科学 科学 2090-908X 印第安人 10。1155/2020/1609473 1609473 研究文章 评估遗传变异 蜜蜂nigrocincta（膜翅目：apidae）在苏拉威西州，部分线粒体细胞色素氧化酶I基因序列揭示了 伦波吉亚 克里斯蒂安·A（Christian A.） 1 2 Posangi Jimmy 3 Pollo Hard N. 4 塔隆 最大限度 1 https://orcid.org/0000-0002-7963-7527 塔利 Trina E. 5 CAO 杨 1 Entomology Study Program 研究生课程 Universitas Sam Ratulangi Manado 北苏拉威西 印度尼西亚 unsrat.ac.id 2 护理研究计划 护理学院 Universitas Katolik De La Salle Manado 北苏拉威西 印度尼西亚 3 公共卫生研究计划 公共卫生学院 Universitas Sam Ratulangi Manado 北苏拉威西 印度尼西亚 unsrat.ac.id 4 林业科学研究计划 Faculty of Agriculture Universitas Sam Ratulangi Manado 北苏拉威西 印度尼西亚 unsrat.ac.id 5 Department of Biology 数学和自然科学学院 Universitas Sam Ratulangi Manado 北苏拉威西 印度尼西亚 unsrat.ac.id 2020 7 4 2020 2020 12 12 2019 18 03 2020 7 4 2020 2020 版权所有©2020 Christian A. Lombogia等。 这是根据Creative Commons归因许可分发的开放访问文章，该文章允许在任何媒介中不受限制地使用，分发和复制，前提是适当地引用了原始作品。

亚洲腔巢蜜蜂 蜜蜂nigrocincta, a native bee species from Sulawesi and the Philippines, plays a vital role in pollinating flowering plants in local ecosystem and agriculture. In this study, we assessed the intraspecific genetic variation of A. nigrocincta使用细胞色素C氧化酶亚基I（COI）的序列。分子系统发育分析表明，有三个主要进化枝 A. nigrocincta来自苏拉威西的标本基于其各自的位置（北，中部和南苏拉威西）。使用Kimura 2参数（K2P）模型的遗传距离分析表明，Sulawesi标本中种内遗传距离为0.000至0.055。Sulawesi中有26个核苷酸多态性位点 A. nigrocincta。变异由过渡T↔C主导。分子鉴定结果得到了形态鉴定的支持。两种方法的结果都同意，所研究的标本是 A. nigrocincta。遗传距离计算的结果表明，尽管测试的标本是从远程位置得出的，但遗传变异仍在种内变异范围内。

 1.简介

There are about 30,000 bee species distributed worldwide. About 17,000 of them have been described [ 1]。其中，约有20,000种属于超家族apoidea [ 2]。阿皮迪（Apidae）是该超家族中最大的家族，至少含有5,700种蜜蜂[ 3]。Honey bees are included in the genus 蜜蜂。These insects play a significant role in the pollination of important crops. Currently, there are nine species of honey bees known to inhabit the world: Apis Dorsata, A. Laboriosa, A. Mellifera, A. Florea, A. andreniformis, A. Cerana, A. Koschevnikovi, A. nigrocincta（Sulawesi，印度尼西亚和棉兰老岛，菲律宾），以及 A. nuluensis（印度尼西亚卡利曼丹），约有44个亚种[ 4]。

蜜蜂由于其单倍体性别确定的机制而容易灭绝，由于人为活性，人口有限[ 5]和低种内遗传变异。种内遗传变异 A. nigrocincta对研究很差。近年来，分子方法已应用于研究种内遗传变异，物种鉴定和密切相关类群之间的系统发育关系[ 6]。用于此目的的一种技术是DNA条形码。该方法已应用于保护生物学领域，因为它提供了与野生动植物保护管理有关的信息[ 7]。对于动物，用于DNA条形码的区域是细胞色素C氧化酶I（COI）基因。在这项研究中，我们检查了种内变异 A. nigrocincta促进物种鉴定并分析其遗传距离。

 2. Materials and Methods 2.1。样品采集

成年工人的蜜蜂是使用印度尼西亚北苏拉威西省Manado市Mahakeret村庄的一个废弃当地花园（1°28’53” N和124°50’21 e）捕获的。该位置位于海拔约40米的高度。样品收集位置的平均温度（2019年3月）在29°C和32°C之间，湿度为85-89％。植被覆盖率为80％。植被主要由灌木丛，草和野花组成 斑马tribata（L.）Pruski， Tachytarpheta Jamaicensis（L.）Vahl。 Mikania Microntha昆斯。

 2.2。形态分析

观察到的形态特征包括以下部分的长度：头部（HD），天线（AT），长鼻（Pb），胸腔（TO），腹部（AB），前翼（FW），后翼（FL），Midleg（ML）和Hind-Leg（HL）使用卡钳[ 8]。

 2.3. Molecular Identification 2.3.1. Sample Preparation, PCR, and Sequencing

使用ZR组织和昆虫DNA MiniPREP™（Zymo Research）从COXA中提取总DNA。用DNA清洁和浓缩量™-5（DCC™-5）（Zymo Research）清洁基因组DNA，用于生成PCR的高质量DNA。使用Toyobo KOD FX NEO PCR Master混合使用引物对LCO1490和HCO2198 [ 6]。PCR的状况包括在95°C下2分钟的初始变性2分钟，然后在98°C下进行35个变性10秒，在54°C下退火30秒，在68°C下伸长45秒，再延伸45秒，再延伸，以延长5秒。 min at 68°C. The PCR products were sequenced bidirectionally using the same PCR primer pairs at 1st BASE DNA Sequencing Services Malaysia.

 2.3.2. Analysis of COI Data

像以前完成的色谱图接受了该过程[ 9]。样品的干净COI序列沉积在Genbank（ http://www.ncbi.nlm.nih.gov）。使用同一平台提供的爆炸身份搜索进行识别。使用Clustal O（1.2.1）多个序列对齐（1.2.1）对齐清洁序列（ http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo）与从Genbank检索到的苏拉威西不同部分的其他相关蜜蜂COI序列。进化史是通过基于木村2参数（K2P）模型的最大似然（ML）方法来推断的。 10]。在Mega V10.0.4中进行了进化分析[ 11]。

 3.结果 3.1。形态分析

从Manado Mahakeret获得的蜜蜂标本的照片如图所示 1。本文的标本称为cal01。honey蜜蜂的九个主要形态特征的结果是通过首字母缩写为头的长度（HD），天线（AT），长鼻（Pb），胸腔（TO），腹部（AB），前翼（FW），（FW），（FW），表中呈现后翼（FL），Midleg（ML）和Hind-Leg（HL） 1。将这些字符与 A. nigrocincta由Hadisoesilo等人提供。[[ 12]。形态分析先前已用于研究蜜蜂的遗传变异性[ 13]。

蜜蜂nigrocinctacal01capped在Mahakeret中。

形态分析 蜜蜂nigrocinctaCal01。

人物 长度（mm） 长度（mm）[ 12]
头（高清） 3.57±0.08 N/A。
天线（AT） 3.06 ± 0.08 N/A。
Proboscis (PB) 4.15±0.18 4.98
胸 3.03 ± 0.04 N/A。
腹部（AB） 6.04 ± 0.04 N/A。
前翼（FW） 8.03±0.10 8.12
后翼（FL） 3.30±0.40 2.73
Midleg（ML） 3.50 ± 0.09 N/A。
Hind-leg (HL) 8.04±0.14 7.31
3.2。分子分析

细胞色素氧化酶I（COI）序列 A. nigrocinctaCal01已沉积在GenBank，登录号MK880239。完整的爆炸搜索显示在表中 2。所有Sulawesi标本的位置如图所示 2。Because many sequences have 72% query cover, the sequences of some specimens were cut to match the length of other specimens. Even so, percent identity ranged between 92.24% and 100%. With a 72% query cover, the specimen CAL01 had a 100% identity with the DQ020233 specimen from Bogani Nani Wartabone National Park, Gorontalo, Indonesia. With a 100% cover query, the specimen CAL01 had a 92.24% identity with the KY834222 specimen from Islamabad, Pakistan.

完整的爆炸搜索。

最大限度。分数 总得分 查询盖（％） e值 身份百分比（％） Accession 地点
1099 1099 100 0.0 99.50 AP018398.1 印度尼西亚北苏拉威西的Sangihe岛
1099 1099 100 0.0 99.50 NC_038114.1 印度尼西亚北苏拉威西的Sangihe岛
1083 1083 100 0.0 99.01 KY799147.1 印度尼西亚中部苏拉威西中部的Labuan Bajo
856 856 100 0.0 92.24 KY834222.1 伊斯兰堡，巴基斯坦
804 804 72 0.0 100.00 DQ020233。1 Bogani Nani Watabone N.P，印度尼西亚Gorontalo
798 798 72 0.0 99.77 DQ020219.1 Kebon Kopi, Central Sulawesi, Indonesia
793 793 72 0.0 99.54 DQ020232.1 Bogani Nani Watabone N.P.，印度尼西亚Gorontalo
793 793 72 0.0 99.54 DQ020228.1 印度尼西亚北苏拉威西的Tangkoko Batuangus N.P.
793 793 72 0.0 99.54 DQ020226。1 印度尼西亚北苏拉威西的Manado
787 787 72 0.0 99.31 DQ020227.1 印度尼西亚北苏拉威西的Tangkoko Batuangus N.P.
776 776 72 0.0 98.85 DQ020229.1 帕洛洛，印度尼西亚中部苏拉威西中部
776 776 72 0.0 98.85 DQ020222。1 印度尼西亚南苏拉威西的Mamuju
776 776 72 0.0 98.85 DQ020220。1 帕里吉，印度尼西亚中部苏拉威西中部
688 688 72 0.0 95.17 DQ020225.1 印度尼西亚南苏拉威西的卡拉恩塔
688 688 72 0.0 95.17 DQ020221.1 南苏拉威西州的Preepare, Indonesia
682 682 72 0.0 94.94 DQ020223.1 南苏拉威西的班丁穆朗, Indonesia

苏拉威西岛的地图显示了Manado City，Sangihe Island和Labuan Bajo的位置（地图来源：澳大利亚国立大学亚洲和太平洋学院）。

The molecular phylogenetic analysis by the ML method based on the K2P model is shown in Figure 3。这棵树揭示了苏拉威西有三个主要进化枝 A. nigrocincta标本。估计遗传距离 A. nigrocincta显示在表中 3。使用K2P模型[ 10]集成在Mega V10.0.4 [ 11]。种内遗传距离范围为0.000至0.055（不包括来自巴基斯坦的标本）。桌子 4shows the polymorphic nucleotides of the COI. Twenty-six polymorphic sites were detected within A. nigrocincta。种内COI基因的变异表明，过渡t c占据了多态性模式。

基于木村2参数模型的最大似然法分子系统发育分析[ 5]。

Estimation of evolutionary divergence between selected haplotypes.

单倍型 1 2 3 4 5 6 7 8 9 19 11 12 13 14 15 16 17
1 AP018398
2 NC038114 0.009
3 KY799147 0.014 0.014
4 KY834222 0.085 0.085 0.080
5 Cal01 0.007 0.007 0.011 0.082
6 DQ020233 0.007 0.007 0.011 0.082 0.000
7 DQ020219 0.005 0.005 0.009 0.080 0.002 0.002
8 DQ020232 0.002 0.007 0.012 0.083 0.005 0.005 0.002
9 DQ020228 0.002 0.007 0.012 0.083 0.005 0.005 0.002 0.000
10 DQ020226 0.007 0.002 0.012 0.083 0.005 0.005 0.002 0.005 0.005
11 DQ020227 0.009 0.005 0.009 0.080 0.007 0.007 0.005 0.007 0.007 0.002
12 DQ020229 0.014 0.014 0.005 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009
13 DQ020222 0.014 0.014 0.005 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009 0.000
14 DQ020220 0.014 0.014 0.005 0.078 0.012 0.012 0.009 0.012 0.012 0.012 0.009 0.000 0.000
15 DQ020225 0.048 0.052 0.043 0.075 0.050 0.050 0.048 0.045 0.045 0.050 0.048 0.043 0.043 0.043
16 DQ020221 0.048 0.052 0.043 0.075 0.050 0.050 0.048 0.045 0.045 0.050 0.048 0.043 0.043 0.043 0.000
17 DQ020223 0.050 0.055 0.045 0.078 0.052 0.052 0.050 0.048 0.048 0.053 0.050 0.045 0.045 0.045 0.002 0.002

COI的单倍型和多态核苷酸。

COI多态核苷酸位点
单倍型/一代银行ACC。数字 地点 1873年 1954年 1961年 1963年 1984 1988 2017 2032 2053 2059 2065 2086 2096 2098 2113 2143 2015 2018 2027 2028 2036 2042 2052 2076 2078 2090
AP018398 Sangihe，北苏拉威西 C C C A A C A A C T T A C T C G T T T C T T T C T T
DQ020232 Bogani Nani WB, North Sulawesi T C C A A C A A C T T A C T C G T T T C T T T C T T
DQ020228 Tangkoko, North Sulawesi T C C A A C A A C T T A C T C G T T T C T T T C T T
NC038114 Sangihe，北苏拉威西 T C C A A C A A C T T A C T C G T C C C C T T C T T
DQ020226 北苏拉威西的Manado T C C A A C A A C T T A C T C G T T C C C T T C T T
DQ020227 Tangkoko, North Sulawesi T C C A A T A A C T T A C T C G T T C C C T T C T T
Cal01 北苏拉威西的Manado T C C A A C A A C T T A C T C G T T C C T T T C T T
DQ020233 Bogani Nani WB, North Sulawesi T C C A A C A A C C T A C T C G T T C C T T T C T T
DQ020219 Kebun Kopi，中央苏拉威西 T C C A A C A A C C T A C T C G T T C C T T T C T T
KY799147 苏拉威西中部的Labuan Bajo T C C A A T A A C T T A C T C A T T C C T T T C T C
DQ020229 Palolo, Central Sulawesi T C C G A T A A C T T T C T C A T T C C T T T C T C
DQ020222 南苏拉威西的Mamuju T C C G A T A A C T T A C T C A T T C C T T T C T C
DQ020220 Parigi, Central Sulawesi T C C G A T A A C T T A C T C A T T C C T T T C T C
DQ020225 卡拉恩塔，南苏拉威西 T T T A G T T T T T A A T A T A T T T T T A C T A C
DQ020221 南苏拉威西州的Preepare T T T A G T T T T T A A T A T A T T T T T A C T A C
DQ020223 南苏拉威西的班丁穆朗 T T T A G T T T T T A A T A T A C T T T T A C T A C
横向（电视）/过渡（TS） TS TS TS TS TS TS 电视V。 电视 电视 TS 电视 电视 TS 电视 TS TS TS TS TS TS TS 电视 TS TS 电视 TS

使用最大复合可能性方法的替代估计可以在表中看到 5。不同的过渡替代率以斜体图显示的粗体和横向替代显示。值的总和 v 等于100。过渡替代的数量为86.89，而替换的数量为13.11。因此，过渡/横向比率（TI/TV）为6.63。但是，采样大小强烈影响TI/TV。估计的最大似然ti/电视偏见（ R）在K2P模型下为9.05 [ 10]。

Estimation of the nucleotide substitution pattern using the maximum composite likelihood method.

A T C G
A — 2.68 1.05 8.34
T 2.16 — 14.46 0.66
C 2.16 36.82 — 0.66
G 27。27 2.68 1.05 —
4。讨论

指的是Hadisoesilo等人进行的形态分析。[[ 12]，以及其他身体特征，据信被研究的蜜蜂是 蜜蜂nigrocincta(Figure 1）。然而，由于研究人员缺乏专业知识，这种方法仍然具有短暂的影响。因此，需要一种更简单但更准确的方法。一种用于识别已广泛使用的昆虫的方法是使用COI基因进行DNA条形码。该COI基因已被广泛用于评估昆虫的种内和种内多样性[ 14]。It is also used to complement traditional morphological-based identification to get more accurate species identification results [ 6]。几位研究人员已经对蜜蜂中的DNA条形码进行了几项研究[ 5, 15– 18]。Therefore, molecular-based identification was still carried out in this research. After being confirmed using the COI gene, it was ascertained that the specimen being studied was A. nigrocincta。

As shown in Figure 3，根据位置对样品进行分组。第一组来自北苏拉威西，第二组来自苏拉威西中部，第三组来自南苏拉威西。然而，来自苏拉威西中部的Kebun Kopi Central的标本DQ020219与North Sulawesi组聚集在一起。这可能是因为Kebun Kopi的位置非常接近位于苏拉威西北部的Bogani Nani Watabone国家公园。苏拉威西标本中提出的数据中介绍的数据中的核苷酸变化表明，没有地理分离，因此基因在不受限制的人群中飞行，尤其是在附近的地方。

观察到来自巴基斯坦伊斯兰堡的Ky834222标本来自苏拉威西人群。在涉及其姊妹物种所产生的系统发育树中， A. Cerana，可以看到标本Ky834222与 A. Ceranajaponica（数据未显示）。这种现象得到了Damus和Otis [ 19]指出几个亚种 A. Ceranaand A. Ceranajaponica被确认与其余部分不同 A. Cerana。这表明 蜜蜂nigrocincta在巴基斯坦发现很可能是该小组的一部分 A. Ceranajaponica。另一个发现表明 A. nigrocincta来自苏拉威西大陆和桑吉伊岛的 A. Cerana团体 [ 20]。系统发育分析与形态学和分子证据一致，表明 A. nigrocincta与之相似 A. Cerana[[ 21, 22]。

最接近的遗传距离为0.000，在印度尼西亚Gorontalo（印度尼西亚）的Bogani Nani Watabone国家公园的单倍型Cal01和DQ020233之间。最远的遗传距离为0.082，在伊斯兰堡（巴基斯坦）的单倍型Cal01和Ky834222之间，来自南苏拉威西（印度尼西亚）的Bantimurung的DQ020223与DQ020223为0.052。来自桑吉岛北苏拉威西（印度尼西亚）和DQ020223的NC038114之间的遗传距离为0.055。有了这个值，高哈西等。[[ 23]说 A. nigrocincta在苏拉威西岛上保持了高特异性遗传多样性。

遗传距离计算的结果表明，尽管测试的标本是从远程位置得出的，但除了巴基斯坦的标本外，它仍在种内变异的范围内。最大成对距离的 A. Mellifera在中国和巴基斯坦的10个地点为0.039 [ 18]。巴基斯坦的单倍型的结果是0.027，中国的单倍型为0.010。最大成对距离0.053 A. Cerana在弗洛雷斯和台湾的单倍型之间被发现[ 24]。The closer the genetic distance, the closer the kinship among the organisms being compared [ 25]。Different geographical conditions and remote locations can cause fairly high genetic variation in a species and are usually characterized by morphological differences [ 26, 27]。The lack of data collection on various species and the dependence of the morphological identification process have led to debate for species that have similar morphological structures but are classified as different species due to genetic variation [ 28, 29]。The greater the value of genetic distance between populations or individuals, the more isolated they are from one another. Genetic distance indicates the possibility of the influence of geographical isolation on a population [ 30, 31]。

较早的多态位点没有提供任何信息 A. nigrocincta。但是，在 轰炸韩美in China [ 32] 和 蜜蜂mellifera在美国 [ 33]。发现过渡t c占主导地位的变化 A. Cerana在印度 [ 34]。由于分子机制，过渡频率比横向更高的频率更高。此外，过渡往往会产生较少的氨基酸取代。因此，过渡往往更加稳定，并且是一个人群中的单个核苷酸多态性，是一种无声的替代。 25]。

COI基因区分的能力 A. nigcrocinta在这项研究中已经证明了苏拉威西不同地点的组。该分子标记也能够识别 A. nigrocincta成功地基于与其他的相似性序列 A. nigrocincta标本。这一发现提供了有关在系统发育研究研究中有效使用COI作为分子标记的宝贵信息。

 5。结论

当前的研究评估了种内遗传变异 A. nigrocincta使用COI基因序列。结果表明，苏拉威西标本的三个主要进化枝，即北，中部和南苏拉威西。这一发现表明遗传变异 A. nigrocincta在Sulawesi中仍处于种内变异的类别中。

 数据可用性

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 利益冲突

作者宣布，本文的出版没有利益冲突。

 致谢

作者要感谢研究生计划和生物学系，数学学院和自然科学，Sam Ratulangi大学，提供了进行研究的场所。作者还感谢Gracia A. V. Pollo在手稿准备中的帮助。

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