文摘
缺血性心脏病是最常见的心血管疾病和医疗保健的主要负担。然而,其病理生理学仍不完全清楚,和人性化模型疾病机制和治疗是必要的。在这里,我们使用人为多能干细胞心肌细胞(hiPSC-CMs)模型急性缺血再灌注细胞培养装置在我们的小说。大会使交换氧气分压的细胞在几分钟内,模仿急性缺血性事件。在这项研究中,缺氧诱导使用0% O2气了三个小时,再氧化O为19%2气体为24小时,glucose-free血清培养基。根据电生理记录,缺氧减少hiPSC-CM-beating频率和场势(FP)振幅。此外,《外交政策》去极化时间和传播慢了下来。大部分的电生理变化恢复期间再氧化。然而,采用免疫染色的缺氧和再氧化样品表明,形态变化和肌节结构的变化没有恢复再氧化而进一步恶化。qPCR结果显示无显著差异在细胞凋亡或在糖酵解的表达与压力相关的基因或基因。hiPSC-CMs复制许多特征变化的结论,成人CMs在缺血和再灌注,指示其效用作为人性化的急性心脏缺血-再灌注模型。
1。介绍
缺血性心脏疾病,最常见的心血管疾病,是全球主要的健康负担,发生在心脏组织血液供应不足(1]。心肌缺血可能发生突然(急性心肌缺血)当动脉供应心脏组织变得阻塞由于斑块的破裂,导致血液凝块,完全阻止血液供应心脏组织。另外,缺血时可以慢慢发展随着时间的推移建立动脉斑块狭窄动脉腔的直径,减少血液流向心脏组织(慢性心肌缺血)[2]。
目前,动物和初级动物细胞模型是最常用的模型缺血性心脏病疾病的机制,应用治疗治疗和药物开发。然而,这些模型的一个重要缺点是人类和动物的生理差异,阻碍了发展对缺血性心脏病的治疗。许多药物和治疗已承诺在动物试验已经失败在人类由于不同的病理生理过程中正在进行的疾病(3]。因此,高效、可靠的人性化模型是必需的。
由于入侵人类原发性心肌细胞很难收获活检和nonproliferative成人心肌细胞的性质4],而人为多能干细胞(hiPSCs)可以不断产生和分化成心肌细胞(CMs) (5]。然而,hiPSC-derived hiPSC-CMs (CMs)是不成熟的,像胎儿比成人CMs,限制他们在多个应用程序利用率。例如,胎儿和hiPSC-CMs更耐缺氧,因为他们更加依赖葡萄糖对能源生产成人CMs使用主要脂肪酸氧化(6]。然而,在过去的几年中,研究人员开始利用hiPSC-CMs开发人性化缺血再灌注模型(6- - - - - -11]。
之前我们已经提供了一个平台建模心脏缺血再灌注(12),使得测量hiPSC-CM电生理学与微电极阵列(MEA)技术和控制和监测氧气分压的同时细胞培养。然而,我们先前的研究旨在慢性心肌缺血模型,和细胞培养中的氧气水平下降逐渐超过四个小时。另一方面,由于突然急性缺血发生冠状动脉阻塞更快。在这项研究中,我们提出一个新颖的1装配修改盖子结构提供诱导缺氧细胞的方法在几分钟内,允许急性缺血再灌注的建模。
在目前的研究中,我们诱导急性缺氧和再氧化hiPSC-CMs和评估他们的氧化应激反应。实时监控的氧气分压(pO2)直接从细胞培养与监测hiPSC-CM功能长期与合并意味着系统允许的高通量数据收集和比较hiPSC-CM pO电生理变化2经验丰富的细胞。我们表明,hiPSC-CM电生理学变化明显在急性缺氧和再氧化,和类似的变化发生在成人CMs在缺血和再灌注。因此,急性心肌缺血和再灌注模型提出了研究可能是一个有价值的工具,用于缺血性心脏病的建模机制,以及对新药筛选和治疗人性化的缺血再灌注损伤模型。
2。材料和方法
2.1。细胞培养和心肌细胞分化
在这项研究中使用了三个控制hiPSC的行:UTA.04602。WT (13),UTA.10211。EURCCS [14),UTA.11311。EURCCS(描述协议(15- - - - - -17)和数据提出了补充材料,补充图S1)。分化之前,hiPSCs维护和扩大在小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞(美国默克密理博,伯灵顿,MA)在KSR介质(淘汰赛DMEM) (Gibco热费希尔科学,沃尔瑟姆,妈,美国)含10%击倒血清替代(Gibco), 1% MEM NEAA (Gibco), 1% GlutaMAX (Gibco), 0.2%β巯基乙醇(Gibco), 0.5%的青霉素和链霉素(Lonza、巴塞尔、瑞士)。胚状体体分化被用来获得心肌细胞如前所述[18]。
2.2。mac和hiPSC-CM播种
Magnetic-activated细胞进行排序(mac) 20天的区别如前所述[19,20.]。多组织离解工具包(Miltenyi研究,Bergisch格拉德巴赫,德国)用于分离成单个细胞,拟胚体和PSC-Derived心肌细胞隔离设备(人类)(Miltenyi研究)是用来隔离CMs。CMs悬浮在20% EB介质(淘汰赛DMEM含有20%的边后卫(Gibco), 1% MEM NEAA GlutaMAX 1%,和0.5%青霉素、链霉素)和种子细胞表(000年~ 95细胞/厘米2)在玻璃或1-wells微电极阵列(MEA)板(60 mea200/30ir-ti, )(Reutlingen多信道系统MCS GmbH德国)涂上2% Geltrex在淘汰赛DMEM (Gibco)。缺氧和再氧化之前,CMs培养了八天。样本保存在培养皿在正常孵化器没有盖子和封面,和一半的培养基是交换了三次一个星期。
2.3。急性盖子
hiPSC-CMs的平台,导致缺氧和再氧化是类似于系统建模之前用于慢性缺血hiPSC-CMs [12,20.),除了盖子被改变从一个坚实的玻璃制作盖子空心盖子透气型膜覆盖着。这急性盖子设计(图1氧气分压)允许快速变化的样品由于接近(500μ米)的透气型膜细胞。急性盖子从cytocompatible牙科树脂使用3 d印刷形式3 3 d打印机(Formlabs Inc .,萨默维尔市,妈,美国)。透气型聚乙烯膜是附着紧密与盖子的空心圆柱体周围的o形环。
(一)
(b)
(c)
急性盖子的技术性能特点是通过测量氧气分压的动态有或没有细胞,通过确定1-wells的蒸发。阶跃响应从19个kPa 0 kPa pO2测量三个个体急性盖子,两次为每个盖子。下降时间(时间在90%和10%之间的步骤)阶跃响应的计算测量。一个定制的氧传感器平台(21)是利用测量。
通过薄膜蒸发率下定决心要证明使用的盖子的兼容性与干气混合供应(这是一个重要方面是不需要加湿天然气供应)。蒸发研究进行了只是没有dH的细胞2O在1组件玻璃OxyGenie平台(贝克公司桑福德,我,美国)。玻璃被保存在一个标准参考1-wells孵化器在培养皿(两个1-wells玻璃在一个培养皿)急性盖子和封面。蒸发是由测量组件的重量在一开始和结束时的实验。
2.4。缺氧和再氧化
实验时间呈现在图2。缺氧和再氧化实验后30天的区别。——glucose-free EB血清培养基(glucose-free DMEM (Gibco)含1% MEM NEAA, GlutaMAX 1%,和0.5%青霉素、链霉素)缺氧和交换控制样本前一天缺氧诱导的样本。Glucose-free中使用,因为它已被证明,葡萄糖的存在可以防止CMs氧化应激(22]。
缺氧和再氧化的1组件是由连接样品在O意味着记录系统到19%2,5%的公司2,76% N2(常氧)气体在一夜之间基线测量,0% O2,5%的公司2,95% N2(缺氧)气体三小时缺氧,19% O2,5%的公司2,76% N224小时再氧化的气体。缺氧(H)和复氧(人力资源)1组件的玻璃被诱导使用便携式OxyGenie平台,它允许同时接触6个平行样品(12,20.,23- - - - - -25]。缺氧诱导3小时使用低氧气体,而再氧化诱导24小时使用常氧气体。控制样本保存在培养皿内培养箱(两个1-wells在一个培养皿)期间没有急性盖子和覆盖实验(CH持续时间的缺氧和C人力资源期间hypoxia-reoxygenation)。试验后,样品收集一个接一个尽量减少暴露于环境空气。
2.5。测量氧气分压
氧气分压(pO2)是衡量从六个样品没有五MEA和样品的细胞和细胞评估样品中的氧动力学和比较2的电生理变化hiPSC-CMs在缺氧和再氧化。luminescence-based传感器传感和生物相容性的材料被用于测量pO2实验期间每15秒(21,26,27]。实验后,细胞脱离意味着,和氧气测量校准意味着没有细胞。
2.6。领域潜在的记录和分析
hiPSC-CM领域潜力使用微电极阵列记录(60 mea200/30ir-ti, (电极直径30μ200 m和电极间的间距μ米)下令从多通道系统MCS GmbH)评估hiPSC-CMs缺氧和再氧化的电生理反应。的基本电生理特征hiPSC-CMs用于这项研究已经先前执行的(18]。是样品没有订单2测量是放在MEA2100系统(多通道系统MCS GmbH)和连接到常氧气体的过夜基线测量,为3小时缺氧缺氧气,常氧气体为24小时再氧化。MEA进行测量和多信道的实验者(版本2.17.5.21056,多信道系统MCS GmbH)使用25千赫采样频率。一夜之间基线记录(至少18小时)每30分钟1分钟,但改变每5分钟记录1分钟前一个小时开始缺氧。录音在缺氧是1分钟每隔一分钟前30分钟,1分钟每5分钟后30分钟,1分钟每10分钟,剩下的两个小时。前三小时的再氧化,录音协议与缺氧一样,在那之后,每30分钟1分钟记录剩下的21个小时。
是和样品订单2测量被放置在MEA2100 Lite系统(多通道系统MCS GmbH)和多通道的测量进行了实验者(2.17.8.21078版)使用20千赫采样频率。一夜之间基线记录(至少18小时)每30分钟1分钟,但改为每5分钟记录1分钟前一个小时开始缺氧。记录在三个小时的缺氧和再氧化的前三个小时1分钟每5分钟完成。剩下的21小时的再氧化,每30分钟记录1分钟。相衬显微镜的图像是来自所有意味着样品试验前后Axio观察者(蔡司、从德国)使用EC Plan-Neofluar ,WD 5.2毫米的目标(蔡司)。这些照片是用Axiocam 506彩色摄像机(蔡司)。
跳动频率(BPM)领域潜在的持续时间(FPD)领域潜在的振幅(一个部),和去极化时间(t部从22 MEA样本)进行了分析。五电极从每个样本进行分析选择基于强大基线活动(共110个电极)。原始数据与多通道从排列HDF5格式转换DataManager(版本1.12.0.20014,多信道系统MCS GmbH),和数据进行分析和MATLAB(版本R2019b MathWorks公司,纳蒂克,妈,美国)使用内部开发的脚本。领域潜在的持续时间是击败rate-corrected(纠正领域潜在的持续时间,cFPD)使用Izumi-Nakaseko公式(28]。
领域的潜在传播(FPP)通过hiPSC-CM表分析从四个样品。高峰时间戳被发现从记录文件使用多通道分析仪(版本2.14.0.19346,多信道系统MCS GmbH),和R (R版本4.0.2,基础统计计算,维也纳,奥地利)被用来计算领域潜在传播相邻电极之间基于每个FP的时间戳。
2.7。采用免疫染色
hiPSC-CM形态和蛋白表达进行了评估采用免疫荧光图像的(ICC)染色1组件的玻璃。样品固定在4%多聚甲醛20分钟,封锁在10%正常驴血清(擤鼻涕、Nuaille、法国)解决方案为45分钟,与心肌肌钙蛋白T (cTnT)染色,心脏肌球蛋白结合蛋白C (cMyBP-C)和缺氧诱导因子1α(HIF1 -α)在初级抗体解决方案包含山羊anti-troponin T (Abcam ab64623, 1: 1000年,剑桥,英国),鼠标anti-MyBPC3 (sc - 166081, 1: 400年,圣克鲁斯生物技术、达拉斯、TX,美国),和兔子anti-HIF1α表达载体(700505,1:500年,沃尔瑟姆,妈,美国)一夜之间在4°C(上)。驴抗体Alexa萤石568,驴anti-mouse Alexa的萤石647,驴anti-rabbit Alexa萤石488(1:800年,热费希尔科学)被用作二次抗体(小时在室温下孵化(RT))。用DAPI Vectashield安装介质(向量实验室,Burlingen、钙、美国)是用于复染色细胞核。荧光是可视化的奥林巴斯IX51显微镜(奥林巴斯、东京、日本)使用LUCPlan FL N ,WD 3.0 - -4.2毫米(空气)的目标(奥林巴斯)。荧光染色的图像被虎鲸Flash4.0LT + sCMOS相机(滨松光子学、滨松、日本)。共焦图像拍摄LSM 800激光扫描共焦显微镜(蔡司)使用EC Plan-Neofluar 40 x / 0.75, WD 0.71毫米(空气)的目标(蔡司),和2通道光谱与高灵敏度PMT检测器检测。
2.8。核区域分析
细胞核的面积确定的DAPI荧光图像的通道ICC染色使用ImageJ软件(29日]。图像被自动阈值转换为二进制和流域被用来估计核边界在聚集。分析粒子命令是用来确定核区核穿越边境的图像被排除在外,以及核面积小于30岁μ米2或超过400μ米2。
2.9。免疫印迹
hiPSC-CM HIF1 -α表达式是由免疫印迹蛋白质样品评估收集到的1玻璃组件。150年蛋白质样本收集μl 2×Laemmli样品缓冲(美国Bio-Rad大力神,CA)包含5%β巯基乙醇(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州,美国)在95°C加热5分钟,储存在-20°C。20μl 4 - 20%的蛋白质样品运行Mini-PROTEAN TGX预制蛋白质凝胶10 50μl井(Bio-Rad),样本涂抹PVDF膜使用Trans-Blot涡轮等迷你PVDF传输设备(Bio-Rad) Trans-Blot涡轮增压输送系统(Bio-Rad)。膜被封锁的3% BSA (Sigma-Aldrich)三个小时和孵化主要抗体溶液在4°C。鼠标反β肌动蛋白(sc - 47778,1: 1000年,圣克鲁斯生物技术)和兔子anti-HIF1α(700505年,1:1000年,英杰公司)被用作主要的抗体。辣根peroxidase-conjugated anti-mouse免疫球蛋白(sc - 516102,1: 3000年,圣克鲁斯生物技术)和anti-rabbit免疫球蛋白(DAKO P0217, 1: 2000年,安捷伦科技,圣克拉拉,CA,美国)被用作二次抗体(RT)小时孵化。protein-antibody复合物被发现使用Amersham ECL '免疫印迹检测试剂(Cytiva马尔伯勒,妈,美国),和ChemiDoc MP成像系统(Bio-Rad)是用于成像。的抗体被剥离缓冲区(0.705%β巯基乙醇,2% SDS (Sigma-Aldrich)和0.03125米三羟甲基氨基甲烷(美国VWR,二,PA)液在56 Milli-Q水)°C新阻塞和抗体孵化前30分钟。
2.10。基因表达
使用RT-qPCR hiPSC-CM基因表达进行了分析。RNA样本收集从1组件玻璃使用君主总RNA Miniprep工具包(美国新英格兰生物学实验室,伊普斯维奇,MA)和后设备指令。RNA被筛选了两次20μl (nuclease-free 40 (NF)水(最后一卷μl)。高容量cDNA逆转录工具包(美国应用生物系统公司,沃尔瑟姆,MA)用于逆转录后设备指令。
由于RNA量低、前置放大进行了使用TaqMan前置放大器主混合后(应用生物系统公司)设备指令。样本运行下面的热循环协议:10分钟在95°C, 95°C, 15秒的周期和4分钟60°C,在4°C到样本存储在-20°C。表1显示了TaqMan化验(应用生物系统公司)使用的前置放大和qPCR。
分析PKM同种型表达hiPSC-CMs、自定义分析具体PKM亚型1和2被设计出来,商用20×TaqMan化验并不存在。外显子7和8的地区最序列变异是针对设计引物和探针。所有底漆/探针序列导入自定义TaqMan分析设计软件工具(热费希尔科学)来生成定制的化验。探测器的设计将一个小groove-binding一半(MGB),用荧光染料标记(FAM)检测和nonfluorescent冷却器。引物和探针自定义命令从热费希尔科学。序列的引物/探针组合列在下面。(1)PKM同种型1:(我)正向引物:5 - - - - - -CAGCACCTGATAGCTCGTGA-3(2)反向引物:5 - - - - - -TCAAAGCTGCTGCTAAACACTT-3(3)调查:5 - - - - - -AACTTGTGCGAGCCTCAAGT-3(2)PKM同种型2。(我)正向引物:5 - - - - - -AGAAACAGCCAAAGGGGACT-3(2)反向引物:5 - - - - - -CACTGCAGCACTTGAAGGAG-3(3)调查:5 - - - - - -CTGCCATCTACCACTTGCAA-3
TaqMan快速掌握先进混合(应用生物系统公司)是用于qPCR工具包指令后,和三个技术为每个基因复制和样本。的preamplified cDNA样本稀释1:5 (20μl 80年的样本μl (NF水)。一个反应包含2μ0.4 l的稀释preamplified cDNA、μl (TaqMan化验,4μl快速先进的混合(反应总额8μl)。qPCR板块运行以下协议:在50°C 2分钟,2分钟在95°C和40 3秒的周期在95°C,和30秒60°C。的方法用于计算基因的相对表达使用缺氧控制样本归一化(30.]。GAPDH,EEF1A1,真沸点被用作内生控制。
2.11。统计分析
统计分析的数据是使用rstatix执行(0.7.0版)(31日]在r .成对Wilcoxon符号秩和测试Bonferroni调整用于BPM,t部,一个部,cFPD。克鲁斯卡尔-沃利斯测试被用于多个比较,邓恩与Bonferroni调整的测试是用来事后考验FPP成对比较,相对基因表达,细胞核大小和免疫印迹数据。样品数量为每个细胞株和实验类型和分化批次补充表中给出S1。
3所示。结果
3.1。急性盖子和氧气分压
在这项研究中,1组件(数字1(一)- - - - - -1 (c))是用于急性盖子(数据1 (b)和1 (c))来实现快速在细胞培养中氧分压的变化。阿宝2进行了测量与急性盖子使用常氧气体(基线和再氧化)和低氧气体(缺氧)展示快速氧动力学。秋天的时间(从90%到10%) 没有细胞( )(图3(一个)), 测量从MEA和样品细胞( )(图3 (b));然而,最初的订单下降2快,从90%降至30% (5 kPa)阿宝吗2已经实现的 。上升时间(从10%到90%)测量期间从MEA和样品细胞再氧化 ( )(图3 (b))。
(一)
(b)
液体蒸发测量没有细胞与急性盖子(1组件 )和参考1-wells玻璃没有急性盖子在孵化器( )。测量蒸发是 与急性盖子和1组件 参考井,表明使用nonhumidified气体高1组件不会导致液体蒸发。
3.2。电生理的变化hiPSC-CM在缺氧和再氧化
hiPSC-CM电生理学评估使用意味着技术记录从hiPSC-CM表在基线场势,缺氧和再氧化。录音进行评估的跳动频率(每分钟跳动,BPM)(图4(一)),击败rate-corrected领域潜在的持续时间(cFPD) [28)(图4 (b)),去极化时间(t部)(图4 (c)),去极化幅度(一个部)(图4 (d)),和现场潜在传播(FPP)整个hiPSC-CM表(图5)。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(一)
(b)
跳动的频率hiPSC-CMs显著降低在缺氧(数字4(一)- - - - - -4 (e),补充图S2)。每个样本的跳动频率规范化三个基线值的平均值在启动前缺氧得到类似的结果尽管baseline-beating频率样本之间的差异。绝对的BPM值提出了补充图S2所有样品一起和细胞系。BPM的hiPSC-CMs下降已经在第一次30分钟的缺氧,进一步减少,常常完全停止,直到再氧化开始。复氧迅速恢复hiPSC-CM跳动,但意思是BPM增加甚至第一次3小时后再氧化。均值规格化的BPM 在基线, 在0 30分钟缺氧( 与基线), 在30 - 180分钟缺氧( 与基线和0 30分钟缺氧), 在0 30分钟再氧化( 1与30 - 180分钟缺氧), 在30 - 180分钟复氧( 与0 30分钟再氧化), 在3-24 h复氧( 比30 - 180分钟再氧化)。
没有显著差异的cFPD hiPSC-CMs在缺氧或复氧(图4 (b))。平均cFPD略长在缺氧复氧期间但回到基线水平。另一方面,统计上显著的增加t部观察缺氧时,变化又在复氧(数据吗4 (c)- - - - - -4 (e))。的意思是t部是 在基线, 在0 30分钟缺氧, 在30 - 180分钟缺氧( 与基线和0 30分钟缺氧), 在0 30分钟再氧化( 与基线和 与30 - 180分钟缺氧), 在30 - 180分钟复氧( 与30 - 180分钟缺氧和0 30分钟再氧化),和 在3-24 h再氧化。
去极化幅度时观察到显著减少缺氧,提高复氧(数字4 (d)和4 (e))。的意思是一个部是 在基线, 在0 30分钟缺氧, 在30 - 180分钟缺氧( 与基线和0 30分钟缺氧), 在0 30分钟再氧化, 在30 - 180分钟复氧( 与0 30分钟再氧化), 在3-24 h复氧( 比30 - 180分钟再氧化)。
FPP整个hiPSC-CM观察表慢下来在缺氧和恢复略在初始再氧化;然而,年底再氧化、传播仍然是慢而基线(数字5(一)和5(b))。平均FPP时间相邻电极之间 在基线( ), 在0 30分钟缺氧( ), 在30 - 180分钟缺氧( , 与基线和0 30分钟缺氧), 在0 30分钟再氧化( , 与基线和 与30 - 180分钟缺氧), 在30 - 180分钟复氧( , 缺氧和30 - 180分钟), 在3-24 h复氧( )。
3.3。缺氧和再氧化影响hiPSC-CM形态学和蛋白表达
hiPSC-CM形态和蛋白表达进行了评估采用免疫染色荧光图像的控制,组织缺氧,和hypoxia-reoxygenation样本对心肌肌钙蛋白T (cTnT),心脏肌球蛋白结合蛋白C (cMyBP-C)和缺氧诱导因子1α(HIF1 -α)。此外,HIF1——的蛋白表达α和免疫印迹量化。
hiPSC-CM形态学改变了在缺氧和再氧化,这是观察到的荧光图像和MEA的相差拍摄的图像样本缺氧和再氧化前后(数字6(一)和6 (b))。的形态变化观察到荧光图像包括hiPSC-CMs截然不同的肌节结构的破坏,以及减少缺氧和再氧化后的核区相比,控制。意味着核区域 对于CH, H ( 与CH), 对于C人力资源, 人力资源管理( 与C人力资源和 对H)。此外,增加聚合后的hiPSC-CMs观察缺氧和再氧化荧光和相衬显微镜的图像。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
HIF1——的变化α表达没有明显的荧光图像,但免疫印迹HIF1 -α显示后的蛋白表达降低缺氧和再氧化相比,控制数据6 (c)和6 (d))。平均相对表达式HIF1 -α是 对于CH( ), H ( , 与CH), 对于C人力资源( ),和 人力资源管理( , 与CH)。
3.4。hiPSC-CM缺氧和再氧化后基因表达
RT-qPCR被用来评估apoptosis-related的基因表达伯灵顿和BCL2、压力标记HSPA1A和MYH7,血管生成VEGFA,以及糖酵解SLC2A1,PKM亚型1和2在hiPSC-CMs缺氧(H: ;CH: )和复氧(人力资源: ;C人力资源: )(图7)。差异意味着检查基因的相对表达之间的微妙的样本和未达到统计上的显著水平。此外,intrasample和注液电池线基因表达的变化。每个基因和样本的均值和标准差的细胞系补充表中给出S2。
平均相对proapoptotic的表达式伯灵顿和凋亡BCL2略增加H样品相比,CH但在人力资源与C相比略有下降人力资源样本。平均相对的表达HSPA1A和MYH7与H观察心脏压力增加有关样品相比,CH,HSPA1A表达式仍然是提升人力资源相比,C人力资源样品在MYH7表达式是减少人力资源相比,C人力资源。平均相对的表达VEGFA,这是一个已知的缺氧反应相关基因和血管生成,增加相比,H, CH样本。另一方面,表达略减少人力资源相比,C人力资源样本。的意思是表达式SLC2A1和PKM亚型1和2与无氧糖酵解代谢增加相比,H, CH样品和仍在提升人力资源相比,C人力资源,尽管褶皱变化是较低的。虽然有一些轻微的差异意味着表达式的样本组,他们没有统计学意义。
4所示。讨论
在急性缺血性事件通常是由于冠状动脉斑块的破裂,这可以防止远端心肌组织的血液供应(32]。除了突然减少氧气水平和能源的心脏组织,再灌注是一种急性事件,当血液流动迅速恢复到心脏,例如,通过血管成形术(33]。在目前的研究中,我们描述一个小说利用hiPSC-CMs急性心肌缺血和再灌注模型。我们进一步发展之前描述的建模平台心脏缺血再灌注(12,20.与修改1)组装。以前,我们使用了一个坚实的玻璃制作盖子,缺氧和再氧化的4个小时内到达。在目前的研究中,我们使用一个中空的急性盖子覆盖气体渗透聚乙烯膜,允许在几分钟内达到缺氧和再氧化,从而使利用人类iPSC-CMs建模急性缺血和再灌注。hiPSC-CMs回应缺氧和再氧化的变化功能,形态,蛋白表达。观察到的变化是由于阿宝2,因为所有样本在葡萄糖和无血清培养基培养。
我们的研究结果表明,hiPSC-CMs对急性缺氧和再氧化显著变化的电生理学属性(字段潜力,FP)测量技术。在缺氧,hiPSC-CM-beating频率以及FP振幅显著降低。此外,《外交政策》去极化时间显著增加基线相比,尽管减少FP振幅。复氧主要是恢复更改。hiPSC-CM电生理学性质的变化观察到类似于已知发生在成人心脏心肌细胞缺血和再灌注期间。这些变化发生在缺氧细胞ATP生产下降,从而导致电导率的变化不同的离子通过细胞膜和CM电生理特性(34]。
cFPD在缺氧或复氧没有明显变化;然而,原始FPD也显著减少在缺氧而基线(补充图S5)。在我们之前的研究中,我们评估原始FPD值和观察到类似的减少在本研究12,20.]。虽然跳动频率是影响FPD (28,35),也知道跳动频率很低;在这项研究中,观察火焰校正公式可能不工作为cFPD值的计算公式,如Bazett和Fridericia公式,开发更多的生理范围的跳动频率(36]。减少动作电位持续时间是一个已知的影响心肌缺血(34),但目前还没有过度评估从hiPSC-CM心脏缺血-再灌注模型。因此,现在和我们之前的研究评估hiPSC-CM FPD缺氧和再氧化过程中提供有价值的信息在hiPSC-CM FPD这些条件的影响。
在缺氧FPP观察时间大幅减少,而再氧化提高了传播虽然没有恢复到基线水平。减少电传导和形成导电块在心脏组织是一个著名的缺血和负责其产生心律失常,去极化波前的有序传播是重要的健康的心脏收缩(37- - - - - -39]。心脏传导速度的放缓被认为是由于,例如,通过改变细胞间耦合联接蛋白43岁,但并不是所有的机制是完全理解(38]。因此,本文提供的模型可以用来进一步调查这一现象背后的原因。此外,有研究评估药物改善心脏传导组织缺血性事件期间和之后(40],提出的模型也可以应用。
hiPSC-CM形态相似的变化,观察到在我们之前的研究12,20.]。观察破坏组织肌节结构特别是在再氧化,这在其他研究中也被观察到在心肌缺血模型使用hiPSC-CMs [9,41]。此外,核的大小观察hiPSC-CMs减少缺氧和再氧化后,以及HIF1 -α表达,类似于我们以前慢性缺血模型(12,20.]。减少核的大小和破坏细胞结构在缺氧和再氧化可能是由于细胞死亡和细胞培养基质的顺向超然。没有明显的变化在缺氧和再氧化后凋亡基因的表达,通过坏死hiPSC-CMs可能死,也就是说,一个已知的细胞死亡机制在缺血和再灌注(42]。为减少HIF1 -一种解释α表达式是监管的表达式通过oxygen-independent通路(43]。新陈代谢不成熟hiPSC-CMs已知有较高的基线HIF1 -α表达在常氧条件下(44,45,机械应力诱导HIF1——而闻名α表达式以及[46]。在常氧条件下,hiPSC-CMs自发跳动率较高而缺氧,从而导致更高的机械应力。hiPSC-CM跳动率和减少机械应力hiPSC-CMs经历在缺氧可以解释HIF1——下降α缺氧和再氧化后的表情。
基因表达的变化是非常微妙的,不具有统计学意义。缺氧略有增加的表达赞成和凋亡伯灵顿和BCL2,以及压力标记的表达HSPA1A和MYH7。此外,在glycolysis-related表情略有增加SLC2A1和PKM观察亚型1和2,尽管增加未达到统计上的显著水平。CMs被切换到缺血期间糖酵解代谢,细胞的缺氧环境防止脂肪酸氧化,成人CMs(能量代谢的主要途径47]。然而,成熟hiPSC-CMs已知更多依赖有氧糖酵解(6]。在我们之前(慢性)缺血模型,显著增加SLC2A1表达缺氧后观察到的(12,20.),这可能表明,hiPSC-CMs试图增强无氧糖酵解代谢,提高葡萄糖吸收;然而,没有观察到类似的增加在目前的研究中,可能由于缺氧持续时间短得多。然而,缺氧一直的持续时间短,本研究的重点是在急性缺氧对hiPSC-CM功能的影响。
类似的系统与快速氧动力学已经之前提出的几组(48- - - - - -51]。Martewicz等人开发了一个微流控系统的建模相对相似的氧动力学的急性心脏缺血再灌注急性盖子在这项研究中提出的。在他们的系统中,缺氧在几分钟之内就完成了和可逆的改变在CMs的钙动力学观察缺氧。然而,缺氧的持续时间很短,只有5分钟,他们使用主要鼠新生儿CMs代替人类CMs (48]。另一个微流控系统由拜会等人达到1%2不到30分钟,也类似于pO2动态的敏锐的盖子。此外,缺氧的长度是4个小时,类似于我们的研究。但同样Martewicz et al .,他们没有使用人类CMs但主要猪CMs (49]。刘等人提出了一个额外heart-on-a-chip模型集成,电生理监测细胞内生物电子学厘米在急性缺氧(50]。他们取得了在几秒内缺氧,刷新缺氧的微流控芯片的细胞培养通道中,他们保持5.5或20小时的缺氧。然而,永生的鼠标心房厘米(HL-1)细胞系而不是人类的CMs是用于他们的实验50]。Fernandez-Morales等人另一方面hiPSC-CMs用于评估钙信号在急性缺氧;然而,完全缺氧的持续时间只有100秒(51]。因此,长期的变化hiPSC-CMs没有评估的研究。
本研究的局限性包括阿宝的一些变化2动力学。样品的测量显示更快下降时间的阿宝没有细胞2( )将样品与细胞( )(补充图S6)。此外,阿宝有更多变化2样品与细胞之间的动态;然而,hiPSC-CMs的电生理反应不同样本之间非常相似。有几个原因样本之间的差异,包括微小的气泡和变化的影响在组装。气泡显示影响附近的局部氧动力学泡沫。因此,泡沫被困在氧传感器延长氧的动态阅读但可能不会影响细胞因为它们不是位于传感器位置。尽管阿宝的可变性2动力学、缺氧和再氧化以显著的速度来实现。
hiPSC-CM不成熟时通常被认为是作为一个限制缺血模型,作为hiPSC-CMs像胎儿比成年人CMs和已知耐缺血相比成人CMs (6]。此外,改变pH值(51)和钾的水平(52)已知陪缺血再灌注心脏组织,但酸中毒或高钾血症并非在缺氧诱导在目前的研究中。然而,尽管有这些限制,hiPSC-CMs应对缺氧和再氧化与许多已知电生理变化发生在成人CMs缺血期间,如减少跳动频率,传导速度,以及动作电位振幅,增加去极化时间34),hiPSC-CMs对缺氧和再氧化反应更快比我们先前描述的系统(12]。除了电生理变化,hypoxia-reoxygenation hiPSC-CM进一步诱导破坏形态和肌节结构,以及减少核大小,已观察到在其他缺血再灌注模型9,41,53]。
5。结论
总之,hiPSC-CM-based模型急性缺血和再灌注。缺氧和再氧化实现更快比我们之前的研究(12,20.),因此模拟,而急性与慢性缺血。hiPSC-CMs复制许多已知的对缺氧和再氧化的反应,尤其是通过意味着电生理学特性测量。电生理特性在当前综合评价研究。这强烈的贡献的领域利用hiPSC-CMs在缺血建模中,为全面评价hiPSC-CM功能在缺氧和再氧化尤其是对于电生理学一直缺乏。提出了系统建模急性心肌缺血和再灌注可以是一个有价值的工具,用于药物筛选和寻找新的治疗缺血和再灌注损伤,作为长期意味着提供一个有利的可能性,非侵入性,高通量监测hiPSC-CM功能(54]。此外,该平台允许缺血的研究和评价机制利用人类的CMs。
数据可用性
所有的数据都可以在请求从作者。
的利益冲突
Joose克罗伊策是一个BioGenium Microsystems Oy的员工和股东。帕斯的基础是一个股东在同一家公司。
作者的贡献
概念是由M.H. M.P.-M。数据管理是由由M.H. M.H.正式分析,J.K.,一个。- - - - - -J.M. Funding acquisition was carried out by P.K., K.A.-S., and M.P.-M. Investigation was carried out by M.H., J.K., and H.V. Methodology was carried out by M.H. and J. K. Project administration was carried out by M.H., K.A.-S., and M.P.-M. Resources were carried out by P.K., K.A.-S., and M.P.-M. Software was carried out by M.H. and A.-J.M. Supervision was carried out by K.A.-S. and M.P.-M. Validation was carried out by M.H. and J.K. Visualization was carried out by M.H. Writing of the original draft was carried out by M.H. Writing for review and editing was carried out by M.H., J.K., A.-J.M., H.V., R.M.C., P.K., K.A.-S., and M.P.-M. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.
确认
这项研究是芬兰文化基金会赠款支持(M.H.),帕沃·鲁米基金会(M.H.),芬兰(336783 K.A.-S学院。和312411年P.K.),芬兰心血管研究基金会(K.A.-S), Sigrid Juselius基金会(K.A.-S),和毕卡医院区(K.A.-S)。我们感谢坦佩雷大学电生理学核心,成像的核心,和ip核心。
补充材料
补充1图S1: UTA.11311的表征。EURCCS hiPSC-line。补充2图S2: absolute-beating hiPSC-CMs频率在基线,缺氧和再氧化(BPM)每分钟跳动。补充3图S3:心肌肌钙蛋白T的图像(cTnT、绿色)和缺氧诱导因子1α(HIF1 -α采用免疫染色的,红色)控制,缺氧,hypoxia-reoxygenation样本。补充4图S4:滴β肌动蛋白和HIF1-α从免疫印迹分析hiPSC-CM蛋白表达在缺氧和再氧化。补充5图S5:纠正领域潜在的持续时间和原料领域潜在hiPSC-CMs在基线和持续时间不同的缺氧和再氧化时间点。补充6图S6:氧气分压测量实验没有hiPSC-CMs和hiPSC-CMs绘制在同一图。补充7表S1:每个细胞系分化批量和样品数量和实验类型。补充8表S2:意思是相对缺氧后检查基因的表达和hypoxia-reoxygenation细胞系。(补充材料)