线粒体细胞色素C氧化酶亚基1前列腺癌的序列变异

摘要

目的．线粒体DNA (mtDNA)突变在包括前列腺癌在内的所有成人肿瘤中都有描述。在前列腺癌(PCa)患者中，细胞色素c氧化酶亚基1 (COI)基因突变存在显著的种族差异。本研究的目的是鉴定非洲人和白种人前列腺癌患者COI基因序列的变异。方法．我们对482名前列腺癌患者和189名对照者外周血中的COI基因进行了测序。所有与修订后的剑桥参考序列(rCRS)不同的碱基都被分类为沉默碱基或错义碱基，然后在种族和已发表的报告之间进行比较。结果和结论．我们发现8.8%的白种人前列腺癌患者和72.8%的非裔美国人前列腺癌患者存在遗传的mtDNA COI错义变异(对比0.0%对照组)。总共鉴定出144个COI变异，其中30个是错义突变。在482例PCa患者中，116例(24.1%)有一个或多个错义突变。对该基因和这些突变的进一步评估可能有助于识别遗传风险人群。非裔美国人COI的高突变率可能是前列腺癌中观察到的种族差异的部分原因。

1.介绍

前列腺癌是美国男性癌症死亡的第二大常见原因[1]非洲裔美国人比遗传和环境因素都能死于这种疾病的白种人男性更可能死于这种疾病的可能性更大的可能性。2］．

在所有细胞中发现线粒体，并且是能源生产，反应性氧物种生成和凋亡的核心，均有癌症。线粒体是氧化磷酸化过程中的细胞ATP产生的位点，所述氧化磷酸化过程包括电子传输链（呼吸络合物I-IV）和ATP合酶（复合V）。线粒体包含其自己的DNA（MTDNA），16.5kb圆形自足内含物分子，它们编码两种核糖体RNA（12s和16s rRNA），完全互补22转移RNA（TrNA）和13个多肽。已在乳腺，结直肠，卵巢，胃，肺，胰腺，脑，肾，甲状腺和许多其他实体瘤中发现MTDNA突变，包括前列腺[3.］．在Lebers遗传性视神经病变、Leigh综合征、糖尿病、阿尔茨海默病和帕金森病中也发现了MtDNA突变[4.］．

MTDNA具有其高拷贝数，是潜水传播，缺乏重组，并且具有比核基因组更高的序列演化率[5.］．因此，来自离散母系的人类群体拥有独特的mtDNA单核苷酸多态性(SNPs)集合，这些集合定义了特定的遗传背景，称为单倍群[6.那7.］．蛋白质编码区SNPs在人类基因组中经常发生，可分为:错义(氨基酸改变)和沉默[8.］．

一个主要的挑战在于确定观察到的突变是否具有致病性。氨基酸改变突变可能会影响蛋白质功能，也可能是中性的[9.］．

以前，我们发现MTDNA基因细胞色素C氧化酶亚基1（COI）中的种系突变与高加索人中的前列腺癌有关[10］．我们还报道了两种突变T6221C和T7389C与非洲裔美国男性PCa相关[11］．与前列腺癌相关的特定遗传COI基因突变存在显著的种族差异。因此，我们对前列腺癌病例和对照组的COI基因进行了测序，并比较了不同种族之间的突变。

2。材料和方法

2．1.主题

之前描述了一些研究受试者[10那11］．此外，本文还纳入了前列腺根治性切除术前的新患者。所有的实验都被Emory IRB批准的协议所覆盖。

“无癌症”对照组是至少50岁的受试者发现，如前所述，发现不含前列腺癌[10那11］．白种人对照组和一小部分非裔美国人对照组都进行了前列腺活检，以证明没有前列腺癌。对非裔美国人进行了大约5年的跟踪调查，发现他们没有患上前列腺癌。

2.2。基因组DNA /聚合酶链反应（PCR）扩增的制备

从Emory的组织库中选取前列腺癌患者样本，使用Qiagen FlexiGene (Valencia, CA, USA)提取外周血单个核细胞DNA。对线粒体COI区5904-7445进行扩增，使用的引物如下:华氏5772度: 5 'aggtttgaagcttcttc3 ';6720r.：5'TACCTATGTATCCAAATGGT3'和华氏6531度: 5 'ctaacagaccgcaacctcaa3 ';7620 r：5'GCGTCTTGTAGACCTACTTG3'（IDT，Coralville，IA，USA）。每次PCR反应在50μl中进行，含有50-150ng DNA，每次DNTP 0.2mm，1.5mM MgCl₂，每次底漆（Roche，Indianapolis，In，USA）和2.5个单位的扩增金DNA聚合酶（Applied Biosystems，Uste City，CA，USA）。反应条件为：95℃，7分钟，其次在94℃下进行40个循环，1分钟，55℃，1分钟，72℃，1分钟。通过亚乙糖染色的丙糖凝胶的溴化乙锭染色来观察双链PCR产物。

２.３.mtDNA COI基因测序

测序使用大染料终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)μL含经ExoSAP-IT (USB, Cleveland, OH)预处理的PCR产物和来自IDT的8条测序引物:(5772F, 6720R, 6531F, 7620R， (6080F.: 5 'tctacaacgttatcgtcaca3”),(华氏6930度：5'tgcagtgctctgagcctag3'），（6340R.：5'CTAGGTGTAAGGAGATG3'），和（7150 r：5'gatttacgccgatgaatatg3'））。将模板在96℃下变性1分钟，然后将25℃为96℃，10秒，55℃，5℃，60℃，4分钟。使用Centri-Sep 96平板（普林斯顿分离，阿德列德，NJ，USA）除去多余的染料终止剂，并重新调整20 μhi -二甲酰胺(应用生物系统，沃林顿，英国)。测序使用Applied Biosystems PRISM 3100基因分析仪进行，并使用SEQSCAPE V2.1进行分析。所有的核苷酸替换与剑桥参考序列(rCRS)进行比较。

2.4。表征突变的致病性

2.4.1。保护指数(CI)、格兰瑟姆值(GV)和等位基因指数(AI)

进化保守是一种强大的预测因子，致病性致病性，在进化状态下的氨基酸取代更可能是致病性的，而不是较少的保守位置。比较61个非人哺乳动物物种的COI基因的氨基酸序列，以确定本研究中确定的30个麦基义突变的保守指数[12］．通过确定氨基酸与野生型人氨基酸相同的这些61种的百分比来计算保护指数（CI）。计算Grantham值（GV），以评估突变体和野生型氨基酸的组成，极性和分子量的差异[13］．每个突变的频率与不同人群中的突变频率进行了比较，如在线mtDB数据库中2,704个个体的突变频率[14］．我们将任何碱基替换的“等位指数”定义为该突变在mtDB中的2,704个序列的百分比。如果数据库中没有报告，那么等位基因索引要么被报告为“唯一的”，要么被报告为等位基因索引为零。

2．5．用计算机算法进行致病性分类

我们使用了三个程序来分类为30个麦克义突变的致病性。（i）多态性表型v2（polyphen2）是使用八个序列的对准和三种基于结构的标准的软件，以预测氨基酸取代对使用物理和进化比较的蛋白质的结构和功能的影响。突变被评为良性那可能会破坏那或者可能是破坏性的[15那16］．(ii)非同义单核苷酸多态性分析仪(nsSNP)是另一种利用多序列比对和3D蛋白质结构中包含的信息进行预测的工具。突变被评估为中性、疾病或未知(由于缺乏数据而无法预测)。nsSNP分析仪结合了从容忍到不容忍(Sorting Intolerant From Tolerant, SIFT)服务器，计算三类信息:(1)SNP的结构环境，包括溶剂可及性、环境极性和二级结构;(2)多序列比对中替换的归一化概率;(3)原始氨基酸与突变氨基酸的相似性与差异性[17］．(iii) PMUT是一个致力于预测单个氨基酸取代的病理特征的服务器，它在两个不同的水平上工作:(1)从突变热点数据库中检索信息(2)分析snp。该方法提供的可靠性指标介于0(低)和9(非常可靠)之间[18］．

结果

我们分析了482例前列腺癌患者的mtDNA COI基因全序列，其中包括250例白种人和232例非裔美国人。我们还对46名白种人和143名非裔美国人进行了“非癌症”对照测序。我们发现，8.8%的白种人前列腺癌患者和72.8%的非裔美国人前列腺癌患者中共有192个遗传mtDNA COI错义变异(对照组为0.0%)，而对照组为64.3%;表格1）.

鉴定了总共有144个COI序列差异，包括30个畸形变种（表3.）.Fisher精确检验用于评估每个前列腺癌患者COI错义突变之和与“无癌”对照组之间的关联。共有116名患者在30个不同的位点上出现了至少一个错义突变。总体而言，在不考虑种族因素的情况下，病例与对照组之间的突变率(）是相似的;然而，种族特异性突变率确实揭示了在高加索人中病例和对照的统计学上显着差异（表1）.

30个错义突变中有12个高度保守，CI至少为97%-100%，分别是:A5935G、G5949A、G5973A、G6081A、T6124C、G6261A、G6285A、A6663G、G6924T、G7041A、T7080C、A7305C2）.相反，以下突变：C5911T，G5913A，A6040G，T6253C，C6340T，A6891G，A7083G，A7146G，C7147T，A7158G，T7354C和T7389C和T7389C改变了非经过可操作的氨基酸。在一个患者的一个患者中，在一个是同义突变的患者中发现异质突变。

4.讨论

2005年，我们提出了第一个证据，表明线粒体COI基因的遗传突变易导致以白人为主的美国人患前列腺癌[10］．2009年，我们研究了非洲裔美国人，也发现了这种基因的遗传突变[11］．在比较这两组人时，我们发现了有趣的相似之处和显著的差异。本文的目的是对这些发现以及另外89例新的前列腺癌患者进行综合分析，以便更好地了解该基因的变异以及前列腺癌与种族的相关性。因此，我们现在报告的联合分析包括482例病例和189例对照，共671个已完成COI基因测序的个体。

4．1.COI错义突变在前列腺癌中的致病性

在氨基酸改变(错义)突变(相对于剑桥)中，我们可以开始评估替代在生物学上的重要性的可能性，主要有两种方法。首先是分析氨基酸侧链在化学组成、极性和分子体积方面的差异程度。对于格兰瑟姆值(GV)，数值越低表示化学差异相对较小(因此在生物学上可能不那么重要)，数值越高表示化学差异相对显著(在生物学上可能更重要;表格2）.第二种(也是更常见的)评估氨基酸替代可能的生物学重要性的方法是计算种间保护指数(CI)。如果所有61种非人类哺乳动物都有野生型氨基酸，则CI为100，从进化角度来看，该氨基酸高度保守，极有可能具有致病性。

下一阶段的分析是比较特定突变在不同人群中的比率，包括前列腺癌病例和对照组，或者将前列腺癌病例与更大的人群序列数据库进行比较。在线mtDB数据库包含2704个个体完整的线粒体DNA序列，易于检索[14］．因为没有这2704个人的临床或疾病信息，有些是男性，有些是女性，有些男性无疑要么患有前列腺癌，要么会发展成前列腺癌，这种比较与病例和对照组的突变频率比较有着根本的不同。这个种群数据库的优点是有大量的序列(个体)来比较突变频率。缺点是没有相关的临床信息，特别是前列腺癌的发病率。

我们还比较了病例和对照组中每种突变的频率。我们的数据包括两个截然不同的病例对照比较。第一宗个案是美籍白种人个案()，并与严格定义为的CA对照组进行比较不患有前列腺癌(）.这些对照是从前列腺活组织检查队伍中招募的，并满足以下标准：它们是至少50岁的男性，其血清PSA小于4ng / mL，至少一组阴性前列腺活组织检查。第二个病例控制比较来自弗林特男性的健康研究，并限于AAS。该病例全部病理学核实，对照组是居住在Genesee县，MI，MI，USA的40％和79岁之间的男性，其血清PSA低于4.0和负数字直肠检查（不是活检）。加入该对照组是来自活检阴性对照组的9 AA男性。因此，AA病例和控制的最终数量分别为232和143。

我们的发现既具有种族特异性又具有种族独立性。如果将所有前列腺癌病例中错义COI突变的总频率(192/482 = 39.8%)与对照组(92/189 = 48.7%)进行比较，差异无统计学意义(）.在CA病例中，突变率为8.8%，而在CA对照组中为0% (）.AA病例的突变率为72.8%，而对照组为64.3% (）.将这些突变率与大型(临床无特征)数据库进行比较是很有趣的。虽然在线mtDB数据库不将个体分类为CA或AA，但它提供了基于大陆起源(非洲和欧洲)的序列数据。该数据库中欧洲人的COI突变率为1196人中的79人(6.6%)。mtDB数据库非洲COI突变率为249个中的142个，突变率为57%，与我们(Genesee County Michigan) AA对照(64%)相当。

CA前列腺癌病例的测序显示了几种仅在CA案例中发现的COI突变。这些包括核苷酸位置（N.P.）6253（3次），6261（4次），6663（两次）和7080（两次）下的畸形突变。AA男性这些突变的频率是完全不同的，并且在对照中发现了这些突变中的每一个。当加利福尼亚州和AA男性被认为是一起，N.P.在7例和7例对照中发现了6253突变，N.P.在8例中发现6261突变，1个控制，N.P.6663在16例和7个控制中，以及N.P.7080只有2例，没有控制。此外，在病例中，与非洲血统相关的突变在69例中发现的7146例突变和36例对照组和57例中的7389次突变和25例进行。因此，在非洲裔美国控制人口中发现了一些仅在白种人前列腺癌病例中发现的一些突变。

Ca对照有多个阴性前列腺核心活组织检查，而AA对照未生物检查，但只有前列腺的负面数字直肠检查。单独检查显着较低的特异性比活组织检查更大，因此未确诊的病例进入AA控制群体有更多的机会。

有许多突变在病例中比对照组更常见，甚至在合并组中。这些突变包括5913、5953、5949、5973、6040、6081、6124、6267、6285、6340、6891、6924、7041、7080、7083、7158和7305位点的遗传错义突变从未在任何控制中观察过与单一非裔美国人对照组相比，8个病例中有6261例，病例发生率比合并组的对照组增加了3倍以上。

4．2．G6261A突变(图1）

G6261A突变是唯一的突变，其交谈指数为100%，等位基因指数为0.5。这意味着所有61个非人类哺乳动物物种在这个位置都有野生型氨基酸，而在mtDB的2704个序列中只有0.5%的序列有这种改变。在CA和AA病例中，这一比例都高于各自的对照组。因此，这种突变符合我们在前列腺癌发病机制中潜在重要的所有标准。G6261A在膀胱癌患者中也有报道[19］．

在对特定人体mTDNA的另一项研究中，对不同气候的适应性，在一个亚洲和一个欧洲人中报道了G6261A突变[20.］．还有其他研究报道了在Leber遗传性视神经病变、2型糖尿病、高血压、结直肠癌和唐氏综合征中G6261A突变[21-26］．还发现G6261A与HAPLOGROUPS T2，L3EB，R1，J和H相关联[21那27-29］．

4.2.1。计算机算法分析

我们使用Sift、PolyPhen2、nsSNP Analyzer和PMut程序对我们的30个错义突变进行分析，发现C6340T和T7080C突变均预测为疾病(nsSNP Analyzer)和病理(PMut)， PMut可靠性指数分别为9和6。这些数字被认为具有很高的可信度。G5973a、a6040g、g6081a、t6253c、G6261APMut程序预测G6267A、G6924T、C7147T、A7299G、T7354C和A7305C均为病理，置信度为0(低)-9(高)。(见表3.．）

总体而言，Polyphen2只预测了两个突变为“可能损坏”（假阳性率为20％）。NSSNP分析仪仅预测了畸形突变中的五个作为“疾病”（假阳性率为38％，假负率为28％）[18］．PMOT计划将十五个畸形突变预测为“病理学”，并且它在人类中的预测成功率为80％[18］．最终，通过单独测序不能完全测定前列腺癌发病机制中的这些遗传的COI畸变突变的重要性。必须在受控功能实验中确定这些突变的真正生物学影响，该实验室超出了本文的范围。

5.结论

线粒体编码的COI基因的遗传错义突变在白种人和非裔美国人前列腺癌患者中都存在，在对照组中也存在较小程度的错义突变。这种基因中有两种错义突变，在非裔美国人身上发生的频率异常高，因为它们出现在人类进化的早期，并在很大比例的人口中“固定”。虽然不能确定这些起始突变具有致病性，但7389突变与疾病显著相关。在一项对白种人和非裔美国人的综合分析中，30个错义突变中有20个只发生在男性癌症患者中，而在189个对照组中从未发现。在这20个突变中，有3个(A5935G、G5949A和G6924T)在mtDB数据库的2704个完整序列中未被观察到，并且存在种间(）保护指数为100％。在这些20个突变中，所有三个计算机算法（多个计算机算法（Polyphen，NSSNP和PMUT）预测一个（T6124C），以分配最高可能的可靠性得分（9）的PMUT。

在8例癌症患者中发现G6261（A120T）突变与频率增加3倍的单一对照（1.7％对0.5％）。此外，这种突变与两种族群中的前列腺癌有关，只有0.5％的在线2704序列中发现，也有100％的间隙保护。

遗传COI基因错义突变与白种人和非裔美国人的前列腺癌显著相关。一些显著的突变似乎是种族特异性的，而另一些则是种族独立的。特定的疾病相关突变可能需要在实验室中进一步研究，以确定疾病相关的可能机制。前列腺癌的种族差异可能是由于遗传的线粒体DNA突变。

缩写

MTDNA：	线粒体DNA
ROS:	活性氧
汤尔科斯：	氧化磷酸化
SNPS：	单核苷酸多态性
CA:	美国白人
AA：	非裔美国人
CI：	保护指数
问:	格兰瑟姆的价值
人工智能:	等位基因的指数
RCRS：	修改了剑桥参考序列。

资金

这项工作得到了退伍军人行政娱乐奖（J.A.Petros）和NIH Grant Po1CA98912以及埃文斯县的支持资助和Larry C. Williams先生，Brecrenride Group，Atlanta，Ga，USA。

披露

没有作者与本文中提到的任何商业实体有任何财务关系。

致谢

作者希望感谢Fray F. Marshall博士为他的重大努力，以支持这项研究在经济上以及患者招募和材料。Kathleen A. Cooney博士，Anna M. Ray和Kimberly A. Zuhlke（密歇根大学）贡献了非洲裔美国病例和控制，而无论哪些本研究都不会成为可能。

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