细胞色素氧化酶I（COI）序列A.纳米克特CAL01已存入GenBank，登录号为MK880239。完整的BLAST搜索显示在表中2．所有苏拉索米标本的位置如图所示2．由于许多序列具有72％查询盖，因此切割了一些样本的序列以匹配其他样本的长度。即便如此，百分比均为92.24％和100％。随着72％的查询封面，标本CAL01与来自印度尼西亚戈多洛省Gorontalo的Borontalo，Gorontalo DQ020233标本有100％的身份。随着100％的覆盖查询，标本CAL01与巴基斯坦伊斯兰堡的KY834222标本有92.24％的同一性。
Max。分数 总得分 查询封面（％） E值 身份百分比(%) 加入 地点
1099 1099 One hundred. ０．０ 99.50. AP018398.1 桑吉岛，北苏拉威西岛，印度尼西亚
1099 1099 One hundred. ０．０ 99.50. NC_038114.1 桑吉岛，北苏拉威西岛，印度尼西亚
1083. 1083. One hundred. ０．０ 99.01 KY799147.1 纳闽巴乔岛，中苏拉威西岛，印度尼西亚
856. 856. One hundred. ０．０ 92.24 KY834222.1 巴基斯坦,伊斯兰堡
804 804 72. ０．０ 100.00 DQ020233.1 Bogani Nani Wartabone N.P, Gorontalo，印度尼西亚
798 798 72. ０．０ 99.77 DQ020219.1 Kebon Kopi，中苏拉威西岛，印度尼西亚
793 793 72. ０．０ 99.54 DQ020232.1 Bogani Nani Wartabone n.p.， Gorontalo，印度尼西亚
793 793 72. ０．０ 99.54 DQ020228.1 唐科戈·巴劳兰斯N.P.，北苏拉威西岛，印度尼西亚
793 793 72. ０．０ 99.54 DQ020226.1. Manado，North Sulawesi，印度尼西亚
787 787 72. ０．０ 99.31 DQ020227.1 唐科戈·巴劳兰斯N.P.，北苏拉威西岛，印度尼西亚
776. 776. 72. ０．０ 98.85 DQ020229.1 Palolo，中部苏拉威西岛，印度尼西亚
776. 776. 72. ０．０ 98.85 DQ020222.1 Mamuju，南苏拉威西岛，印度尼西亚
776. 776. 72. ０．０ 98.85 DQ020220.1 Parigi，中部苏拉威西岛，印度尼西亚
688 688 72. ０．０ 95.17 DQ020225.1. Karaenta，南苏拉威西岛，印度尼西亚
688 688 72. ０．０ 95.17 DQ020221.1 Parepare，南苏拉威西岛，印度尼西亚
682 682 72. ０．０ 94.94 DQ020223.1 Bantinmurung，南苏拉威西岛，印度尼西亚
表2.
完成搜索。

图2
苏拉威西岛地图，显示了Manado市、Sangihe岛和nabuan Bajo的位置(地图来源:澳大利亚国立大学亚洲和太平洋学院)。

基于K2P模型的ML方法的分子系统发育分析如图所示3.．这棵树揭示了苏拉威西岛有三个主要的进化枝A.纳米克特标本。估计遗传距离中的遗传距离A.纳米克特如表所示3.．使用K2P模型进行分析[10]集成在Mega v10.0.4中[11］．内部遗传距离范围为0.000至0.055（不包括巴基斯坦标本）。桌子4显示了COI的多态核苷酸。共检测到26个多态性位点A.纳米克特．种内COI基因的变异表明过渡T↔C主导多态模式。


图3
基于Kimura 2参数模型的最大似然法分析分子发育分析[5］．
单 1 2 3. 4 5 6 7 8 9 19 11 12 13 14 15 16 17
1 AP018398.
2 NC038114. 0.009
3. KY799147 0.014 0.014
4 KY834222. 0.085 0.085 0.080
5 CAL01 0.007 0.007 0.011 0.082
6 DQ020233. 0.007 0.007 0.011 0.082 0．000
7 DQ020219 ０．００５ ０．００５ 0.009 0.080 ０．００２ ０．００２
8 DQ020232 ０．００２ 0.007 0.012 0.083 ０．００５ ０．００５ ０．００２
9 DQ020228. ０．００２ 0.007 0.012 0.083 ０．００５ ０．００５ ０．００２ 0．000
10 DQ020226. 0.007 ０．００２ 0.012 0.083 ０．００５ ０．００５ ０．００２ ０．００５ ０．００５
11 DQ020227. 0.009 ０．００５ 0.009 0.080 0.007 0.007 ０．００５ 0.007 0.007 ０．００２
12 DQ020229. 0.014 0.014 ０．００５ 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009
13 DQ020222 0.014 0.014 ０．００５ 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009 0．000
14 DQ020220 0.014 0.014 ０．００５ 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009 0．000 0．000
15 DQ020225 0.048 0.052 0.043 0.075 0.050 0.050 0.048 0.045 0.045 0.050 0.048 0.043 0.043 0.043
16 DQ020221. 0.048 0.052 0.043 0.075 0.050 0.050 0.048 0.045 0.045 0.050 0.048 0.043 0.043 0.043 0．000
17 DQ020223. 0.050 0.055 0.045 0.078 0.052 0.052 0.050 0.048 0.048 0.053 0.050 0.045 0.045 0.045 ０．００２ ０．００２
表3
估计选择的单倍型之间的进化差异。
COI多态核苷酸位点
单/创银行
acc。数字		 地点 1873年 1954 1961年 1963年 1984年 1988年 2017年 2032. 2053. 2059 2065 2086 2096 2098 2113. 2143. 2015年 2018年 2027. 2028. 2036. 2042年 2052年 2076 2078 2090
AP018398. Sangihe，North Sulawesi C C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T T C T T T C T T
DQ020232 Bogani Nani WB，北苏拉威西岛 T C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T T C T T T C T T
DQ020228. 唐科科，北苏拉威西 T C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T T C T T T C T T
NC038114. Sangihe，North Sulawesi T C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T C C C C T T C T T
DQ020226. Manado，North Sulawesi T C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T C C C T T C T T
DQ020227. 唐科科，北苏拉威西 T C C 一个 一个 T 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T C C C T T C T T
CAL01 Manado，North Sulawesi T C C 一个 一个 C 一个 一个 C T T 一个 C T C G T T C C T T T C T T
DQ020233. Bogani Nani WB，北苏拉威西岛 T C C 一个 一个 C 一个 一个 C C T 一个 C T C G T T C C T T T C T T
DQ020219 苏拉威西中部Kebun Kopi T C C 一个 一个 C 一个 一个 C C T 一个 C T C G T T C C T T T C T T
KY799147 纳闽巴乔岛，苏拉威西岛中部 T C C 一个 一个 T 一个 一个 C T T 一个 C T C 一个 T T C C T T T C T C
DQ020229. Palolo，中部苏拉威西岛 T C C G 一个 T 一个 一个 C T T T C T C 一个 T T C C T T T C T C
DQ020222 Mamuju，南苏拉威西 T C C G 一个 T 一个 一个 C T T 一个 C T C 一个 T T C C T T T C T C
DQ020220 苏拉威西中部Parigi T C C G 一个 T 一个 一个 C T T 一个 C T C 一个 T T C C T T T C T C
DQ020225 Karaenta，南苏拉威西 T T T 一个 G T T T T T 一个 一个 T 一个 T 一个 T T T T T 一个 C T 一个 C
DQ020221. Parepare、南苏拉威西岛 T T T 一个 G T T T T T 一个 一个 T 一个 T 一个 T T T T T 一个 C T 一个 C
DQ020223. Bantinmurung、南苏拉威西岛 T T T 一个 G T T T T T 一个 一个 T 一个 T 一个 C T T T T 一个 C T 一个 C
颠换(电视)/过渡(Ts) Ts Ts Ts Ts Ts Ts 电视v 电视 电视 Ts 电视 电视 Ts 电视 Ts Ts Ts Ts Ts Ts Ts 电视 Ts Ts 电视 Ts
表4.
COI的单倍型和多态核苷酸。

使用最大复合似然法对代换的估计见表5．不同的转换替代率以斜体显示的粗体和横向替换为主。值的总和 等于100。过渡取代次数为86.89次，取代次数为13.11次。因此，转换/转换比(ti/tv)为6.63。然而，采样大小对ti/tv有很大的影响。估计的最大似然ti/tv偏差(R)在K2P模型下为9.05 [10］．
一个 T C G
一个 - - - - - - 2.68 1.05 8.34
T 2.16 - - - - - - 14.46 0.66
C 2.16 36.82 - - - - - - 0.66
G 27.27 2.68 1.05 - - - - - -
表5.
使用最大复合似然法估计核苷酸取代模式。

4.讨论

参考HadisoOSILO等人进行的变形分析。［12，以及其他的物理特性，人们相信被研究的蜜蜂是Apis nigocincta.(图1）.然而，由于缺乏研究人员的专业知识，这种方法仍然存在不足。因此，需要一种更简单但更精确的方法。利用COI基因进行DNA条形码是目前广泛使用的昆虫鉴定方法之一。COI基因已被广泛用于昆虫种间和种内多样性评价[14］．它还用于补充传统的基于形态学的鉴定，以获得更准确的物种鉴定结果[6］．使用COI基因的蜂蜜蜜蜂在蜂蜜蜜蜂中的若干研究已经由几个研究人员进行了[5，15- - - - - -18］．因此，本研究仍需进行分子鉴定。经使用COI基因确认后，确定所研究的标本为A.纳米克特．

如图所示3.，标本基于位置进行分组。第一组是来自北苏拉威西的第二个，第二个是来自苏拉威西中部，第三个是来自南苏拉威病。然而，来自Kebun Kopi Central Sulawesi的标本DQ020219与北苏拉威西群集团聚集在一起。这可能是因为Kebun Kopi的位置非常靠近位于北苏拉威西州的波格尼纳尼·瓦滨国家公园。在苏拉留下标本中本研究中呈现的数据的低核苷酸变化表明，没有地理分离，因此该基因在不受限制的人群中飞行，特别是在附近的位置。

来自巴基斯坦伊斯兰堡的KY834222标本被观察到不属于苏拉威西岛组。在它的姐妹物种组成的系统进化树中，答:cerana， KY834222标本被归为一类答:cerana粳稻(数据没有显示)。Damus和Otis的研究支持了这一现象[19的几个亚种答:cerana和答:cerana粳稻被证实与其他部分不同答:cerana．这表明Apis nigocincta.在巴基斯坦发现的尸体很可能是该组织的成员答:cerana粳稻．另一项发现表明A.纳米克特来自苏拉威西大陆和桑吉岛的答:cerana组[20.］．系统发育分析与形态学和分子生物学证据一致，表明A.纳米克特有相似之处答:cerana［21，22］．

单倍型CAL01与印度尼西亚Gorontalo Bogani Nani Wartabone国家公园的DQ020233的遗传距离最近，为0.000。单倍型CAL01与巴基斯坦伊斯兰堡的KY834222的遗传距离为0.082，与印度尼西亚南苏拉威西省班提穆隆的DQ020223的遗传距离为0.052。来自北苏拉威西岛(印度尼西亚)的NC038114与DQ020223的遗传距离为0.055。利用这个值，Takahasi等人[23说明A.纳米克特在苏拉威西岛保持了高度的遗传多样性。

遗传距离计算结果表明，尽管测试的标本来自远程位置，但除了来自巴基斯坦的标本之外，它仍然在内部变异范围内。最大成对距离蜜蜂在中国和巴基斯坦的10个地点为0.039 [18］．巴基斯坦的单倍型结果是0.027，中国的单倍型结果是0.010。其中最大的成对距离为0.053答:cerana发现弗洛雷斯和台湾的单倍型[24］．基因距离越近，被比较的生物体之间的亲属关系就越近[25］．不同的地理条件和偏远的地点会导致一个物种有相当高的遗传变异，通常以形态差异为特征[26，27］．在各种物种上缺乏数据收集和形态识别过程的依赖性导致对具有相似形态结构但由于遗传变异而被归类为不同物种的物种的辩论[28，29］．群体或个体之间的遗传距离的价值越大，它们彼此越多。遗传距离表示地理隔离对人群的影响的可能性[30.，31］．

早期未提供关于多态位点的信息A.纳米克特．然而，检测到6个多态性位点轰炸oreanus在中国[32),的蜜蜂在美国[33］．发现过渡T≠C的主导地位答:cerana在印度[34］．由于分子机制的原因，跃迁比平移的频率更高。此外，这种转变倾向于产生较少的氨基酸取代。因此，这种转变往往更加稳定，是作为一个种群中的单核苷酸多态性的一种无声的替代[25］．

COI基因的区分能力答:nigcrocinta来自苏拉威西岛不同地区的一群人已经在这项研究中得到证实。这个分子标记也能够识别A.纳米克特成功基于与其他相似性序列A.纳米克特标本。这一发现为COI作为分子标记在系统发育研究中的有效利用提供了有价值的信息。

5.结论

目前的研究评估了内部遗传变异A.纳米克特使用COI基因序列。结果表明，苏拉威西岛标本主要有北、中、南三个支系。这一发现表明，在A.纳米克特在苏拉威西仍然存在于内部变异的范畴。

数据可用性

与这篇文章相关的数据可由通讯作者提供。

的利益冲突

提交人声明有关本文的出版物没有利益冲突。

致谢

作者希望感谢研究生项目和生物学系，数学学院，和自然科学系，萨姆拉图兰吉大学，为进行研究提供了地方。作者还感谢Gracia A. V. Pollo在手稿准备方面的帮助。

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