小细胞外囊泡从发炎脂肪基质细胞增强NF -派生而来gydF4y2BaκgydF4y2BaB-Dependent骨关节炎的炎症/异化的环境gydF4y2Ba

文摘gydF4y2Ba

过去十年见证了指数增长的努力利用脂肪基质细胞衍生的影响(ADSC)治疗各种慢性退化性疾病,包括骨关节炎(OA),最普遍的共同障碍。读的角度发展中先进的治疗药品,关注最近检查参与组成分泌腺ADSC,有助于解决一个同种异体的使用和可以进一步解剖的选择性净化小细胞外囊泡(股票)。股票可以作为“生物药物载体”传输信息镜像提供细胞的病理生理学。这是很重要的在许多OA患者的临床角度也影响代谢综合征(大都会)。ADSC大都会OA患者功能失调和“炎症”内的脂肪组织。模仿这个条件,我们暴露ADSC il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba,然后我们调查的影响孤立塞在软骨细胞和synoviocytes,分别培养或培养,梳理出这些“il - 1的影响gydF4y2BaβgydF4y2Ba准备签订“基因和蛋白质表达的主要炎性和异化的OA标记。与股票相比隔绝如果ADSC, il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba"股票能够传播NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB在旁观者联合细胞活化。synoviocytes效果更明显,可能是因为更高的分子如CD44的表达绑定。这些发现呼吁仔细描述ADSC的“炎症指纹”,以避免意外消息的传输以及发展gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba“预处理”策略能够救援的抗炎/ anticatabolic潜力ADSC-derived签订。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

脂肪基质细胞衍生(ADSC)是一个新兴的治疗策略,骨关节炎(OA)的管理,获得了良好的成效的关节面保护和滑膜炎症动物模型中的调制,以及疼痛和功能改善临床实践(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。脂肪组织是一种方便的来源基质细胞的恢复,可以更有效地收集与骨髓相比,微创手术(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。进一步利用ADSC的潜力,同时利用一个更符合监管协议,检查参与组成分泌腺的研究越来越关注他们的(gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。最近,好特点的一部分细胞外囊泡(小细胞外囊泡,塞夫)展示了潜在的疾病修饰属性影响营运过程。特别是股票获得检查参与组成分泌腺ADSC联合协议的降水/尺寸排阻色谱法有效地抑制NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba软骨细胞和B信号synoviocytes [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。NF -考虑到关键的角色gydF4y2BaκgydF4y2BaB在办公自动化的发展gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),ADSC-derived塞显示承诺一个有效的工具来管理办公自动化的发展。然而,一个可能的脂肪组织之间的交互和OA不应被忽视。事实上,OA不成比例地影响肥胖患者由于代谢之间的复杂的相互作用,生物力学,伴随肥胖增加和炎症因素(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]。这些发现表明,脂肪组织本身在OA的病理生理学中起着至关重要的作用。gydF4y2Ba

白色脂肪组织(窟)是一个动态的内分泌器官的主要角色控制的能量,代谢和免疫功能gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。在肥胖,脂肪细胞肥大负责分泌的调节异常模式的出现慢性低度炎症状态和系统代谢管制(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。代谢综合征(大都会)是一个全球流行和预计OA发病的年龄,表明不同的发病机理为MetOA创伤后相比,老化、遗传、或水晶OA (gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。在这些环境中特异表达,脂肪细胞主动分泌促炎细胞因子(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba),和细胞间质血管部分包括ADSC [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba)更多的贡献提高炎症循环,交换他们的行为从抗炎促炎(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。利基,M2的转向M1脂肪组织巨噬细胞的表型也发生(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。此外,ADSC的肥胖病人表现出更高的激活半胱天冬酶3和高对DNA损伤的易感性(gydF4y2Ba15gydF4y2BaNF -]gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活事件(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

慢性炎症系统性风险影响的功能主要稳态机制联合组织(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba),从而推动OA发病机理。,这让质疑ADSC的潜力和检查参与组成分泌腺ADSC OA患者的大部分也大都会影响。这些病理生理相声已经复制在肥胖小鼠模型并提供了证据表明,白介素1 (il - 1)通路和granzyme信号被激活(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba在肥胖老鼠的脂肪组织。在OA (il - 1也是一个关键的细胞因子gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),证实了功能基因组学在小鼠手术OA模型扰动的内侧半月板(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。因此,我们选择了il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba复制gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba脂肪组织的炎症启动ADSC接收的肥胖患者。gydF4y2Ba

最近的证据表明之前gydF4y2Ba在体外gydF4y2BaADSC的预处理是有效地调节他们的旁分泌活动。说,“而不是一个常数的混合物的分子因素,MSC检查参与组成分泌腺的是依赖于不同的刺激出现在MSC遇到的微环境。因此,作文检查参与组成分泌腺的msc可以调制期间msc预处理gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba文化”(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。的力量gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba预处理msc以前一直说的gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba)以及需要描述它如何影响他们的分泌。因此,梳理出的分子背景的双重潜在ADSC来源于精益或肥胖的脂肪组织,塞夫获得相同的ADSC用于(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba受到il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba曝光,模仿行为的基质细胞来自患者的脂肪组织大都会。了(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba),之前的数据报道指着il - 1的能力gydF4y2BaβgydF4y2Ba的msc预处理增加免疫调节分子和生长因子的释放,但很少有人研究解决检查参与组成分泌腺的塞组件的分析(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba对联合细胞)或其影响。gydF4y2Ba

因此本研究的目的是确定ADSC的影响“炎症”检查参与组成分泌腺影射关节细胞,尤其关注股票的影响在基因和蛋白质水平从OA关节软骨细胞和synoviocytes培养单一或培养。后者可能被认为是一个设置gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba模型建立的联合办公自动化在高密度培养的主要细胞,因此尊重软骨细胞和synoviocytes及其表型之间的串扰。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

获得的数据在这项工作比我们之前研究的结果调查抗炎/ anticatabolic塞夫从ADSC的影响保持在控制条件下对软骨细胞和synoviocytes暴露后的细胞il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。在本文中,我们进行了一个互补评价促炎/ procatabolic塞夫从ADSC暴露于il - 1的影响gydF4y2BaβgydF4y2Ba如下详细(sEVs_IL-1)软骨细胞和synoviocytes保存在控制条件。并行文化也暴露于塞从如果ADSC控制。塞夫和sEVs_IL-1源自相同的ADSC,软骨细胞/ synoviocyte文化是相同的,和描述的方法一定程度上再现了他们的措辞。基本信息登记OA患者产生软骨细胞,synoviocytes, ADSC,以及他们的微分预处理(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),在目前的手稿,是报告的补充材料。gydF4y2Ba

2.1。脂肪Tissue-Derived基质细胞gydF4y2Ba

ADSC分离得到三个捐助者(两人随着年龄的增长/ BMI: 35/26和70/28.41和一个女人,随着年龄的增长/ BMI 69/43.71),从残留的微裂缝从下腹部脂肪组织收集为了用于再生疗法的膝盖。这个组织是处理本质上如[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。ADSC从组织获得了闲散后再生医学治疗膝OA,因此注定要处理。这项研究是按照1975年赫尔辛基宣言。获得的样本从所有患者知情同意后,根据协议中详细说明研究“ADIPO_CELL”(Prot.gen.n。罗0009545,2017年10月3日)经伦理委员会批准一副骨科研究所的意大利博洛尼亚。gydF4y2Ba

脂肪组织样本用磷酸盐(PBS)。先后,ADSC被酶消化分离出0.05%的I型胶原酶(Sigma-Aldrich,圣路易斯,密苏里州)在37°C 100 1 h和过滤gydF4y2BaμgydF4y2Bam细胞过滤器(BD生物科学,贝德福德,妈,美国)。之后,细胞被洗gydF4y2BaαgydF4y2Bamem (Sigma-Aldrich)含有15%的边后卫,播种到培养瓶(gydF4y2Ba 细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在37°C)和孵化有限公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba大气中gydF4y2BaαgydF4y2Bamem的边后卫为15%。在融合,细胞被trypsin-EDTA分离治疗。细胞被播种在gydF4y2BaαgydF4y2Bamem包含exosome-depleted的边后卫的15% (Gibco,生活技术,大岛,纽约,美国),培养在37°C公司5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba,不断刺激il - 1的2 ng / mLgydF4y2BaβgydF4y2Ba(研发系统,明尼阿波利斯,美国),从通道2段4。il - 1的条件培养基(CM)gydF4y2BaβgydF4y2Ba对待ADSC文化因此收集从通道2通道4每三天,汇集,离心机,并存储在无菌条件−80°C到使用。评估发生的il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba全身的细胞衰老,ADSC的控制或il - 1的一个病人gydF4y2BaβgydF4y2Ba刺激条件从通道2段4致力于衰老检测。最后,细胞被胰蛋白酶恢复。一些细胞是p21的专用免疫印迹分析。其他一些细胞被固定为4% PFA, cytospun工具包和彩色衰老细胞组织化学染色(美国σ)正如前面详细(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。其他一些细胞专门分析细胞大小的流式细胞术评估向前散射。其他一些细胞被放置在室幻灯片和用于评估形态变化后的细胞形状和核il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba曝光。gydF4y2Ba

2.2。sEVs_IL-1隔离gydF4y2Ba

纯化sEVs_IL-1得到三厘米的使用协议,它结合了不同的ADSC文化沉淀/离心并且按照制造商的指示尺寸排阻色谱法(Exo-spin、细胞制导系统)来改善复苏和特异性(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。简单地说,CMs在300×旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C为10分钟,然后获得的上层清液为16000×gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟在4°C去除细胞和细胞碎片。之后,上层清液被孵化一夜之间在4°C Exo-spin缓冲区(细胞制导系统)。离心后16000×gydF4y2BaggydF4y2Ba1小时在4°C, sEVs_IL-1包含颗粒在PBS resuspended,应用到一个Exo-spin列的顶部,离心机在50×60秒gydF4y2BaggydF4y2Ba。这时,一个200gydF4y2BaμgydF4y2Bal PBS体积和进一步离心50×60秒gydF4y2BaggydF4y2Ba被用来洗提的sEVs_IL-1直到使用存储在-80°C。gydF4y2Ba

2.3。sEVs_IL-1量化和表面抗原决定基鉴定gydF4y2Ba

sEVs_IL-1孤立从CM量化使用NanoOrange蛋白量化工具(技术)。短暂,sEVs_IL-1稀释1:100 1 x NanoOrange工作方案和孵化10分钟90°C。样本然后冷却至少20分钟,荧光是阅读470 ex - 570 em纳米波长,用光谱马克斯双子座板荧光计(分子器件、桑尼维尔CA)。描述sEVs_IL-1表面抗原表位,5gydF4y2BaμgydF4y2Ba分析了g (sEVs_IL-1使用MACSPlex外来体工具包(Miltenyi研究),允许检测37表面标记和两个同形像控制。sEVs_IL-1孵化了MACSPlex外来体捕捉珠子和MACSPlex外来体检测试剂CD9、CD63,研究1小时在室温下(RT)。然后,1毫升MACSPlex缓冲区被添加到每个sEVs_IL-1包含管和左15分钟在沿sEVs_IL-1绑定到捕捉珠子被离心法洗5分钟3000×gydF4y2BaggydF4y2Ba然后在150年resuspendedgydF4y2BaμgydF4y2BaL MACSPlex缓冲区。样本用流式细胞仪分析第二章(BD生物科学)。表面标记计算减去每个珠子的平均信号强度的控制样本各自的信号强度与sEVs_IL-1珠子孵化。gydF4y2Ba

2.4。软骨细胞和Synoviocyte隔离gydF4y2Ba

软骨细胞(来自1人随着年龄的增长/ BMI: 58/24.34和2个女人,随着年龄的增长/ BMI: 75/24.17和60/25.64)和synoviocytes(来自2人,随着年龄的增长/ BMI: 69/32.88和69/29.07)被孤立于OA膝盖关节置换手术的患者。这项研究是按照1975年赫尔辛基宣言。获得的样本从所有患者知情同意后,根据协议中详细说明研究“ADIPO_CELL”(prot.gen.n。罗0009545,2017年10月3日)经伦理委员会批准一副骨科研究所的意大利博洛尼亚。gydF4y2Ba

短暂,软骨及滑膜组织洗两次与PBS和碎成小块。软骨细胞是来自三个病人和孤立的顺序酶消解时:1 h和链霉蛋白酶(σ)和1 - 2 h 0.2%胶原酶(σ)37°C。在100年分离软骨细胞被过滤gydF4y2BaμgydF4y2Ba米和70gydF4y2BaμgydF4y2Ba米尼龙网、洗、离心机。细胞被播种在gydF4y2Ba 细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在T150烧瓶和传统单作条件下培养的DMEM(σ)FCS为10%。软骨细胞是冻结在通道0,confluency收集。Synoviocytes滑膜的孤立的两个病人。组织是碎成小块,在DMEM培养(σ)与10% FCS允许细胞释放了两个星期。Synoviocytes从每个病人都冻结在通道0。当计划数量的样本收集、存储软骨细胞和synoviocytes解冻和播种gydF4y2Ba 细胞/厘米gydF4y2Ba^2gydF4y2Ba在T150烧瓶内。一旦足够的细胞(软骨细胞或synoviocytes)可用,他们汇集和用于实验如下所述。软骨细胞和synoviocytes在章节2和3,分别。gydF4y2Ba

2.5。单一和共培养实验gydF4y2Ba

三个不同的纯化sEVs_IL-1制剂的影响进行评估合并软骨细胞和汇集synoviocytes单一或培养。事实上,后者代表了一种文化模型,再现了gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba之间的串扰和积极的旁分泌反馈循环联合细胞。gydF4y2Ba

单一栽培实验,软骨细胞和synoviocytes解冻和播种24-well在高密度板(gydF4y2Ba 和gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba)3天的DMEM FCS(σ)为10%。后来,介质代替新鲜FBS-DMEM包含10 10%gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升sEVs_IL-1(或股票,控制)或没有签订(CTR)组。培养被播种设置gydF4y2Ba 软骨细胞在下议院24-well板gydF4y2Ba synoviocytes transwell (0.4gydF4y2BaμgydF4y2Ba孔隙大小,康宁,托莱多,哦)。这些文化起初分开设置,坚持和重建细胞外基质的3天DMEM FCS(σ)为10%。第二天,共培养后,介质代替了新鲜DMEM包含10 + 10%的边后卫gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升sEVs_IL-1(或股票,控制)或没有签订。所有的评估都在4和15小时后添加sEVs_IL-1(或签订的控制)。gydF4y2Ba

2.6。实时聚合酶链反应gydF4y2Ba

细胞从单一栽培和培养放在CTR或sEVs_IL-1(或股票,控制)条件分析了实时rt - pcr在4和15个小时研究il - 1的表达gydF4y2BaβgydF4y2Ba、il - 6、引发MCP-1, TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba金属蛋白酶- 1,il - 10 MMP-10 ADAMTS-4, ADAMTS-5, MMP-13, cox - 2,进气阀打开,VEGF(表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。总RNA分离使用试剂盒试剂(英杰公司)按照制造商的推荐方案gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。已经没有dna样本然后DNase对待我(细胞设备;Ambion,生活技术)和RNA量化使用Nanodrop分光光度计(EuroClone波斯公司)。RNA (200 ng)反向转录使用上标很互补脱氧核糖核酸合成装备(表达载体),根据制造商的协议。实时PCR是运行在一个LightCycler仪器(罗氏分子生化药剂,印第安纳波利斯)使用SYBR预混料Taq交货(豆类、Clontech实验室、山景,CA)使用以下协议:最初在95°C激活了10分钟,放大了45周期在95°C 5秒和60°C,持续20秒。mRNA水平计算为每个目标基因和规范化使用引用GAPDH基因按照公式2gydF4y2Ba^{- - - - - -gydF4y2BaΔgydF4y2BaCtgydF4y2Ba}(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba),表示为一个百分比的参考基因。检查基因转录的可靠性数据,我们进行了稳定性试验,通过比较阈值周期的GAPDH cDNA样本。gydF4y2Ba

2.7。分泌因素的量化gydF4y2Ba

单一栽培的上层清液收集和培养4和15个小时是离心机消除细胞碎片和微粒和储存在-80°C到使用。先后,释放il - 1的样品进行评估gydF4y2BaβgydF4y2BaIL-1ra - 2, il - 4、il - 6引发,IL-9, il - 10、il - 12, IL-13, IL-15,基本FGF, eotaxin, g - csf, gm - csf,干扰素gydF4y2BaγgydF4y2Ba,MCP-1 IP-10 MIP-1gydF4y2BaαgydF4y2Ba,MIP-1gydF4y2BaβgydF4y2Ba咆哮,TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba,并使用Bio-Plex VEGF蛋白阵列系统(Bio-Rad实验室、大力神、CA和密理博公司,Billerica, MA)遵循制造商的指示。校准曲线的质量控制标准进行,因此只有70%至130%的预期值水平被认为是精确和。gydF4y2Ba

2.8。p65免疫荧光和成像gydF4y2Ba

软骨细胞和synoviocytes播种在8井室幻灯片的密度gydF4y2Ba 细胞在DMEM 3天FCS(σ)为10%。之后,在一半的井中被移除和替换用新鲜DMEM + 10%的边后卫(CTR)和在另一半介质包含10gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL sEVs_IL-1和培养4和15个小时。在每个实验时间点(4 h和15 h),这些细胞被固定为4% PFA,治疗抗原暴露解决方案0.02 U /毫升chondroitinase ABC的50 mM TRIS-HCl pH值8(软骨细胞)或解决方案的0.1% triton - x - 100 / PBS (synoviocytes)和屏蔽4%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma-Aldrich) 0.1% triton - x - 100 / TBS(稀释缓冲区,用于中小学抗体稀释),以避免非特定的绑定。先后,细胞被孵化15gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升的兔子反p65 (AbCAM AB7970,兔多克隆抗体,5gydF4y2BaμgydF4y2Ba为4 h RT g / ml),其次是孵化15gydF4y2BaμgydF4y2Ba555克/毫升的驴anti-rabbit免疫球蛋白Alexa萤石(Thermofisher科学)。细胞核被贴上DAPI(σ)的解决方案。幻灯片是安装不变色试剂和尼康A1-R共焦激光扫描显微镜下检查。gydF4y2Ba

共焦分析使用尼康A1共焦激光扫描显微镜,配备了100×1.49 NA物镜和405和561 nm激光线。Z-stacks收集在80 nm /像素光学分辨率,储存在12位4096灰色水平不同,针孔直径设置为1的单位,和z-step大小200海里。共焦图像处理使用Richardson-Lucy反褶积算法通过使用NIS-Elements高级研究软件(尼康、东京、日本)。大面积的观察样本,5代表细胞为每个所描述的条件进行了分析和处理。gydF4y2Ba

Colocalization分析评估通过比较等效像素位置的蓝色和红色荧光团的信号在每个获得的图像(光学部分)。二维散点图图的每个像素配对图像生成和阈值水平的信号被包括在分析选择。像素强度值大于50%灰色水平(等级从0到4096)被选为信号,和colocalization二进制地图显示区域包含高度与信号成像,合并(白色)(蓝色和红色信号gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。荧光染料的colocalization量化使用皮尔逊colocalization系数(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba来自15分析光学部分,表示为gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

2.9。免疫印迹分析NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活gydF4y2Ba

NF -的调优gydF4y2BaκgydF4y2BaB信号进一步研究通过免疫印迹分析软骨细胞(100000)和synoviocytes(60000)镀在CTR 24-well板块和sEVs_IL-1条件自交付4和15个小时。集合的时候,中被移除,细胞恢复刮刀使用小体积的冷PBS的磷酸酯酶和蛋白酶抑制剂。然后,这些细胞被轻轻地离心机和细胞溶解20gydF4y2BaμgydF4y2Bal•瑞帕的缓冲区。样品随后被加载,运行在丙烯酰胺凝胶,转移到PVDF膜之前详细(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

与第二抗体,免疫印迹进行Phospho-NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB p65 (Ser536)(兔单克隆抗体克隆93 h1,使用1:1000年,细胞信号技术# 3033)gydF4y2BaβgydF4y2Ba肌动蛋白(鼠标单克隆、克隆ac - 74为0.8gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mlσ# A2228)作为加载控制。适当anti-species合共轭二次抗体来自杰克逊实验室。gydF4y2Ba

2.10。统计分析gydF4y2Ba

之前测试的正常数据分布进行了使用Kolgomorov斯米尔诺夫(钴)测试。然而,由于正常测试小功率检测样本是否来自一个高斯人口时,样本很小,增加样本的大小,钴测试数据相结合进行类似的条件(例如,一个给定的基因的表达在一个给定的条件和在给定的时间点,积累的数据在单作和培养)。gydF4y2Ba

数据被表示为平均值和标准偏差(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba和分析并使用GraphPad Prism 5.0软件画(图垫软件,拉霍亚,CA,美国)。两组之间的比较(比较塞表面抗原决定基特征之间签订和sEVs_ il - 1)是由学生的意思gydF4y2BatgydF4y2Ba以及对配对样本。比较在多个组(CTR、股票或sEVs_IL-1治疗细胞4和15个小时)进行了方差分析,其次是图基的事后考验。的差异被认为是重要的和证明gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba ;gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。sEVs_IL-1量化和描述gydF4y2Ba

在隔离过程从il - 1结束gydF4y2BaβgydF4y2Ba对待ADSC-CM(50毫升),200gydF4y2BaμgydF4y2Bal纯化sEVs_IL-1体积。测定蛋白浓度(gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba )gydF4y2Ba与NanoOrange评估gydF4y2Ba μgydF4y2Bag / mL /样品。gydF4y2Ba

影城bead-based化验加上流仪分析证实,sEVs_IL-1样本阳性的具体签订标记:CD63,多泡体tetraspanin积累,和CD9 /本地化主要在质膜上的研究,即使有不同的强度(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba、报告的整个表面表征sEVs_IL-1细节的表面标记和同形像)。gydF4y2Ba

自从ADSC用于获得sEVs_IL-1 (il - 1刺激ADSC)和塞(从控制ADSC)是相同的,表面表征数据比较与那些在(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。图gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba并排显示tetraspanins表面特征的比较,主要股票标记。CD63表达的tetraspanin在股票和sEVs_IL-1的最高水平gydF4y2BaβgydF4y2Ba(CD63表达了约10倍的水平CD9和两个研究的水平)。这些发现符合什么报道(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

塞之间的比较和sEVs_IL-1产生了只有少数显著差异(CD24和CD14,第一个sEVs_IL-1高,第二个低sEVs_IL-1)但微分表达式(图的一些趋势gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。此外,sEVs_IL-1表现出强烈的积极性为间充质基质标记CD29、CD44、和CD105和阶段特异性胚胎抗原- 4 (SSEA-4)通常细胞多能性,如图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba。gydF4y2Ba

39的标记分析,除了上面提到的两个,5显示一个微分(尽管不是统计学意义)抗原决定基荧光强度,整合sEVs_IL-1之间的更改和塞:SSEA4, CD49e, CD146, CD44表达水平高于sEVs_IL-1而签订。相反,CD9、CD105和CD14表达的更签订关于sEVs_IL-1(图gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。值得注意的是,表面蛋白的荧光强度的比较使用累计执行数据(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba证实,CD44强度明显高于(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba相比其他蛋白质但CD29和CD63(补充图gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。这些信息是有价值的考虑CD44在签订绑定的角色pericellular透明质酸,进一步内化(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。进一步描述签订的电子显微镜和nanotracker分析之前已经报道过了gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

3.2。sEVs_IL-1在软骨细胞和Synoviocytes对基因表达的影响gydF4y2Ba

如补充图所示gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,GAPDH被证明是一个可靠的参考基因,因为它显示一个伟大的稳定性(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)中所使用的实验条件,在前面研究[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

评估如果sEVs_IL-1能够上调分解代谢和炎症基因的表达在软骨细胞和synoviocytes保存在控制条件下,多个基因的表达参与OA病理生理学评估,包括炎性细胞因子/趋化因子(il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba、il - 6、引发MCP-1, TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba和il - 10),分解酶(金属蛋白酶- 1、-10、-13、ADAMTS-4和5),和分子与angiogenetic / cox - 2这样的痛苦过程,进气阀打开,VEGF。结果如图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba:主要基因在软骨细胞参与炎症在单作和培养;图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba:矩阵重构的主要基因在软骨细胞在单作和培养;图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba:主要基因参与炎症synoviocytes单作和培养;和图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba:矩阵重构的主要基因synoviocytes单作和培养)主要的手稿和补充材料(补充数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

清晰的概述的微分效应在两个细胞类型被认为是单一和共培养,相同的规模gydF4y2BaygydF4y2Ba设在每个基因。此外,在每一个比较4和15个小时,得到的值如果塞(从控制ADSC)显示,sEVs_IL-1梳理出具体的影响。如数据所示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,在大多数情况下,CTR和股票的区别(从控制ADSC)并不重要,或者在一个统计差异sEVs_IL-1诱导基因转录要明显高于股票为见,例如,在MCP-1 4 h,软骨细胞VEGF(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),或MMP-13(图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

一般来说,相比于CTR, sEVs_IL-1诱导不同的基因表达,严格相关实验时间点。在软骨细胞,sEVs_IL-1显著增加一些细胞因子/趋化因子基因的表达(il - 6、引发和MCP-1;图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba),分解酶(金属蛋白酶- 1、-10、-13、ADAMTS-4;图gydF4y2Ba3gydF4y2Ba),angiogenetic /痛苦因素(cox - 2和VEGF;图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)关于CTR 4 h。这种效应在之后的时间点在某种程度上是减毒(15小时)当这些基因的水平(il - 6、引发MCP-1, cox - 2和VEGF,金属蛋白酶- 1,-13,和ADAMTS-4)相比显著减少4小时,表明短期sEVs_IL-1相当的影响和/或减少水平15小时可以符合已知的成绩单不稳定炎性分子港不稳定元素,在广泛回顾(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

Synoviocytes表现出类似的趋势:在4 h, sEVs_IL-1诱导的存在高表达的细胞因子/趋化因子,细胞外基质降解酶,疼痛和炎症/基因(白介素8 MCP-1, il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba,-13岁的金属蛋白酶- 1 ADAMTS-4、cox - 2和VEGF,),相对于CTR数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。与软骨细胞一样,与控制细胞相比,15小时,sEVs_IL-1没有进一步增加这些基因的表达(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

此外,sEVs_IL-1除了对软骨细胞的影响和synoviocytes生长在共培养,文化能够模拟关节的环境条件,进行了评估。在软骨细胞,sEVs_IL-1引发的表达明显增加,MCP-1, cox - 2, il - 10,进气阀打开,金属蛋白酶- 1,-13年、-10年和ADAMTS-4相比在4 h (CTR数据gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。这些影响也在短期内,因为4 h时间点相比,在15 h,引发的水平,MCP-1, VEGF, MMP-13, ADAMTS-4,伊诺和cox - 2明显减少了。gydF4y2Ba

Synoviocytes培养显示类似的趋势(数据gydF4y2Ba4gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba5gydF4y2Ba和补充图gydF4y2Ba5gydF4y2Ba):在4 h,更高的il - 6的表达,引发,MCP-1, il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba,-13岁的金属蛋白酶- 1 ADAMTS-4, cox - 2相比sEVs_IL-1 CTR的注意。15岁4 h水平相比,h最明显的mRNA表达下调(il - 6、引发MCP-1, TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba,il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba金属蛋白酶- 1,-13,ADAMTS-4, cox - 2)。有趣的是,相对于CTR,甚至在培养synoviocytes, sEVs_IL-1gydF4y2BaβgydF4y2Ba能够显著上调表达的相同的基因属于炎症和异化的家庭。在单作和共培养,总的来说,软骨细胞表现类似于synoviocytes炎症家族的基因。关于异化的的基因家族,软骨细胞出现更积极的关于金属蛋白酶- 1,13日和10日ADAMTS4显示类似的趋势在软骨细胞和synoviocytes,更高层次的表达在后一种细胞类型。gydF4y2Ba

3.3。sEVs_IL-1对分泌的影响因素gydF4y2Ba

验证sEVs_IL-1复制一个OA-like环境的能力,27丛的蛋白质释放的细胞因子/趋化因子调查小组Bioplex技术。上层清液从单一栽培和培养进行了评估。与基因表达数据,我们提供了在从软骨细胞释放的结果,synoviocytes,和培养,相同的规模gydF4y2BaygydF4y2Ba设在,为了比较差(人物活动和影响gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba7gydF4y2Ba代表对不同子集的可溶性的影响因素:主要的细胞因子和趋化因子,图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和细胞因子的在另一个子集包括生长因子、人物gydF4y2Ba7gydF4y2Ba和补充数据gydF4y2Ba6gydF4y2Ba和gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。此外,在每一个比较4和15个小时,得到的值如果股票显示,sEVs_IL-1梳理出具体的影响。gydF4y2Ba

在单一栽培,sEVs_IL-1gydF4y2BaβgydF4y2Ba证实了他们的微分效应取决于实验的时间安排。软骨细胞在4 h, IL-1ra水平,引发,和gm - csf明显高于sEVs_IL-1 CTR,而VEGF表达下调sEVs_IL-1 CTR相比。15小时相反,sEVs_IL-1诱导il - 1的更高版本gydF4y2BaβgydF4y2Ba,il - 6,引发(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),咆哮和IP-10(补充图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba),g - csf和gm - csf(补充图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba),关于CTR,而VEGF表达下调了sEVs_IL-1 CTR相比(图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

在synoviocytes sEVs_IL-1诱导il - 1的显著提高产量gydF4y2BaβgydF4y2BaIL-1ra, TNF -gydF4y2BaαgydF4y2Ba、白介素、干扰素-gydF4y2BaγgydF4y2Ba、引发和MCP-1(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)以及IL-9和bFGF(补充图gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)4和15 h。MIP-1gydF4y2BaαgydF4y2Ba、咆哮、eotaxin IP-10(补充图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)和gm - csf相比明显高于控制只在15 h。MIP-1gydF4y2BaβgydF4y2BasEVs_IL-1组明显高于只在4 h(补充图吗gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

上层清液的分析来自于培养整体表示更渗透synoviocytes释放的影响,因为在大多数情况下,释放的程度在不同条件下的平行synoviocytes单一文化的培养。sEVs_IL-1曝光后,观测到了明显增加释放il - 1 4和15 hgydF4y2BaβgydF4y2Ba肿瘤坏死因子-gydF4y2BaαgydF4y2Ba干扰素-gydF4y2BaγgydF4y2Ba、引发和MCP-1(图gydF4y2Ba6gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.4。sEVs_IL-1影响p65gydF4y2Ba

探索sEVs_IL-1可以激活NF -的程度gydF4y2BaκgydF4y2BaB信号通路,RelA的易位(p65)细胞质细胞核是调查在两种细胞类型。的分析colocalization p65(红色)的DNA(蓝色)信号,暗示p65绑定到染色质因此NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB-dependent转录,指着NF -强得多gydF4y2BaκgydF4y2BaB在synoviocytes激活。在软骨细胞,细胞质的积累是一个普遍p65 CTR和sEVs_IL-1集团部分p65定位在细胞核仅在15 h(图gydF4y2Ba8(一个)gydF4y2Ba)。相反,在synoviocytes p65是普遍地本地化sEVs_IL-1治疗的细胞核,DNA紧密相关。这已经明显在4小时和15小时几乎翻了一番。gydF4y2Ba

免疫印迹分析平行样品确认增加更明显的磷酸化p65 4和15个小时post-sEVs_IL-1治疗相比,synoviocytes软骨细胞(图gydF4y2Ba8 (b)gydF4y2Ba)。这些发现,随着总体实验设计,研究的主要结果,和潜在的分子机制,如图所示gydF4y2Ba9gydF4y2Ba。集体,手稿中给出的数据表明sEVs_IL-1能够转移联合细胞炎症刺激。这也证实了一个类似水平的主要炎症基因的表达,如引发和il - 6在软骨细胞和synoviocytes,要么在il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba刺激或接触后sEVs_IL-1(补充图gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。ADSC的炎症状态后长时间暴露于il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba也符合触发细胞衰老(补充图吗gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

本研究的主要发现结合[中描述的那些gydF4y2Ba5gydF4y2Ba检查参与组成分泌腺)点的双重潜在ADSC,炎症可显著影响的环境。gydF4y2Ba

主细胞(ADSC,软骨细胞和synoviocytes)用于(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),在目前的手稿是相同的,但暴露于微分预处理。因此,结合两个手稿的发现,我们可以强调事实上ADSC-derived签订有双重的潜力,因为塞夫从控制ADSC(股票)能够减少炎症/分解环境联合细胞之前接受il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba从il - 1,相反的股票gydF4y2BaβgydF4y2Ba影射ADSC (sEVs_IL-1)能够诱导炎症如果细胞。数据支持这种“双重潜力”来源于实验设置相同的ADSC微分gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba预处理。在本文中,这预处理由il - 1来表示gydF4y2BaβgydF4y2Ba曝光,模仿行为的基质细胞来自患者脂肪组织的大都会。gydF4y2Ba

读出代表是一个广泛的分析效果的RNA和蛋白质水平对软骨细胞的主要文化和synoviocytes单一或培养。事实上,NF - sEVs_IL-1能够转移gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活软骨细胞和synoviocytes,显著提高主要炎症趋化因子和细胞因子的转录和发布,以及软骨分解代谢的主要酶的转录。sEVs_IL-1的这个活动是特殊的,因为控制签订了在大多数情况下不重要的比控制条件不同的影响。这是主要的临床意义,因为大多数OA患者超重甚至肥胖。gydF4y2Ba

脂肪组织炎症变化与肥胖及其在系统层面的影响长期以来公认的。在大都会窟具有内分泌作用:M1 ADSC和巨噬细胞释放炎性细胞因子,趋化因子,发病gydF4y2Ba8gydF4y2Ba];脂肪细胞和ADSCgydF4y2Ba37gydF4y2Ba)发布循环米尔特异表达(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。在他们的假定的目标,有蛋白质在代谢条件可能负担得起保护或氧化应激包括AMPK, PPARgydF4y2BaγgydF4y2Ba,PKCgydF4y2BaεgydF4y2Ba(gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。他们的功能障碍可能因此导致增加DNA损伤和衰老ADSC,绕过他们具备干细胞(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),和post-mitotic组织(即。,cartilage) disrupting the existing cellular homeostasis [39gydF4y2Ba,gydF4y2Ba40gydF4y2Ba]。这项研究也突显出这些影响翻译在不必要的负面影响sEVs_IL-1 (ADSC签订“炎症”检查参与组成分泌腺影射)被应用于细胞的两个主要关节组织受到OA:软骨细胞和synoviocytes。gydF4y2Ba

synoviocyte的健壮性反应是特别感兴趣的:接触sEVs_IL-1后,明显的证据提示NF -gydF4y2BaκgydF4y2Ba激活这些细胞被成像可观,很大程度上超过了软骨细胞。这是符合不同sEVs_IL-1吸收动力学的两种不同的细胞类型(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),反映出一个整体更渗透感应synoviocytes inflammatory-catabolic标记,特别是在分泌分子的水平:主要的促炎细胞因子和趋化因子。gydF4y2Ba

塞夫吸收的主要机制是签订的绑定CD44的pericellular透明质酸(HA),尤其丰富synoviocytes [gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)与透明质酸合成酶本地化细胞表面或绑定到plasmalemmal CD44。透明质酸也软骨细胞表面高表达(pericellular矩阵,PCM)的领土间的矩阵(ICM)。然而,在软骨细胞,CD44-bound HA也为PCM的组织服务,即为锚定aggrecan形成所谓pericellular glycocalyx,这之间的交互塞CD44和表面HA在软骨细胞是在某种程度上阻碍了gydF4y2Ba41gydF4y2Ba,塞夫吸收延迟synoviocytes[相比gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。此外,sEVs_IL-1的表面特征的比较与报告(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]表明更高的(尽管不是统计学意义不同)的表达CD44这也是sEVs_IL-1最高的表面分子的表达情况,从而支持后者的最高活动synoviocytes软骨细胞。gydF4y2Ba

在基因转录水平,尤其是在强烈sEVs_IL-1-dependent增强明显短时间曝光(4小时),在15 h,在大多数情况下,降低基因表达观察相比,4 h,可能由于不稳定因素的存在炎症分子的成绩单(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。另一方面,保持强烈的释放,大部分因素增加15 h。这是预期的,因为细胞继续分泌因素添加水平在更早的时间点。一些因素显示延迟释放,比如IP-10在软骨细胞几乎探测不到4 h在发现高浓度15 h。可以证明持续释放的影响,特别是对synoviocytes (il - 1gydF4y2BaβgydF4y2BaIL-1ra,肿瘤坏死因子gydF4y2BaαgydF4y2Ba、il - 6、gm - csf干扰素-gydF4y2BaγgydF4y2Ba,MIP-1gydF4y2BaαgydF4y2Ba咆哮,IP-10和eotaxin)。gydF4y2Ba

主要OA软骨降解酶的基因表达也显著增加了sEVs_IL-1单作和培养软骨细胞:aggrecanase ADAMTS-4,关节炎症生物标记和积液(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),第一行酶在OA发病机制,负责aggrecan切除和暴露的胶原蛋白2的活动主要胶原酶:金属蛋白酶- 1特别是MMP-13,关键酶在推动软骨细胞肥大和终端分化(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba]。胶原酶需要proteolytical激活可能发生的由于MMP-10[的活动gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]在软骨细胞暴露于sEVs_IL-1也增加了。的表达主要胶原酶(金属蛋白酶- 1和MMP-13)和ADAMTS-4显著诱导单作synoviocytes,虽然金属蛋白酶- 1的表达,-13年,和ADAMTS-4也显著增加培养synoviocytes,确认在这个文化模型,自分泌和旁分泌循环可能进一步加强异化的环境。特别感兴趣的是强大的感应ADAMTS-4通常依赖于炎症刺激(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba),不像ADAMTS-5。gydF4y2Ba

随着影响释放已知的炎症和异化的因素,值得注意的活动也观察到的细胞因子在一组之前报道对OA细胞具有保护作用。经典,chondroprotective细胞因子il - 4、il - 10和IL-13gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]。其中,只有il - 4和il - 10在上层清液检测,而IL-13低于检出限。控制股票相比,il - 10释放显著下调sEVs_IL-1在早期的时间点,在软骨细胞和培养。有趣的是,类似的趋势观察il - 12和VEGF在共培养。VEGF释放尤其显著下调sEVs_IL-1相比在软骨细胞和synoviocytes控制条件。VEGF与营运有关的病理后果恶化neoangiogenesis软骨及滑膜。然而,VEGF信号是非常重要的保持健康的窟,防止其扩张,褐色脂肪组织的美白,减少能源消耗(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),最终防止大都会的恶化。有趣的是,这些细胞因子的动态趋势相反相比所示(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba相反),进一步确认机制是由塞来自ADSC暴露或il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba。gydF4y2Ba

鉴于潜在的股票,主要的努力应该致力于发展技术,评估和工程进行的类型信息,最终在扩大生产这些“纳米药物”利用生物反应器来确保再现性甚至探索潜在的同种异体或异种的生产(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba]。的确,目前的证据显示的要求仔细描述ADSC之前检查参与组成分泌腺在收集用于治疗目的。事实上,流通股票从患者大都会在脂多糖丰富,可能会触发toll样受体4 (TLR4) [gydF4y2Ba49gydF4y2Ba在内皮细胞,从而提高胞质和线粒体氧化应激。TLR4在软骨也丰富,因此类似的机制可能赞成开车大都会OA (gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。从肥胖受试者获得MSC的功能失调和塞也被证实在肥胖的老鼠gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]在ADSC显示增加水平的衰老和较低的扩散。特别是,il - 1通路的激活已被证实通过蛋白质组和转录组评估ADSC的老鼠接受高脂肪饮食,这进一步证实本研究可能模仿ADSC来自肥胖病人的状况。在猪的研究也获得了类似的结果之间的比较进行ADSC源自瘦猪或猪喂食高脂肪的饮食。肥胖动物的ADSC显示增加衰老和NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB激活(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。此外,miRnome和转录组分析的ADSC精益和肥胖的猪证实蛋白质参与转录的差异集中,线粒体和炎症(gydF4y2Ba53gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

本研究提出了一些限制。首先,样本容量是有限的,但充分披露重大影响。第二,股票仍在定义的问题,和囊泡的子集,我们纯化跨度大小范围(30 - 202海里,60%泡大小50 - 100纳米(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]),各种不同的囊泡可以co-purify:液,exomeres,微泡,外皮层,或微粒子gydF4y2Ba54gydF4y2Ba]。第三,尽管明确的影响,一个彻底的分子机制的理解(塞信使rna介导转移,microrna的,或其他短rna活跃在转录后的调控),NF -gydF4y2BaκgydF4y2BaB调优发生仍在等待。gydF4y2Ba

然而,研究结果还可以指出脂肪组织的双重性质,根据其炎症状态。虽然初步的临床研究结果显示承诺向良好的临床疗效,脂肪得到治疗的潜在可能负面影响与大都会炎性变化。这个权证向更好的描述最合适的脂肪更多的关注产品和识别患者概要文件可能更有可能受益于这种生物的方法来解决OA。这意味着之前用于再生医学的进一步努力可能会专门描述ADSC衰老的程度(如前所述gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba]。衰老这一“指纹”的ADSC将允许选择ADSC具有真正的稳态特性,避免使用衰老细胞,可能会恶化OA (gydF4y2Ba57gydF4y2Ba]。此外,鉴于基于股票的游离自然疗法,这可能有助于bioreactor-based扩大生产,因此即使预想同种异体的策略。与此同时,的力量gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba预处理可以充分利用救援/增强防护/自我平衡的自然释放的ADSC塞通过使用senotherapeutic (senolytic / senomorphic)分子(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

这些研究结果值得谨慎使用前检查参与组成分泌腺ADSC的收集和OA治疗。仔细评估这些细胞的炎症的承诺应该进行,以避免恶化通过转让NF - OAgydF4y2BaκgydF4y2BaB联合细胞活化。与此同时,当前状态的艺术表明ADSC的免疫调节活动检查参与组成分泌腺及其可能获救gydF4y2Ba体外。gydF4y2Ba因此,一个有前途的观点是专注于技术,获得大的和定性的锻炼可再生的数量的股票从批次的同种异体或异种的ADSC通过细化,跨度从几个增强策略gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba表观遗传操纵文化模型,对更有效的治疗OA的发展。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

这项研究报告的数据是可用的合理请求从相应的作者。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益冲突有关的出版。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

罗莎玛丽亚Borzi和朱塞佩•变动造成了同样的工作。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这部分工作由卫生部、意大利(fondi五千分率redditi IRCCS 2018年,史Ortopedico黎卓利出版社)。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

S1:表面抗原决定基表征小细胞外囊泡之间的表达水平和比较不同的标记。S2: il - 1gydF4y2BaβgydF4y2Ba暴露诱导细胞衰老ADSC不同标记就是明证。S3: GAPDH稳定性试验的实验设置中描述(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),在目前的手稿。S4: sEVs_IL-1对软骨细胞中基因表达的影响。S5: sEVs_IL-1 synoviocytes对基因表达的影响。S6: sEVs_IL-1影响趋化因子的释放。S7: sEVs_IL-1影响细胞因子的释放。S8:在结果在基因表达层面获得相同的细胞在不同的预处理ADSC和联合细胞(软骨细胞或synoviocytes)。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba

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