文摘
它们有着蓬勃发展的永久维持在接近于零的温度下合成cold-active酶细胞周期。基因组序列、蛋白质组和转录组研究表明各种自适应特性保持足够的翻译和寒冷的条件下适当的蛋白质折叠。大多数嗜冷酶优化高低温活性的底物亲和力,因此减少了自由过渡态的能量势垒。此外,疲软的温度依赖性的活动确保温和的还原催化活性的冷。在这些自然进化酶,达到优化低温活动通过不稳定的结构轴承整个分子的活性部位或不稳定。这涉及到减少的数量和所有类型的弱相互作用强度或稳定性因素的消失,导致改善动力学活性部位残留的冷。这些酶已经用于许多生物技术的应用程序要求活动在温和的温度或快速heat-inactivation率高。该领域的一些开放式问题也突出显示。
1。介绍
“应对寒冷的星球”(1),最近的评论的标题明确强调经常被忽视的方面:地球生物圈的主要是寒冷和永久暴露在温度低于5°C。如此低的平均温度主要源自于这样一个事实:地球表面的71%被海洋覆盖,2 - 4°C的一个恒定的温度低于1000米深度,无论纬度。极地地区占15%,冰川和高山地区必须添加以及冻土代表超过20%的陆地土壤。虽然荒凉,所有这些低温生物栖地成功地征服了低温生物(图1)。它们永久地冷环境中茁壮成长在热平衡(媒介),甚至在零度以下的温度过冷液体水。遇到这样的极端寒冷的条件,例如,在咸cryopegs−10°C在北极永冻层(2,3),在极地海冰晶体之间的盐水静脉−20°C (4- - - - - -6),或在过冷云滴7,8]。不寻常的microbiotopes也被描述,如多孔岩石在南极干谷举办微生物群落生存−60°C (9,10]。冰穴冰川表面代表另一个永久冷生活小区举办复杂微生物群落(11,12]。这些例子说明了未知的它们适应低温的能力。
它们包括一个大范围的代表所有的三个领域:细菌,古生菌,真核生物。它们主要是由微生物如细菌(13- - - - - -16),古生菌(17],藻类[18),或酵母19)也由植物和动物(20.,21]。值得注意的是,极地鱼类蓬勃发展下的冰雪世界是最大的它们[22- - - - - -24]。冰川冰蠕虫也值得一提,因为他们完成他们的生命周期只在冰川冰(25]。所有这些例子说明它们有着最丰富的极端微生物的生物量、多样性和分布。
它们不仅仅生存或忍受极端的不利条件下,但不可逆转地适应这样的环境,他们大多数人无法增长温和(或嗜中温)的温度。这些极端微生物代表比生物的好奇心。它们有着和他们的生物分子已经发现各种应用程序,但它们在生物地球化学循环中的作用常常被低估:巨大的海洋生活小区容量代表它们最大的水库造成物质循环。各个方面的生态学、生理学和分子适应已报告在以前的出版物(26- - - - - -30.]。
生活在寒冷环境中需要大量的自适应特性在几乎所有水平细胞的结构和功能。的确,冷产生严重的物理化学生物限制包括增加水的粘度,减少分子扩散率,降低生化反应速率、弱相互作用的微扰驾驶分子识别和互动,加强氢键,例如,稳定抑制核酸结构,气体的溶解度增加,有毒代谢产物的稳定性以及降低细胞膜的流动性1,31日,32]。自适应特性,这些约束经常发现在嗜冷微生物的基因组序列33- - - - - -36]。事实上,一些从嗜冷细菌和archea基因组已经测序(37- - - - - -46),最近也第一个基因组的极地真核microalga报道(47]。在这方面,最近改善高通量测序产生了大量的数据,但大多数这些基因组仍有待分析(36,48- - - - - -55]。
然而,在寒冷的适应生活的一个关键因素在于驱动微生物代谢的蛋白质功能和细胞周期。开拓在分子水平上对它们的研究主要是集中在cold-active酶因为这方面被认为是对环境适应的先决条件。它已被证明,高水平的特定活动的低温酶在低温下是一个关键的适应补偿指数降低化学反应速率随着温度降低。如此高的biocatalytic活动起源于消失的各种共价的稳定的相互作用,导致一种改进酶构象的灵活性。应该注意的是,这个自适应特性是由基因编码的蛋白质序列和长期选择的结果。一般图片,好寒性的酶都是面临的主要约束,是活跃在低温下,但达到这一目标的方法是相当多样化。的主要功能和结构自适应特性cold-active酶是这里介绍以及最新进展相关的合成,折叠和生物技术的应用程序。本文是基于更新以前的出版物(56- - - - - -64年]。
2。蛋白质合成和折叠
多年来,蛋白质合成和蛋白质折叠视为热敏细胞过程,严重限制低温微生物的增长没有特定的适应性(65年- - - - - -70年]。尽管这公认的限制,蛋白质合成和折叠的挑战在它们最近才解决,主要是通过蛋白质组学,在较小程度上,转录组36,62年]。这些方法产生了大量的数据,但是,对比冷适应的模式(43,55,71年- - - - - -95年]。事实上,低温蛋白质差异表达,要么冷诱导或压抑,不构成守恒的组蛋白的识别和表达水平在这些生物。这套装置一直认为冷适应既存的细胞组织,因此,各种好寒性的生物之间的自适应策略可能不同(35,62年]。然而,蛋白质合成和折叠而言,一些趋势已经指出。
2.1。翻译
在南极细菌p . haloplanktis在4°C, 30%的调节蛋白是蛋白质合成(直接相关83年]。得出蛋白质合成可能是病原反应一步生长在寒冷的,因此诱导补充细胞反应。类似的模式确实观察到几个冷细菌(76年,78年,80年,84年,85年参与翻译),过表达蛋白质的组件。更具体地说,核糖体合成的蛋白质和RNA陪伴的96年,97年]似乎低温刺激[43,55,75年,78年- - - - - -81年,84年]。在archaeonm . burtonii,的一个显著特征是upregulation参与维护RNA的基因状态适合翻译,使翻译起始(86年]。在基因组层面,一个有趣的观察是相对较高的核糖体rna基因和tRNA基因(106个基因,有时组织长跑的重复序列),至少在p . haloplanktis(39),c . psychrerythraea(40),而p . ingrahamii(42]。这可能反映了需要翻译在寒冷的高容量。此外,RNA解旋酶在低温中发现了许多嗜冷微生物等m . burtonii(98年),大肠sibiricum(43),美国alaskensis(84年),p . arcticus(80年,81年),美国denitrificans(55),而p . haloplanktis(83年]。这些解旋酶有助于放松的RNA二级结构有效的翻译在寒冷的(99年]。这些例子表明,它们确实进化自适应机制来优化低温蛋白质合成。
2.2。折叠的援助
一些有趣的报道显示,低温伴侣如DnaK [One hundred.,101年]和GroEL [102年- - - - - -104年)中表达大肠杆菌提供、提高嗜中温细菌的增长和较低的温度,因此强调的关键监护人参与温度适应微生物。
在各种监护人参与蛋白质折叠援助(105年),ribosome-bound触发因子(TF)值得特别提到。TF是第一个女伴cotranslationally互动与几乎所有新生多肽合成核糖体,和大多数小型蛋白质(~ 70%)可以折叠迅速合成没有进一步的援助。有趣的是,TF是一种冷休克蛋白大肠杆菌(106年),而其他监护人是众所周知的热休克蛋白(休克)。这一重大区别似乎对它们有着至关重要。事实上,过度的低温特遣部队一直在观察一些低温微生物(75年,79年,83年,87年]HSP陪伴的差别而对这些指出[43,73年,88年]。考虑到这种失衡在女伴机械(图2),看来特遣部队营救伴侣蛋白功能和应被视为主要的女伴在这些菌株(83年]。HSP陪伴的差别,对这些冷表明这些折叠助理主要是合成在瞬变高环境温度下(62年]。
相比之下,镇压TF合成或upregulation HSP chaperonins已经报道的80年,81年,84年]。此外,美国alaskensis拥有两套dnaK-dnaJ-grpE基因簇(DnaK及其cochaperones)。定量蛋白质组学建议一套函数作为低温伴护系统,而另一组函数增长的温度更高(84年]。很明显,不同的策略已经被它们协助采用适当的蛋白质折叠。
2.3。脯氨酸异构化
的顺式反式-异构化的peptidyl-prolyl债券,即肽键前的脯氨酸残基(图3),本质上是一个缓慢的反应。因此,脯氨酸异构化是大多数蛋白质的折叠的病原反应步骤(107年]。专门为好寒性的蛋白质越多,自发的脯氨酸的异构化反应速率也应低温慢了下来。有趣的是,许多御寒的蛋白质往往具有降低脯氨酸含量(57,60,108年]应该减弱脯氨酸异构化的负面影响在折叠。
此外,活细胞配备专门的催化剂,prolyl异构酶(PPiases),这加速了异构化过程。很明显,PPiases低温中最嗜冷细菌蛋白质组的分析到目前为止,有时在非常高的水平。这涉及到细胞质PPiases从还有家庭71年,72年,80年,83年),一个parvulin-type PPiase [84年],FKBP-type PPiases [71年,109年]。此外,上述包含PPiase域和触发因素是在几个它们。这样反复观察表明,蛋白质折叠是它们的病原反应步骤,导致细胞反应,旨在促进和加速事件最慢收购生物活性构象的蛋白质。
2.4。折叠率
后核糖体合成的蛋白质折叠的速率是直观地将低温慢了下来。蛋白质在高温的情况下,它已被证明,他们的折叠不嗜中温蛋白质折叠速率的不同,而嗜热蛋白展开很慢所以揭示动力来源的稳定性(111年- - - - - -113年]。这样的比较分析目前缺乏好寒性的蛋白质。然而,折叠和展开速率常数已经记录好寒性的α淀粉酶和稳定的突变体114年]。发现尽管稳定之间存在较大的差异,这些蛋白质的折叠速度是相似的,而展开率与稳定性。这样看来,这个冷酶的折叠速率并不改变。有一个明显的需要更深的低温生物物理研究蛋白质折叠。
3所示。好寒性的酶
前面的部分已经突出显示当前低温蛋白质折叠问题。接下来的章节将主要集中在酶作用在它们占据着核心作用在寒冷的生物有机体的适应。
3.1。Cold-Active酶的三维结构
嗜冷酶的晶体结构是最重要的调查这些cold-active催化剂的性能。表1概述了代表晶体结构。到目前为止,只有一个作业NMR结构测定报告已经发表的thiol-disulfide从南极细菌氧化还原酶(115年]。表1说明可用结构覆盖细胞代谢,膜蛋白的许多途径,例如,仍然缺乏。值得一提的是,所有这些结构紧密同源嗜中温同行:cold-active酶只相差离散变化,负责他们的特定属性。
3.2。低温的挑战
嗜热酶所面临的挑战是容易理解的:在高温下保持稳定和活跃。相比之下,好寒性的酶所面临的挑战更为微妙。低温强减少几乎所有的酶催化反应的速度,此外,减缓与蛋白质功能相关的分子运动。活动而言,催化常数对应底物分子转化为产品的最大数量每单位时间的活性部位和催化速率常数的温度依赖性的关系 在这个方程,是一般透射系数接近于1,Bolzmann常数(J K−1),普朗克常数(J s),理想气体常数(8.31 J K−1摩尔−1),的自由能激活或激活es之间的吉布斯能量的变化复杂和基态ES。因此,活动不断指数依赖于温度。作为一个经验法则,由嗜中温酶催化生化反应(从细菌或温血动物),温度从37°C下降为0°C的结果在一个低20到80倍的活动。这是预防的主要因素在低温下不适应生物的生长。
温度对低温性的活动的影响以及嗜中温酶如图4。方程(1)只适用于活动指数上升的温度曲线的左侧肢体。提出了模型来模拟heat-inactivation对活动的影响(152年- - - - - -154年),考虑到介质的粘度(108年]。这个数字显示至少冷适应的两个基本特征。(我)为了弥补在低温下反应速率缓慢,它们合成的酶有特定的活动在这个温度范围要高十倍。这是事实上的主要生理适应冷酶水平;(2)cold-active酶的温度明显最大活动转向低温,反映这些蛋白质的弱稳定性及其演变,在温和的温度失活。编译155好寒性的特征酶报道(155年),可以咨询(http://www2.ulg.ac.be/biochlab/publications_022.htm)。
(一)
(b)
(c)
(d)
许多观察类似如图4建议酶的活动之间的关系,蛋白质的灵活性,它的稳定性。事实上,高活动在低温下似乎源自增加蛋白质结构的灵活性,尤其是在温度强烈分子运动减慢,但这种改善流动性的蛋白质结构的结果当然是疲软的稳定。这些权衡是在下一节中开发的。
4所示。适应的活动
4.1。Heat-Labile和不稳定的酶
大多数嗜冷酶至少分享一个属性:heat-labile活动,无论蛋白质的结构稳定性。此外,活性部位似乎最heat-labile这些蛋白质的结构元素(158年- - - - - -161年]。图5说明了这个重要的活性部位的稳定性和结构的稳定性。较低的面板显示了结构的稳定性所记录的荧光。正如所料,cold-active酶的结构比嗜中温、高温不稳定。上面板,活动记录在相同的实验条件下,可以看出嗜中温嗜热酶启动heat-inactivation当蛋白质开始展开。相比之下,cold-active酶失去活性蛋白质的展开。这意味着heat-labile活性部位甚至超过整个蛋白质结构。所有这些方面指出一个非常不稳定且灵活的活性位点,说明冷适应的核心概念:局部增加灵活性的活性部位负责高但heat-labile活动[162年),而其他地区的酶可能会或可能不会以低稳定当没有参与催化163年]。例如,好寒性的碳酸酐酶(164年)和异柠檬酸脱氢酶(133年)是高度稳定的酶,然而,改善地区驾驶催化的灵活性。在多畴的嗜冷酶含有催化和非催化领域,催化领域永远是热不稳定,而非催化域可以像嗜中温稳定蛋白质(165年- - - - - -167年]。
4.2。活跃的网站架构
与晶体结构的可用性,嗜冷酶的催化中心cold-active认真审查。第一个基本的观察是,所有参与催化机理的侧链是严格守恒的。这方面并不令人感到意外,因为作为酶的具体反应机理是不容易发生剧烈的变化。此外,第一个x射线结构比较好寒性的酶,cold-activeα淀粉酶(116年,117年),和最亲密的嗜中温结构同系物在复杂的抑制剂模拟过渡态的中间(168年,169年),显示,所有24残留形成催化裂cold-active严格守恒的α淀粉酶(图6)。这突出的活性部位的例子表明身份的具体属性好寒性的酶可以达到没有任何反应中心的氨基酸替换。因此,变化发生在分子负责催化参数的优化和改进的动态活性位点残基。
然而,重大的结构调整好寒性的酶的活性部位经常被报道。在许多情况下,一个更大的催化裂是观察到的142年),是通过各种方式,包括替代笨重的侧链的小群体,不同构象的循环与活性部位,或小删除这些循环,一个cold-active柠檬酸合成酶(124年]。在的情况下,蛋白酶从好寒性的假单胞菌物种,一个额外的约束离子把骨干形成明显的入口网站,增加其可访问性与嗜中温同系物(相比122年]。由于这样的一个更好的可访问性,cold-active酶可以容纳基质在降低能源成本,随着构象的变化而言,因此减少所需的活化能es复杂的形成(170年]。更大的活性部位也可能有助于更容易释放和出口的产品,从而可能缓解病原反应一步反应速率的影响(134年,171年]。
此外,静电势的差异在嗜冷酶的活性部位为活动似乎是一个至关重要的参数在低温下。表面静电势产生的指控和极地团体催化机理的一个重要组成部分在不同的阶段:潜在的扩展到中等,可以面向衬底,吸引了酶与底物接触之前发生。有趣的是,cold-active柠檬酸合成酶(124年)、苹果酸脱氢酶(131年),uracil-DNA糖基化酶(151年,172年,173年),弹性蛋白酶(174年),和胰蛋白酶175年- - - - - -177年)具有显著差异在活性部位附近的静电势地区嗜常温或高温同行相比,这可能促进与配体的相互作用。在苹果酸酶的情况下,例如,增加积极的潜力在和周围的草酰乙酸结合位点而大大降低了负表面电位NADH绑定地区可能促进电荷相反的交互与酶的表面配体(131年]。在所有情况下,这些差异是由于离散替换nonconserved带电残留导致当地静电势不同符号和大小。静电势参与cold-activity也支持突变研究[178年]。
最后,一些未知的策略已经被证明在嗜冷酶改善活动。除了少数例外,β-galactosidases homotetrameric酶轴承四个活跃的网站。然而,cold-active的晶体结构β牛乳糖透露,homohexamer,因此拥有六个活跃的网站(125年]。这种不同寻常的四级结构,包含两个额外的活跃的网站,当然有助于改善活动在低温下。多种纤维素酶是微生物酶显示一个模块化的组织由球状的催化域由链接器纤维素绑定域连接。好寒性的多种纤维素酶被发现拥有不同寻常的长链接器的超过100个氨基酸残基,也就是说,大约五倍的时间比嗜中温多种纤维素酶(119年,179年]。结果表明:长链接器采用大量的构象之间的完全扩展和弯曲的构象,在caterpillar-like运动119年),计算出催化域已高出40倍访问表面积嗜中温纤维素酶的底物相比拥有更短的链接器。这里还有,增加可用的不溶性基质的表面催化域应该改善这种酶在低温下的活动。
4.3。活性部位动力学
heat-labile嗜冷酶的活性表明功能性侧链的动态活性部位是为了改善导致冷活动和上述结构适应性似乎支持更好的可访问性的衬底和发布产品。这种观点是强烈支持的enzymological cold-active酶的性质。非特异性好寒性的接受各种底物和酶比嗜中温同系物有更广泛的特异性,因为基板稍微不同的构象或大小可以绑定到该网站。例如,观察不同的底物特异性大西洋鲑鱼和哺乳动物之间的弹性蛋白酶被解释为是基于一种绑定口袋低温弹性蛋白酶(更广泛和深入176年]。的特异性好寒性的乙醇脱氢酶氧化大笨重的醇也分配给一个高度灵活的活性部位(180年]。这种活跃的网站动态解决方案也证明了好寒性的α淀粉酶(181年]。更灵活,活跃的站点可以轻松容纳大分子多糖和活跃在这些基质嗜中温同系物。相比之下,灵活的活性部位提供少高效短的寡糖,是活跃在这些基质。此外,低温性的抑制模式α淀粉酶表明它可以形成一个三元复杂(酶、底物和抑制剂),而更多的刚性嗜中温同系物只能形成二元复合物(酶和底物或抑制剂)。一些嗜冷酶的晶体结构也指向一个提高灵活性达到或接近活性部位,也支持分子动态模拟。
4.4。自适应漂移和自适应优化底物的亲和力
由于改进的活性部位在cold-active酶动力学,基质结合少牢牢绑定网站(如果没有发生点突变)导致更高值。表中给出了一个例子2显示一个好寒性的α淀粉酶是大分子基质更活跃,而值高达30倍大;也就是说,底物的亲和力低30倍。理想情况下,一个功能性适应寒冷意味着优化和。然而,嗜冷酶上的可用数据的调查表明,优化的比远非一般但相反,大多数cold-active酶改善价值为代价的因此导致的次优值比,也表所示2。例如,高值已报告好寒性的天冬氨酸carbamoyltransferase [182年,183年),磷酸丙糖异构酶(137年),枯草杆菌蛋白酶184年),乳酸脱氢酶(147年,162年),DNA连接酶(185年),延长因子图(186年),谷氨酸脱氢酶(187年,188年),α淀粉酶(189年),二氢叶酸还原酶(190年,191年),纤维素酶(179年],核酸内切酶(192年)、天冬氨酸转氨酶(193年),异柠檬酸脱氢酶(194年),木聚糖酶(195年),鸟氨酸carbamoyltransferase [196年),柠檬酸合成酶(197年),嘌呤核苷磷酸化酶(198年),出局区蛋白(99年),醋酸激酶(199年]。事实上有一个进化的压力为了最大限度地提高整体反应速率。这类自适应的漂移已经很好的说明了乳酸脱氢酶从南极鱼162年),好寒性的α淀粉酶(189年]。
几种酶,特别是在一些冷鱼,这个自适应抵消漂移为了维持或提高底物亲和力在活性部位的氨基酸替换(176年,200年]。第一原因这些酶反应对漂移是明显的在考虑相关的监管功能,尤其是对细胞内的酶。第二个原因是弱相互作用对温度的依赖关系。衬底绑定是一个特别热敏一步因为绑定几何和结合位点和配体之间的相互作用由弱相互作用有时相反的温度依赖性。疏水相互作用形成endothermically温度降低而降低。相比之下,静电性质的相互作用(离子对、氢界限和范德瓦耳斯相互作用)形成exothermically和稳定在较低的温度。因此,低温不仅降低酶活性(),但是也可以严重改变衬底绑定模式根据类型的互动参与。全面提供的例子是cold-active chitobiase:替换的底物结合位点往往取代疏水残基(发现嗜中温chitobiases)极地残留物能够执行低温强相互作用(165年]。
4.5。冷活动的能量
指的是(1),高的低温酶活动对应于一个活化自由能的减少。两种策略一直强调降低能量势垒的高度。图7说明了第一个策略进化的压力增加为了使反应速率最大化。根据过渡态理论,当其底物酶接触,ES复杂ES分为能源坑。反应进行的激活状态必须达到,最终分解成酶和产品。能量势垒的高度和基态ES之间的过渡状态被定义为活化自由能:较低这一障碍,活动越高反映在(1)。在寒冷的情况下主动酶显示疲软的底物的亲和力,ES复杂的能源坑不太深(虚线图7)。由此可见,能量势垒降低的幅度,因此活动增加。这个热力学亲和力和活动之间的联系是有效对于大多数酶(extremophilic与否)饱和基质浓度和这个链接似乎参与改善活动在许多cold-active酶在低温下(162年,196年,201年]。
第二和更一般的策略包括由cold-active酶催化的反应对温度的依赖关系。激活的自由能包含向左反应和熵的计算根据古典Gibbs-Helmholtz关系: 因此,(1)可以写成 方程(3)表明,和有可能改变吗。表3报告向左反应的自由能和熵的贡献在extremophilic激活α-amylases。类似的数据已经被编译为其他嗜冷酶(147年,158年,159年,163年,179年,192年,203年,204年]。激活的焓描述了温度依赖的活动:这个值越低,降低活动的变化与温度。低价值发现几乎所有嗜冷酶减少表明他们的反应率低于其他酶当温度降低。因此,减少活化焓的嗜冷酶的酶促反应可以被认为是低温的主要适应字符(162年,201年]。这减少结构通过减少enthalpy-driven交互的数量在激活步骤必须被打破。这些交互也有助于蛋白质折叠构象的稳定性,作为推论,酶的结构域的活性部位应该更灵活。有趣的是,这种宏观的解释低活化焓cold-active酶的实验观测符合明显heat-labile活动如图5。表3表明,熵的贡献cold-active酶是大的和消极的。这被视为是一种大型的减少之间的明显障碍相对宽松的基态构象和组织良好的和紧凑的过渡态(163年]。heat-labile cold-active酶的活性表明一个宏观解释热力学参数。由于活性部位的灵活性,ES复杂ES占据了一个广泛分布的构象州翻译成这种状态熵增加,比嗜常温或高温同系物。这个假设得到了强有力的实验支持(160年,205年]。此外,更广泛分布的基态ES应该伴随着基体粘结强度较弱,作为众多嗜冷酶实际上观察到的。最后,它应该提到的典型激活参数好寒性的,能够很好地复制酶反应动力学模拟(170年]。
5。全球和局部动态
前面的部分已经强调了经常性的参与cold-activity嗜冷酶的动力学或灵活性。测定分子的灵活性是复杂的,因为它需要的定义类型和原子运动的振幅作为这些动作的时间尺度206年- - - - - -208年]。然而,各种生物物理的研究揭示了一个不太紧凑嗜冷酶的构象,经历频繁microunfolding事件。
在这方面,第一个实验性的方法显然Privalov的开创性工作209年]报告一个广泛分析胶原蛋白结构与生物适应不同温度(包括南极和北极鱼)和使用/氢氘交换动力学量化的灵活性。作者得出的结论是,生理温度和胶原蛋白稳定性之间的关系可以用一个明确的解释水平所需的蛋白质结构运动性生理温度下高效运作。这表明,调整构象的灵活性是蛋白质的热适应的关键事件(210年- - - - - -212年]。这种差异在量化的灵活性得到了进一步支持大分子动力学在整个好寒性的蛋白质含量,嗜中温、高温,hyperthermophilic细菌由中子散射(213年]。中子能谱法提供了一个独特的工具来研究热原子运动在大分子因为中子波长和能量匹配运动振幅和频率,分别为(213年,214年]。这些实验确实表明弹性(相当于大分子刚性的力常数)随生理温度。此外,它也表明,原子波动振幅(相当于大分子灵活性)为每一个微生物的生理温度相似。这是在完全赞同Somero的“对应态”的概念215年]假定蛋白同系物表现出类似的灵活性来执行他们的生物功能的生理相关的温度。extremophilic蛋白质的荧光猝灭也作为此方法平均的动态参数到一个信号。这种技术利用浓度增加一个小弄熄的分子(丙烯酰胺图8)。的减少扩散和冷却器之间的冲突引起的荧光蛋白荧光团冷却器穿透的能力反映了蛋白质的结构和可以被视为一个索引渗透率。发现好寒性的蛋白质的结构有一种改进的渗透的倾向小弄熄的分子,而嗜热蛋白只显示适度的淬火效果。因此,好寒性的蛋白质是一个灵活的分子显示大量的打开和关闭动作或频繁microunfolding事件158年- - - - - -160年,216年]。
当地的灵活性,而不是全球的灵活性,将发挥关键作用酶冷活动(162年,163年]。这种当地的灵活性是首先提出了的3 d结构cold-active胰蛋白酶(148年),后来观察到稳定嗜冷酶的研究表明,在某些情况下,结构域的活性部位比其余的更不稳定的蛋白质(161年,165年- - - - - -167年,217年]。这是进一步证明/氢氘交换的研究好寒性的乙醇脱氢酶(218年]。结果表明,功能区域参与底物和代数余子式绑定相比表现出更大的灵活性高温同系物,此外,当地的灵活性可以从全球解耦合的热稳定性。这种当地的灵活性也与活动相关的参数(164年,219年- - - - - -222年]。嗜冷酶的几种x射线结构也指出,当地的灵活性或参照活性部位以及功能区域(120年,124年,130年,133年,139年,145年,147年]。此外,分子动力学模拟经常强调当地灵活性作为冷适应的策略(174年,222年- - - - - -232年]。
全球或当地的灵活性的要求仍在争论。酶显示全球灵活性经常处理大型基质,可能涉及到整个分子的协同动作,而当地的灵活性通常观察到酶作用于小基板(57]。然而,太多的结论明确异常。
6。嗜冷酶的构象稳定
之间的亲密关系活动的许多见解与稳定嗜冷酶促使调查他们的构象稳定性与嗜常温和高温同行相比。已知的低温蛋白质热稳定性低,几十年来,一直在强调内在荧光光谱(图等各种技术5)。然而,结构稳定的能量基本上是揭示了微量热法(158年- - - - - -160年,189年,203年,216年,233年,234年]。
6.1。微量热的研究
微量热燥热引起的记录好寒性的演变,嗜中温和嗜热蛋白在图所示9。这些酶明显显示出明显的稳定模式演变从一个简单的概要文件的不稳定好寒性的蛋白质更复杂的配置文件在非常稳定的高温。的演变低温酶在低温下发生的half-denaturation的温度,由顶部的过渡。的量热焓(曲线下的面积图9)对应的总热量吸收在演变反映了中断的焓的债券参与维护结构紧凑和嗜冷酶明显降低(表4)。此外,有一个明确的趋势增加低温微生物的顺序值<嗜温性的<喜温的。嗜冷酶的过渡是夏普和对称的,而其他酶是压扁的温谱图的特征。这表明在嗜冷酶的演变:明显的协同结构是由更少的弱相互作用和破坏稳定的一些这些交互强烈影响整个分子大厦和促进其展开。根据嗜冷酶展开一个动静极限的过程,揭示一个统一架构的稳定性较低。相比之下,其他所有同源酶显示两到三转换(反褶积热容的函数图9)。因此,这些嗜中温和嗜热酶的构象包含结构块或单位不同的稳定,独立展开。最后,好寒性的蛋白质的演变是经常比其他酶同源的可逆加热后不可逆转地展开。核心集群的弱疏水性低温酶和展开的低温,防止聚合,当然占这个可逆的角色。
(一)
(b)
6.2。稳定的曲线
一种蛋白质,这种蛋白质的热力学稳定性展开可逆根据两国古典Gibbs-Helmholtz关系所描述的机制是:
后者可以改写任何温度的关系使用参数决定由DSC实验: 在哪里是热容和本机之间的差异展开状态。这个参数反映了水化暴露于水的非极性团体展开。计算(5)在一个温度范围本机状态盛行提供了蛋白质稳定性曲线(235年),也就是说,展开的自由能作为温度的函数(图10)。换句话说,这是破坏原生状态所需的工作在任何给定的温度(236年),也称为热力学稳定性。根据定义,这种稳定是零(平衡常数和)。在温度低于,稳定性增加,正如所料,但也许令人惊讶的是对于非专业人士来说,稳定达到最大值接近室温降低在较低温度(图10)。事实上,这个函数预测一个冷的温度,一般不观察,因为它发生在0°C (237年]。增加蛋白质的稳定性基本上是通过提升曲线走向更高的自由能值(238年),而低稳定性好寒性的蛋白质是达成的全球崩溃的曲线。极端微生物而言,最令人费解的过去十年的观察,大多数蛋白质服从这种模式;任何微生物来源,最大稳定的蛋白质聚集在室温(238年- - - - - -240年),虽然异常报告(241年]。因此,环境温度对嗜温菌和嗜热微生物躺在肢体的钟形曲线稳定,显然,热耗散力是用来促进这些分子的分子运动。相比之下,它们躺在左侧肢体的环境温度曲线的稳定。由此推断,在蛋白质分子运动在低温下获得的因素最终导致冷展开[233年),也就是说,极性和非极性的水合作用[242年]。嗜冷酶在低温下的灵活性的起源从嗜中温和嗜热蛋白因此截然不同,后者利用构象熵随温度上升到获得流动性。
一个惊人的结果,自由能函数如图好寒性的蛋白质10在低温下其脆弱的稳定与嗜中温和嗜热蛋白相比,而这是直觉地认为cold-active蛋白质也应该冷稳定。这种蛋白质实际上是冷和热不稳定。因此冷一些关键酶的变性可以额外的它们,虽然未知的因素解决在低温下生命的下限。
6.3。结构稳定性低的起源
大部分的x射线晶体结构从嗜冷酶表中列出1分析了为了破译结构冷活动的起源和弱稳定。然而,这些数据的解释通常是困难的,因为这些结构性适应性非常离散,很容易逃避分析,例证,如图11。例如,它已经表明,不同酶与底物相互作用的距离(即0.1。,远低于大多数晶体结构)的决议会导致大量不同催化效率(243年]。此外,这些结构性适应性非常不同,反映出的复杂性因素参与高分子在原子水平的稳定。作为一般的照片,发现所有结构性因素目前已知稳定蛋白质分子可以在强度和数量减毒在cold-active酶的结构176年,244年- - - - - -247年]。两个评论文章可以咨询全面讨论这个话题的108年,176年]。
蛋白质稳定性的决定因素包括结构性因素,疏水效果,主要是弱原子之间的相互作用的蛋白质结构。在好寒性的蛋白质,这涉及到甘氨酸残基的聚类,提供当地流动(248年,249年];脯氨酸残基的消失在循环,提高链的灵活性之间的二级结构(250年];精氨酸残基的减少能够形成多个盐桥和H-bonds [251年)以及较低的离子对,芳香交互,或H-bonds,而嗜中温酶(148年,252年]。非极性的大小和相对疏水性残集群形成蛋白质核心通常是小,降低蛋白质内部的密实度削弱折叠(疏水性影响253年]。好寒性的蛋白质有较大的空腔大小足以容纳水分子:这些蛀牙和嵌入式水分子可以发挥重要作用在结构的灵活性254年]。的和C帽子的α螺旋也改变,削弱charge-dipole互动(255年]和松散或放松的蛋白质似乎四肢优惠网站解(148年,256年]。绑定的稳定离子,如钙,可以非常疲弱,绑定常量不同于嗜温菌由几个数量级(157年,257年]。插入和删除有时负责特定属性,如收购extrasurface指控通过插入(157年)通过删除或亚基相互作用的减弱(255年]。偶尔,二硫化联系缺乏御寒蛋白质(234年,257年,258年]。
溶剂可访问区域的计算表明,一些嗜冷酶暴露更高比例的非极性残基周围介质(116年,124年,158年]。这是一个熵驱动不稳定因素造成的周围水分子的重组暴露疏水侧链。静电势的计算显示在某些情况下过量的蛋白质和表面负电荷,的确,πcold-active酶通常比他们的嗜中温酸性或高温同系物。这是有关改善与溶剂的相互作用,这可能是最重要的收购的灵活性接近0度(233年]。除了费用的平衡,盐桥覆盖表面的蛋白质的数量也减少了。之间存在明显关联表面离子对和温度适应,因为这些静电相互作用显著增加的数量从它们到嗜温菌,嗜热微生物,和超嗜热菌,后者显示arginine-mediated多种离子对和相互关联的盐桥网络(259年,260年]。这样的静电相互作用模式的改变被认为提高动力学或外部的“呼吸”cold-active酶的外壳。
然而,每个酶采用自己的策略通过使用一个或两者结合改变结构性因素以提高蛋白质的本地或全球流动性的大厦。因此,结构的一般理论适应不能制定然而,酶家庭共享3 d褶皱可以相比了(231年]。比较好寒性的结构分析,嗜中温,嗜热酶表明每个蛋白质家族显示不同的结构策略适应温度(135年,231年,245年,261年- - - - - -266年]。然而,一些共同的趋势是观察:离子对的数量,暴露面侧链的贡献,无极的一部分埋表面显示一致的降低与减少最优温度(245年]。大量的蛋白质结构策略的御寒还复杂的统计分析,旨在描述温度适应性的一般趋势。各种趋势已报告好寒性的蛋白质使用不同的方法和数据集:偏好小包装和疏水残基(267年];疏水核心,更少的指控,长的链状表面残留物(268年];减少溶剂可及表面带电残基的贡献和增加疏水表面贡献(37)或各种优惠氨基酸替换模式(269年- - - - - -271年]。由于结构性因素参与冷适应的多样性,意味着整个基因组的氨基酸组成不优惠渣利用率提供了清晰的趋势(37- - - - - -40]。
7所示。Activity-Flexibility-Stability关系:当前的问题
7.1。实验的见解
为了检查的有效性提出cold-active酶的活性和稳定性之间的关系,好寒性的α淀粉酶已被用作模型,因为相同的体系结构的活性部位,与亲密嗜中温同系物相比(图6),表明结构适应性影响活性部位属性发生催化腔外。17突变体在此基础上,建立了这种酶,它们中的每一个轴承一个工程残渣形成弱相互作用中发现嗜中温αcold-active -amylases但缺席α淀粉酶以及六稳定结构性因素的组合(114年,189年,234年,273年]。结果表明,这些工程相互作用提高所有调查参数相关蛋白质稳定性:密实度,活动驱动的稳定性、热力学稳定性、电阻对化学变性,展开/折叠动力学。因此,这些突变体的好寒性的α淀粉酶一致逼近和繁殖的热稳定酶的稳定性和演变模式。这些影响也分析了分子动力学(274年]。与此同时这个改进的稳定,稳定的突变体已经失去了动力优化低温活动显示的父母好寒性的酶。如图12,稳定cold-activeα淀粉酶会减少值,与此同时值的突变酶,揭示高两个动力学参数之间的相关性。事实上,除了一个工程mesophilic-like稳定,multiple-mutant轴承六稳定结构性因素也将显示一个工程mesophilic-like活动的改变和甚至在热力学参数值激活(114年,273年]。这些结果提供强有力的实验支持假说假设稳定互动的消失在嗜冷酶协同运动的振幅增加所需的催化和低温活性位点残基的动力,导致更高的活动。
应该提到其他突变的研究cold-active酶不确凿。各种好寒性的酶(178年,184年,248年- - - - - -250年,275年- - - - - -282年)被设计为了检查特定的适应性变异的参与在或接近活性部位。这些研究揭示了一个复杂的模式对动力学参数的影响,活化能和稳定性,不能用简单的语言解释。
7.2。定向进化
活性稳定性关系的御寒的蛋白质从进化的观点受到质疑。事实上,定向进化283年,284年和蛋白质工程285年)的酶已经证明,活性和稳定性不是身体有关的蛋白质,作为综述(286年]。因此,它提出了低cold-active酶稳定性相关遗传漂变的结果缺乏选择性压力稳定的蛋白质。虽然这似乎是显而易见的,一些证据表明,情况更加微妙。正如前面提到的,在多畴的嗜冷酶,催化领域永远是热不稳定,而非催化域可以像嗜中温稳定蛋白质165年- - - - - -167年]。因此不太可能一个遗传漂变只会影响蛋白质的催化域无需修改其他地区。此外,几个定向进化实验表明,当库随机突变酶的筛选改善活动在低温下,没有任何其他限制,最好的候选人总是显示规范化嗜冷酶的性质,讨论(287年]。检查活动和稳定地块的数以百计的突变体显示随机突变改善活动和稳定性都是罕见的(288年,289年]。它遵循相关改善活动在低温下失去稳定性似乎是最常见的和可访问的事件。总之,当前视图显示强劲的进化压力好寒性的酶在低温下可以增加他们的活动缺乏选择适应的稳定和代表最简单的酶催化在寒冷的适应策略。
7.3。明显的异常
考虑上述实验室发展的经验教训,一个人应该期望好寒性的酶,不分享规范化属性,可以发现。事实上,一些报告显示明显的一般规则的例外情况的发生。例如,单点突变可以占大多数的适应性特征。一个突变的钙结合网站好寒性的枯草杆菌蛋白酶(184年phosphate-binding螺旋的)和磷酸丙糖异构酶(137年好寒性的突变体的热稳定性增加而显著增加。相反,一个氨基酸替换活性部位附近的耐热性的α葡糖苷酶提供冷活动(290年]。chaperonin和热休克蛋白GroEL从南极细菌不是冷适应并显示类似的稳定性和比它的活动大肠杆菌同系物(291年]。有人建议这个chaperonin仍然适合函数在突然温度增加的环境83年]。同样,从相同的硫氧还蛋白的活性细菌的热稳定得多大肠杆菌(292年,293年]。不能排除酶参与电子转移不需要相同类型的适应性,因为电子的速度流不影响生物温度低。异柠檬酸脱氢酶的嗜冷细菌比嗜中温同族体更稳定,而寒冷的活动是由于当地的灵活性在活性部位(133年]。
8。嗜冷酶折叠漏斗模型
嗜冷酶的各种属性已经集成在一个模型基于折叠漏斗(294年,295年在extremophilic酶[]来描述活性稳定性关系160年]。好寒性的和嗜热酶的能源景观图所示13。烟囱的顶部是展现国家所占领的高自由能(考虑到自发折叠反应),而漏斗的底部是当地的稳定(低自由能)占有的状态。烟囱的高度,折叠的自由能,也对应于构象稳定性,被固定在一个(图1 - 5的比例10)。的上边缘漏斗是展现国家所占领的无规卷曲构象,但应该注意的是,嗜冷酶往往比嗜中温脯氨酸含量低和嗜热酶较低数量的二硫键和更高的甘氨酸发生集群。因此,好寒性的蛋白质的漏斗边缘略大(广泛分布的展开状态),坐落在一个更高的能量水平。允许多肽折叠时,自由能量水平降低以及构象。然而,嗜热蛋白通过中间状态对应于局部最小值的能量。这些最小值负责漏斗斜坡的强度和降低folding-unfolding的协同反应,证明了燥热引起展开(图9)。相比之下,好寒性的蛋白质的结构元素通常展开合作没有中间体,由于更少的稳定的相互作用和稳定域;因此,漏斗斜坡陡峭,光滑。漏斗的底部描绘了稳定的原生状态。底部很稳定、刚性嗜热蛋白可以描述为一个全球最低或只有几个最小值高的能源之间的壁垒,而底部的不稳定和灵活好寒性的蛋白质是崎岖的,描绘了一个人口众多的矫形器低能翻转它们之间的障碍。刚性的原生状态因此直接能量势垒高度的函数(296年,297年),根据全球画灵活性的低温蛋白质。在这种情况下,这些extremophilic酶的活性稳定性的关系取决于底层属性。事实上,它被认为在衬底绑定association-competent族群,所有矫形器转向这个族群之间的平衡,导致活性构象合奏(296年- - - - - -299年]。在崎岖的嗜冷酶,这种平衡转移只需要适度的自由能变化(低能量壁垒),低焓变化构象的互变现象,但伴随着大的熵变宽的构象异构体之间的波动。反过来图适用于嗜热酶,同意激活参数见表3和提出宏观的解释。这种能源景观整合目前几乎所有的生物化学和生物物理数据extremophilic酶,但他们肯定会完善的其他系列的未来调查它们的同源蛋白质,嗜温菌和嗜热微生物。这个模型还是得到一些实验和计算研究的支持(170年,205年,207年,252年,299年- - - - - -302年]。
9。嗜冷酶生物技术
如前所述,大多数酶从活动它们冷和热不稳定。这些特定的特征负责冷活跃的酶生物技术的三个主要优点:(i)由于其高活动,较低浓度的酶催化剂需要达到一个给定的活动,因此减少昂贵的酶制剂的过程;(2)由于其冷活动,他们仍然有效的自来水或环境温度,因此避免加热过程中,无论是在国内(例如,洗衣机)或工业水平;和(iii)的热不稳定性,它们可以有效地和选择性的灭活后的某个时候过程温和的热输入。旁边的这些特征,酶生物特有的冷环境可以新催化剂拥有有用的有价值的来源enzymological小说底物特异性等特点或产品属性。先前的评论应该为一个完整的咨询这个话题的报道(16,28,303年- - - - - -308年]。在线数据库(Bioprospectorhttp://www.bioprospector.org/bioprospector/)提供了一种专利的调查中,商业产品,公司参与应用研究使用遗传资源从南极和北极。下面提供一些具体的例子。
9.1。在分子生物学热不稳定性
碱性磷酸酶主要用于分子生物学的脱磷酸作用DNA载体克隆之前防止recircularization或脱磷酸作用的5′5′端前核酸末端标记的多核苷酸激酶。然而,磷酸酶去磷酸化后必须小心地删除,以避免干扰后续步骤。此前,heat-labile碱性磷酸酶是很好的选择,因为他们是灭活通过温和的热处理允许执行后续步骤在同一个试管和核酸的损失最小化309年]。一个碱性磷酸酶的南极细菌已经完全特征(128年,310年,311年]。这heat-labile碱性磷酸酶,作为南极磷酸酶出售,现在市场上提出的新英格兰生物学实验室Inc .(美国马伊普斯维奇)。在相同的上下文中,heat-labile碱性磷酸酶从北极虾Pandalus北欧化工也可以从研究例如药ASA (Tromsø、挪威)或通用电气医疗集团生命科学(小都,英国)。
另外两个好寒性的酶也销售为分子生物学应用程序利用heat-labile财产。虾核酸酶选择性地降解双链DNA:例如,它用于遗留污染物的去除PCR混合物,然后它是热灭活前添加模板。该重组酶可以从研究药物ASA (Tromsø、挪威),USB公司(美国圣克拉拉的CA),或者热科学(美国沃尔瑟姆,MA)。Heat-labile uracil-DNAN糖基化酶从大西洋鳕鱼(Gadus morhua),呈现典型的冷适应特性(151年),还用于去除DNA序列PCR反应中污染物。污染物的降解后,酶是完全和不可逆转地灭活后热处理。Heat-labile uracil-DNAN糖基化酶可以从研究药物ASA (Tromsø、挪威)。
9.2。低温活动
酶用于洗涤剂市场占全球-40%的酶生产的30%。在这些酶清洗剂、枯草杆菌蛋白酶(一种碱性丝氨酸蛋白酶主要由芽孢杆菌物种)在很大程度上主宰着这个市场。在国内层面上,目前的趋势是,然而,使用洗涤剂洗在较低的温度,因为相关的减少能源消耗和成本,以及保护面料的质地和颜色。因此,cold-active枯草杆菌蛋白酶所需最优清洗结果自来水温度和当前广告cold-active洗涤剂表明这个目标已经达到。第一个好寒性的枯草杆菌蛋白酶从南极孤立芽孢杆菌物种都进行了广泛的特点符合这样的要求(157年,184年]。枯草杆菌蛋白酶目前纳入cold-active洗涤剂工程酶结合贮存稳定性,碱性稳定,活动活动和冷。虽然好寒性的枯草杆菌蛋白酶不组件本身cold-active洗涤剂,它们在很大程度上导致了经济的进步有吸引力的概念。
苷酶、乳糖酶是一个糖苷水解酶水解乳糖的乳糖为半乳糖和葡萄糖。应该强调,世界上75%的人口患有乳糖不耐症因缺乏成人肠道乳糖酶的合成,导致消化系统紊乱。在这种背景下,一个cold-active乳糖酶从南极细菌已经获得专利(我们01/04276A1)水解乳糖的能力在牛奶储存在低温下(204年]。这cold-active乳糖酶也将很快大量由Nutrilab NV (Bekkevoort、比利时)水解乳糖(如乳制品行业的副产品)的过程中,高价值的甜味剂D-tagatose,自然的单糖和低热值和血糖指数。
蛋白质陪伴帮助新生多肽折叠,阻止错误折叠,甚至修复错误折叠。利用这些属性,ArcticExpress大肠杆菌细胞Stratagene(美国)已经设计coexpress cold-active chaperonins从南极细菌(102年)与感兴趣的重组蛋白,因此改善蛋白质处理在低温下(阻止包涵体的形成)和活跃的产量增加,可溶性重组蛋白质。
9.3。新的特异性好寒性的酶
在工业水平,酵母南极假丝酵母产生两个脂酶,A和B,后者例如Novozym 435通过出售诺维信(Bagsvaerd、丹麦)。由于其底物和定向性,脂肪酶B是参与大量的organosynthesis应用程序相关的食品/饲料加工、制药、或化妆品312年]。在南极洲调查相关的专利(313年),结果表明,脂酶c .南极洲到目前为止主导过程,或基于产品专利的数量。这是一个显著的例子,从遗传资源潜在的新型催化剂在寒冷的环境。
木聚糖酶是糖苷水解酶降解多糖beta 1, 4-xylan,因此分解半纤维素,植物细胞壁的主要成分之一。木聚糖酶是一个关键成分的工业面团调节剂用于提高面包质量。发现南极的木聚糖酶细菌属于一个新类的木聚糖酶118年,159年,171年,195年,314年]。此外,发酵试验表明,好寒性的木聚糖酶是非常有效的改善面包面团特性和最终质量,例如,一个积极影响面包体积,如图14(315年,316年]。效率似乎是相关的高活动好寒性的木聚糖酶在低温面团所需休息和特定模式的木聚糖水解。这个木聚糖酶现在出售的Puratos (Grand-Bigard、比利时)。这显然是嗜冷酶生产的最高金额。
9.4。其他好寒性的蛋白质在生物技术
在这种背景下,一些御寒的蛋白质也值得一提。这包括重组抗冻蛋白从北极鱼添加一些食用冰淇淋品牌从联合利华(荷兰、英格兰)ice-structuring属性;细菌防冻剂Antarticine-NF3(有时Antarctilyne名义),这是有效的伤口,疤痕治疗和reepithelialization或南极海藻提取物Durvillea南极洲,这些都包含在化妆品等改善肌肤活力的额外的紧肤日霜,卖得最好的娇韵诗(法国)。寒冷的活动提高了化学改性嗜中温酶也被报道的317年- - - - - -319年),在一些特定的情况下成功。
10。结论
它们有着蓬勃发展的永久维持在接近于零的温度下合成cold-active酶细胞周期。大多数嗜冷酶优化高低温活性的底物亲和力,因此减少了自由过渡态的能量势垒。此外,疲软的温度依赖性的活动确保温和的还原催化活性的冷。在这些自然进化酶,达到优化低温活动通过不稳定的结构轴承整个分子的活性部位或不稳定。这涉及到减少的数量和所有类型的弱相互作用强度或稳定性因素的消失,导致改善动力学活性部位残留的冷。这些酶已经用于许多生物技术的应用程序要求活动在温和的温度或快速heat-inactivation率高。
11。未来的途径
虽然最近取得了显著的进展在蛋白质的理解适应极端环境温度,许多问题仍有待解决关于结构关系好寒性的蛋白质。在之前的回顾cold-active酶(108年),各种开放式问题也强调,这个引用应该咨询为了完整性。
低温折叠。蛋白质的折叠反应应该是强烈依赖于温度的任何生物合成多肽:这些多肽合成的冷,是氨基酸序列适应寒冷的折叠,折叠的病原反应步骤,和涉及的御寒陪伴吗?
动力学参数。大多数cold-active酶显示改善低温值增加(不利)值,而在某些情况下得到了改进。的选择压力和生理需求是什么这样的调整在衬底绑定?哪种类型的嗜冷酶需要调整吗?令人惊讶的是,没有详细的enzymological嗜冷酶的分析报道,除了一个(200年]。因此,低温酶活性的精细调整吗?
全球和本地的灵活性。在活性位点结构调整呈现催化中心更有活力但在许多情况下,整个分子更加动态。本地或全球的灵活性的要求是什么?与前一个问题,一些嗜冷酶是统一不稳定(结构和活动),而其他人则只显示heat-labile活动:活动与稳定方法的优缺点是什么?
自然选择。到什么程度的弱稳定性好寒性的酶缺乏选择的结果是稳定的蛋白质或强烈选择高活动?这两个选择压力之间的平衡是什么?
大分子动力学。改进的嗜冷酶动力学是一个中心主题之前的调查但最可靠的技术来调查这方面以及如何区分本地和全球动力学?x射线结构时提供一个静态的图片比较好寒性的,嗜中温、高温蛋白质。需要更复杂的和深刻的方法如核磁共振,中子散射,和H / D交流。
折叠漏斗。全局模型描绘activity-flexibility-stability关系好寒性的酶在图13是有吸引力的,但它是建立在有限数量的案例:我们可以概括这个模型或有一些变化和完善这个模型吗?
极端环境温度。好寒性的蛋白质和嗜热蛋白相比如何?有特定的适应性机制低或高温度?或者,有连续自适应策略从低到中等和高温度?
目前作者的愿望,这样的开放式问题将刺激年轻的研究人员在这个领域开始以完善的低温蛋白质,有助于我们理解这个有趣的话题包括微生物学、酶学、生物化学、生物物理学。
注意:南极细菌的基因组序列Oleispira南极洲最近沉积基因库,以及11个蛋白质的晶体结构在PDB这种细菌。NMR分配一个新的好寒性的蛋白质也报告(320年]。
确认
作者的研究实验室是由欧盟、欧洲航天局,该地区Wallonne(比利时),背景国家de la任职(比利时),和列日大学的。提供的设施研究所Polaire法语也承认。