文摘
间充质干细胞(msc)是最具潜力的多功能干细胞可以分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞。这种细胞的灵活性导致广泛的临床使用msc在组织修复和再生。免疫系统是一个关键的球员在调节骨重塑。近年来,免疫系统和骨代谢之间的关系已成为越来越关注的兴趣。二甲双胍的降糖药物,产生强大的影响代谢信号。然而,二甲双胍是否能调节骨代谢或二甲双胍是否可以通过调节巨噬细胞免疫环境的影响尚未完全阐明。在此,我们特别探讨了复杂巨噬细胞之间的相互作用和人类脐带间充质干细胞(UC-MSCs)在二甲双胍的上下文中。我们的研究表明,二甲双胍不仅刺激骨生成UC-MSCs也影响了通过促进M2但减少M1巨噬细胞的免疫系统。机械,我们发现metformin-treated M2巨噬细胞具有更强的coculture系统论述能力。分子,这些metformin-stimulated M2巨噬细胞促进骨生成通过激活PI3K / AKT / mTOR途径。 As demonstrated by using PI3K-specific inhibitor LY294002, we found that the pathway inhibitor partly reversed osteoinductive activity which was activated by coculture of metformin-treated M2 macrophages. Overall, our novel research illuminated the cooperative and synergistic effects of metformin and M2 macrophages on the dynamic balance of bone metabolism.
1。介绍
骨质疏松症是最常见的代谢性骨病妥协骨密度、骨小梁的微体系结构恶化,增加骨骼脆弱,因此容易骨折(1]。据估计每年全球有超过2亿人患有骨质疏松症(2,3]。老年人和绝经后妇女骨质疏松症风险最高的是由于雌激素不足(1,4,5]。糖皮质激素,在临床实践中,常用的是另一个骨质疏松症最常见的原因(6,7]。由破骨细胞骨吸收和重构由间充质干细胞(MSC)派生造骨细胞是骨骼内稳态的严格监管过程(8]。因此,干预措施,促进msc向成骨细胞分化会很有前途的替代提高骨再生(9]。人类脐带间充质干细胞(UC-MSCs)已成为有吸引力的候选人,因为脐带的组织(加州大学)是msc和很容易收集的丰富来源以较低的成本(10,11]。
二甲双胍,兴奋剂的能量传感器AMPK,目前推荐为2型糖尿病一线代理。除了降低高血糖的主要角色,二甲双胍在各种各样的生物过程中扮演着重要的角色,如抗肿瘤、抗炎、抗衰老的,心血管,王亚南,组织再生活动(12- - - - - -15]。作为一个老药新应用,二甲双胍被广泛记载调节代谢和体内平衡的骨髓14,16]。它促进了诱导多功能干细胞的分化和矿化msc和成骨细胞,保护glucose-injured成骨细胞,甚至直接参与造骨细胞的增殖(16,17]。尽管如此,潜在影响二甲双胍对UC-MSCs和免疫细胞的骨环境尚未完全阐明。
巨噬细胞是至关重要的先天免疫细胞编排炎症级联,免疫反应,和组织修复18]。巨噬细胞有可塑性适应多种环境因素并分化成各种功能状态(19]。一方面,二甲双胍等因素可能分化的巨噬细胞和抑制inflammasome激活(20.]。另一方面,这些巨噬细胞极化可能反过来调节骨环境和改造21- - - - - -23]。因此,更好地了解巨噬细胞之间的相互作用和msc可以彻底改变我们对骨内稳态的理解。
在我们的研究中,我们旨在评估UC-MSCs的二甲双胍对骨的影响,探讨巨噬细胞的极化二甲双胍的存在,并阐明复杂的监管免疫系统之间的相互作用和骨生成。
2。材料和方法
2.1。UC-MSCs的分离和鉴定
新鲜UCs来源于健康的年轻女性捐赠者收到复旦大学妇产科医院的正常交付。通知书面同意从所有捐赠者的家庭,和组织收集通过复旦大学华山医院的机构审查委员会。分离、培养UC-MSCs之后建立文学过程(24]。短暂,沃顿商学院的果冻是隔绝UCs然后切碎成1 - 3毫米3在无菌条件下碎片。这些作品被消化2毫克/毫升胶原酶II型(美国Sigma-Aldrich)解决方案1 h和搅拌(220 rpm) 37°C。离心后,细胞沉淀resuspended,透过100年μm细胞的过滤器。细胞被镀在杜尔贝科修改鹰的介质(美国Gibco DMEM)补充heat-inactivated 10%胎牛血清(Cyagen的边后卫,中国),1%青霉素和链霉素(Beyotime,中国)在湿润的气氛中有5%的二氧化碳在37°C。
在大约80%的融合细胞亚文化,通道3 - 6被用于后续的实验。相差显微镜下的形态进行了观察(奥林巴斯、日本)。UC-MSCs immunophenotypic识别、表面标记CD44, CD73, CD90、CD45、CD19, CD31、CD34、CD45验证流式细胞分析仪(美国BD FACSCanto II)。细胞被沾APC-conjugated人类CD44抗体,CD45, CD19, CD31, CD34, FITC-conjugated抗体人类CD90、CD105,或者PerCP / Cyanine5.5 - 5.5 (PC)共轭抗体CD73(美国从BioLegend)。
2.2。细胞凋亡分析
细胞凋亡的检测是通过膜联蛋白V / Propidium碘(PI)双重染色工具包(美国BD生物科学)根据制造商的指示。经过不同浓度的二甲双胍(0,100,200μ米)48 h,细胞与胰蛋白酶消化,收获和PBS洗两次,200年resuspendedμl绑定缓冲和标有5μl膜联蛋白V和5μ我在黑暗中π。用流式细胞分析仪检测到凋亡分布,细胞凋亡的最终比例计算作为早期和晚期凋亡的总和。
2.3。CCK-8化验
与细胞计数细胞的可行性UC-MSCs估计Kit-8 (CCK-8、Dojindo、日本)。简单地说,细胞被播种到96孔板的浓度 细胞每口井。然后,不同浓度的二甲双胍是添加到培养基中。孵化后48 h,媒介在100年取代μ我刚做好的DMEM包含10μl CCK-8解决方案。细胞被孵化37°C 2 h在黑暗中。在450海里用分光光度计测量吸光度(BioTek SynergyH1,美国)。实验进行了一式三份。
2.4。茜素红染色法和碱性磷酸酶(ALP)测定
诱导骨生成,UC-MSCs培养的成骨分化媒体(中国Cyagen)根据协议。短暂的融合率为80%左右时,UC-MSCs被替换为新的成骨分化培养基。每3天中被改变,细胞连续培养21 d。分化细胞被固定在4%多聚甲醛30分钟。洗两次后,最终细胞染色茜素红(Cyagen,中国)15分钟来可视化钙结节。至于高山酶活性、评估与执行BCIP /电视台高山颜色开发工具包(Beyotime,中国)。UC-MSCs与PBS冲洗两次,4%多聚甲醛固定后7 d诱导与分化媒体。固定后,细胞被孵化1毫升BCIP /电视台工作的解决方案在黑暗中30分钟。颜色反应与去离子水终于终止。使用相差显微镜获得的图像。
2.5。实时定量PCR (RT-qPCR)
总RNA提取UC-MSCs使用试剂盒试剂(生活技术,美国)根据制造商的协议和相对地转录成互补DNA(互补)和逆转录酶(豆类、日本)。PCR是使用预混料预制SYBR绿色主人混合(豆类、日本)StepOnePlus rt - PCR机(美国应用生物系统公司)。使用2相对mRNA表达水平计算(−ΔΔCT)方法规范化GAPDH之后。成骨的基因的引物序列表中列出1。
2.6。西方墨点法
UC-MSCs总蛋白质是细胞溶解里帕缓冲区(Beyotime)含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(Beyotime)。然后浓度测量用BCA试剂盒(Beyotime)根据协议。蛋白质是由sds - page分离electrotransferred到PVDF膜(美国微孔)。膜被封锁的快速阻断缓冲区(Beyotime) 30分钟,紧随其后的是隔夜孵化在4°C主要抗体特定anti-ALP, RUNX2, OCN, p-mTOR(圣克鲁斯生物技术1:1000年,美国),anti-AKT, p-AKT, mTOR, PI3K, p-PI3K (CST 1: 1000年,美国),和反β肌动蛋白(1:1000 Abcam,英国)。膜的清洗然后孵化1 h和相应的二次抗体。最后,乐队在图像定量可视化使用增强化学发光拉斯维加斯4000(美国通用电气医疗集团)。
2.7。培养和THP-1极化
THP-1,使用最广泛的模型对于人类单核细胞/巨噬细胞,是获得中国科学院细胞银行(上海,中国),并经常在RPMI 1640培养基培养(美国HyClone)补充与青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。我们先前极化THP-1单核细胞根据报告的过程(25]。THP-1首先分化成M0巨噬细胞有100 ng / ml佛波醇12-myristate 13-acetate(美国σPAM) 24 h。M0细胞被极化成M1巨噬细胞与孵化100 ng / ml有限合伙人(美国PeproTech)和20 ng / ml IFN -γ(PeproTech)额外的48 h。生成M2表型,M0人群暴露在20 ng / ml il - 4 (PeproTech)和20 ng / ml IL-13 (PeproTech) 48 h。极化巨噬细胞的表型是由电池制造商通过流式细胞术。M1和M2巨噬细胞染色使用lineage-specific抗体,与PE反CD86 M1, APC反CD206 (BioLegend)平方米,又FITC反CD11b (BioLegend)单核细胞。FlowJo软件是用于统计分析。
2.8。间接Coculture UC-MSCs的巨噬细胞
总共 THP-1巨噬细胞被镀成0.4μ米孔插入6-well Transwell板块(美国康宁公司)在2毫升的媒介。M1、M2或metformin-treated M2巨噬细胞诱导和培养在腔室使用上面的极化方法。诱导metformin-treated M2巨噬细胞,不同浓度的二甲双胍(0、50和100μ米)治疗过程中M2极化。极化后,诱导媒介改变了常规的RPMI 1640中、和插入被添加到包含UC-MSCs 50%融合abluminal室。总RNA和蛋白质分离得到UC-MSCs 48 h后信息间接coculture。
2.9。免疫荧光
UC-MSCs被附加到玻璃幻灯片。48 h后coculture M2或metformin-treated M2巨噬细胞(二甲双胍100μ米),UC-MSCs与4%多聚甲醛固定15分钟,特里同permeabilized 0.3% x - 100为30分钟,和阻塞在1% BSA 30分钟。细胞培养在一夜之间在4°C单克隆抗体p-mTOR(1: 100年,圣克鲁斯生物技术)。洗后三次,幻灯片和Alexa萤石孵化488 -共轭二次抗体1 h,然后用Alexa萤石标记细胞肌动蛋白丝555 -共轭phalloidin (Beyotime) 20分钟。核与DAPI复染色。荧光图像捕获使用徕卡TCS SP8共焦显微镜(德国徕卡微系统)。
2.10。统计分析
提出了从三个独立的实验中获得的数据 。所有统计分析使用GraphPad Prism 9.0 (GraphPad软件,CA)。双尾学生的 - - - - - -测试被用来比较两组的数据。单向方差分析是评估的比较三个或更多组之间的差异。值< 0.05被定义为意义阈值。
3所示。结果
3.1。UC-MSCs的识别和表征
加州大学是msc的最重要来源之一。在这项研究中,我们孤立的人类UC-MSCs和确定细胞建立最低但被广泛接受的标准(11,26]。的immunophenotype与流式细胞术结果显示阴性一群表面制造商CD19, CD31、CD34、CD45(图1(一)),而CD44阳性,CD73, CD90、CD105(图1 (b))。plastic-adherent能力和spindle-like形态具有自我更新能力经光学图像(图1 (c))。能力分化成多个细胞系由成骨的评估,脂肪形成的,chondrogenic能力(图1 (d))。osteogenically分化细胞的钙沉积与茜素红染色证实,胞质脂质小滴的形成被油红O染色,检测和酸性粘多糖与阿尔新蓝可视化解决方案。上面的标识隔离UC-MSCs证实了我们的成功。
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3.2。二甲双胍并不影响UC-MSCs体外的生长
探讨二甲双胍对UC-MSCs增长的影响,我们测量细胞凋亡和细胞生存能力用不同浓度的二甲双胍治疗后48 h。如数据所示2(一个)和2 (b)二甲双胍的浓度为0,五十,100,200μ米并没有显示出对UC-MSCs proapoptotic影响。此外,我们采用了CCK-8试验来评估与不同剂量二甲双胍作为显示细胞毒性的影响。结果表现出生长抑制和促进效应,即使在相对高剂量的400μM组(图2 (c))。因此,我们认为二甲双胍没有细胞毒性的迹象和影响扩散UC-MSCs剂量范围在我们的测试。
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3.3。二甲双胍促进UC-MSCs向成骨细胞的分化
阐明UC-MSCs二甲双胍的潜在影响,成骨分化和矿化研究。我们首先发现osteogenically分化细胞与茜素红染色。我们用不同浓度的二甲双胍(刺激UC-MSCs 0 50和100μ米)的成骨诱导介质21 d。钙沉积在深红色可视化,增加浓度的方式(图3(一个))。进一步确认促进骨生成的影响,我们进行了高山试验,结果显示更大的高山酶活性在高剂量组(图3 (b))。此外,RT-qPCR被用来证实成骨细胞的标记物的表达。如数据所示3 (c)- - - - - -3 (f)成骨基因表达的高山,RUNX2 OCN, COL1A1集团与100年μ二甲双胍与控制相比明显增加。正如预期的那样,我们的免疫印迹乐队显示更高的表达成骨的制造商metformin-treated组,包括高山,RUNX2, OCN(图3 (g))。总的来说,这些结果证实二甲双胍UC-MSCs osteogenesis-promoting影响。
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3.4。二甲双胍调节巨噬细胞极化诱导M1 / M2切换
鉴于二甲双胍是一个关键炎症调制器,我们下一个旨在研究二甲双胍是否对巨噬细胞免疫调制特别是产生重大影响。因此,我们在体外诱导巨噬细胞的极化。与PAM THP-1细胞首先孵化24小时获得M0表型。随后,干扰素,γ和有限合伙人是用于M1极化或il - 4和IL-13 M2表型(图4(一))。不同国家巨噬细胞的形态学图像被显示在图4(一)。我们成功的极化M1和M2表型鉴定和CD86 CD206标记,分别通过流式细胞术。我们的数据表明CD86在M1巨噬细胞显著增加(图4 (b)),而CD206大幅上涨M2-induced组(图4 (c))。在48小时极化过程中,不同浓度的二甲双胍(0、50和100μM)补充道。是视觉上和统计中显示数据4 (d)和4 (e)与二甲双胍,结合感应引起显著减少CD86 (M1表型)表达式,而显著增加CD206 (M2制造商)(数据4 (f)和4 (g))。这些数据表明,二甲双胍可以调节M1和M2巨噬细胞的表型,表型转变似乎有利于M2极化。
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3.5。Coculture UC-MSCs巨噬细胞的成骨能力的影响
分子在周围环境,在很大程度上,改变了巨噬细胞的极化状态(27]。反过来,这些极化巨噬细胞可以调节微环境中发挥关键作用的元素包括间质细胞(28]。因此,在目前的研究中,我们明确地探索与UC-MSCs的角色和巨噬细胞的相互作用。我们首先极化M1和M2巨噬细胞,分别在参议院Transwell系统然后cocultured UC-MSCs在下议院(图5(一个))。成骨的标记进行评估后48 h coculture下议院。如图5 (b)成骨的蛋白质,包括高山、RUNX2 OCN, M2 / MSC-cocultured组中明显富集与MSC相比单独或M1 / MSC-cocultured组。此外,M2巨噬细胞建议奖励的影响成骨基因(OCN,高山,RUNX2和COL1A1) RT-qPCR,而M1 / MSC-cocultured组显示一个下降的趋势(图5 (c))。之前有研究表明M2巨噬细胞分泌成骨的因素促进骨整合(29日]。一致,我们的研究表明THP-1-derived M2巨噬细胞增强骨UC-MSCs而M1巨噬细胞可能相反的时尚。
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3.6。Metformin-Treated M2巨噬细胞促进骨生成mTOR / PI3K / AKT通路
记录,巨噬细胞进行广泛的功能通过直接作用于MSC (30.]。然而,二甲双胍和M2巨噬细胞能否对骨起到协同作用仍然是未知的。我们进行预处理M2巨噬细胞与不同浓度的二甲双胍(0、50和100μ米),然后cocultured间接UC-MSCs 48 h,并调查了影响成骨的能力(图6(一))。免疫印迹结果表明metformin-stimulated M2巨噬细胞具有更强的成骨能力的高水平的高山,RUNX2 OCN,相比之下,M2组(图6 (b))。鉴于二甲双胍促进M2巨噬细胞,因此我们认为干预促进M2极化刺激骨生成。mTOR / PI3K / AKT通路是一个关键的炎症和骨形成之间的联系(31日,32]。我们专注于p-PI3K的表达水平,p-AKT,并通过免疫印迹p-mTOR,他们明显增加与metformin-treated coculture后M2巨噬细胞(图6 (c))。我们的结论进一步验证了p-mTOR的高表达在免疫荧光(图6 (d))。确认参与PI3K / AKT / mTOR的信号,我们阻止了上游与PI3K-specific抑制剂LY294002目标的信号。我们的免疫印迹结果表明抑制剂LY294002抑制mTOR / PI3K / AKT通路,p-PI3K评估低表达,p-AKT, p-mTOR(图6 (e))。同时,骨生成蛋白质高山、RUNX2 OCN下降(图6 (e))。整体而言,这些结果表明,与二甲双胍干预不仅提升M2极化,而且与M2巨噬细胞诱导成骨分化通过激活PI3K / AKT / mTOR途径。
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4所示。讨论
在这项研究中,我们确定二甲双胍是否能起到至关重要的作用在骨中巨噬细胞和它的底层机制。我们的研究表明,二甲双胍促进成骨。此外,我们得出结论:二甲双胍在切换M1, M2巨噬细胞起到了监管作用,这有利于从炎症组织再生状态。随后,我们调查的影响metformin-treated M2巨噬细胞最后透露,metformin-stimulated M2巨噬细胞调节成骨细胞的分化mTOR / PI3K / AKT通路。
骨质疏松症是一种全球普遍存在的公共卫生问题,其特征是低骨量和microarchitectural恶化,诱发一个人高脆性骨折的风险(4,33]。绝经后骨质疏松症是骨质疏松症的主要原因,绝大多数高患病率在绝经后的妇女1,2,4,33]。二次骨质疏松等激素性骨质疏松症也可能低估了骨折风险(34,35]。尽管antiosteoporosis方案的巨大进步,但仍不足特别是骨免疫微环境条件下是不确定和识别34,36]。因此,在我们的研究中,我们发现有代理UC-MSCs二甲双胍和探索他们的复杂与巨噬细胞相互作用。
msc是最广泛研究干细胞和强烈的临床翻译研究在过去几十年。作为多功能干细胞,msc是用于治疗骨骼疾病,因为它们可以分化成成骨细胞遵守骨形成和修复(11]。最近的研究报道,msc的异常分化与等病理生理过程密切相关的中断adipoosteogenic平衡(37]。调查表明,因素诱导脂肪细胞抑制骨生成,反之bone-inducing因素阻碍了脂肪形成,规定之间的相互调节脂肪细胞和成骨细胞37,38]。因此,我们推测外部干预,直接向下msc成骨细胞谱系是有前途的治疗骨质疏松症。在这个研究中,我们证实二甲双胍,体外无细胞毒性的迹象,增强成骨UC-MSCs的潜力。
一个高度复杂的免疫系统包括与许多免疫细胞的相互作用,可以产生各种炎症相关的细胞因子改变骨微观结构。在这些细胞,巨噬细胞具有一个重要的角色在免疫调节和骨骼内稳态39]。巨噬细胞存在于两个主要的偏振状态,经典激活巨噬细胞(M1),或者激活巨噬细胞(M2)。为了更好地理解之间的交互先天免疫和骨重建,我们探讨了影响巨噬细胞与二甲双胍的化学治疗。先前的研究已经表明,二甲双胍改善炎症体内和体外小鼠RAW264.7巨噬细胞极化到M2表型(20.,40]。始终如一,我们显示,二甲双胍能有效地开关人类THP-1-polarized巨噬细胞M1为M2表型。
人们普遍认为不同巨噬细胞极化状态导致骨代谢的不同条件下(3,21,22]。周等人证明了感应M2极化促进成骨分化的21]。康等人证明了M2巨噬细胞细胞外囊泡的论述基因表达增加msc (41]。我们coculture系统也观察到类似的结果。我们发现THP-1-derived M2巨噬细胞促进成骨潜能的msc在M1下降。最近,清等人报道,metformin-induced M2巨噬细胞通过调节AMPK加速伤口愈合/ mTOR NLRP3 inflammasome挑(20.]。京等人表明metformin-polarized巨噬细胞缓解肥胖相关炎症状态(40]。然而,metformin-stimulated巨噬细胞能否指导msc向下成骨的血统仍是一个谜。在我们的实验中,不同浓度的二甲双胍与il - 4和IL-13 costimulated M2巨噬细胞的极化。48 h后孵化,metformin-treated M2组显示更强的成骨能力,这表明二甲双胍治疗多功能和更有效的策略是针对msc和巨噬细胞。
PI3K / AKT / mTOR是一个复杂而重要的信号与多个监管机构和效应器。这些感受器,包括胰岛素、葡萄糖、生长因子和细胞因子,可以启动PI3K / AKT / mTOR信号(31日]。PI3K / AKT / mTOR满足功能在许多细胞过程中必不可少的体内平衡,包括细胞周期、增殖,自噬,炎症和代谢31日,42]。此外,越来越多的证据支持PI3K / AKT的参与/ mTOR骨代谢和重构43- - - - - -45]。即,刘等人证明了morroniside促进骨生成通过PI3K / Akt / mTOR信号(43]。马等人报道,硫化氢提升osteoclastogenesis通过抑制mTOR / PI3K / AKT通路(44]。然而,田中和同事支持,抑制mTOR / AKT信号途径增强dentinogenic能力干细胞从顶端乳头45]。因此,我们试图确定的转录水平mTOR / PI3K / AKT通路后coculture UC-MSCs metformin-treated M2巨噬细胞。符合大多数的发现,我们coculture结果显示增加成骨细胞的能力mTOR / PI3K / AKT通路的激活。此外,这种成骨细胞的活动部分逆转PI3K的药理抑制剂。总的来说,我们证实metformin-enhanced M2巨噬细胞促进骨生成的UC-MSCs通过激活mTOR / PI3K / Akt信号。
5。结论
综上所述,我们的研究提供了证据,二甲双胍的应用能提高成骨分化UC-MSCs没有没有体外细胞毒性的迹象。此外,metformin-treated巨噬细胞显示M2增加标记而M1表型的下行趋势。此外,我们的研究结果显示,metformin-treated M2巨噬细胞更有能力通过激活促进骨生成PI3K / AKT / mTOR信号。总之,这部小说的研究提供了一个概述,巨噬细胞的免疫调制与二甲双胍在骨的积极规定负责。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
通陈的构思和设计研究的主题。分钟沈和Jiahang钼进行了实验。分钟沈分析数据,数据准备,写的原稿。通陈修订后的手稿。慧慧Yu和云峰基金金帮助优化实验条件。所有作者都参与讨论和编辑稿件的最终版本。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金的资助中国(没有。81870081)。