文摘

目前的研究表明,长期高脂肪饮食摄入量可以导致成人骨质疏松;但是,高脂肪饮食的机制影响骨质疏松症的发展个人还不清楚。高脂肪饮食同ferroptosis紧密相关,是否ferroptosis介导脂食源性骨质流失是当前研究的重点。除以小鼠高脂饮食组,高脂肪饮食+ ferroptosis抑制剂组和正常的食物组,给予高脂肪组小鼠高脂饮食为12周。高脂肪食物的老鼠+ ferroptosis抑制剂组有1毫克/公斤Fer-1每天腹腔内的高脂肪的饮食。显微CT扫描、组织学检查和生化指标ferroptosis进行骨组织从所有三组结束时的造型。Mc3t3-E1细胞体外也被分为三组:高脂肪的媒介集团,脂肪中+ ferroptosis抑制剂组和对照组。在脂肪中孵化24小时后,Mc3t3-E1细胞化验ferroptosis标记蛋白质和生化参数,和骨诱导同时进行。细胞碱性磷酸酶osteogenesis-related蛋白质测定的内容和表达成骨诱导的第七天。结果表明,高脂饮食导致小鼠股骨骨质流失的发展,这一过程可能会被ferroptosis抑制剂所抑制。 The high-fat diet mainly affected the number of osteoblasts produced in the bone marrow cavity. The high-fat environment in vitro inhibited osteoblast proliferation and osteogenic differentiation, and significant changes in ferroptosis-related biochemical parameters were observed. These findings have implications for the future clinical treatment of bone loss caused by high-fat diets.

1。介绍

超重和肥胖不仅是心血管疾病的重要危险因素,高血压和其他心血管疾病(1,2),但也有负面影响通过各种机制等影响骨形成和骨骨髓微环境(3]。引起的脂质代谢异常的疾病和骨质疏松症的发展目前收到研究人员越来越多的关注,他们发现hyperlipidaemia能体验患者骨质疏松和骨质疏松症(4,5]。同时,骨质疏松症患者骨密度,减少也异常脂质代谢及血管钙化(6),这表明骨质疏松和脂质代谢可能是因果关系。骨质疏松症是一种全身性骨骼疾病,其特征是减少骨密度和骨强度,从而增加骨折的风险由于骨骼脆弱性的增加(7]。骨质疏松症的发病机制主要是由于中断之间的平衡的骨吸收和骨形成,导致骨代谢的紊乱,与降低成骨细胞的数量和功能(8,9]。骨重建的过程是基于一个动态平衡的两个主要机制osteoclast-associated骨吸收和osteoblast-associated骨形成8]。和成骨细胞细胞死亡是一个重要的致病机制在骨质疏松症9]。细胞死亡是由多种机制引起的。细胞死亡的方式包括自噬,pyroptosis衰老,ferroptosis [10- - - - - -12]。骨质疏松症是目前研究在细胞衰老13),细胞自噬(14],和细胞pyroptosis [15少),但在细胞ferroptosis学习。铁过载已经在文献中报道引起骨质疏松症(16,17]。因此,控制ferroptosis可以有效预防骨质疏松症或促进成骨细胞成骨的能力。因此我们我们实验的重点转向研究骨质流失的现象引发了ferroptosis造骨细胞。Ferroptosis迪克森等人于2012年第一次被提出(18),本质上是脂质过氧化作用的结果,细胞内活性氧积累由于过度损害细胞的抗氧化系统,进而导致ferroptosis [19]。ferroptosis,抑制谷胱甘肽过氧化物酶4影响半胱氨酸和胱氨酸/谷氨酸转运体蛋白质的新陈代谢,促进细胞内脂质过氧化(20.]。细胞内二价铁过剩导致细胞通过ferroptosis芬顿反应(18]。近年来,研究人员发现,高脂肪的细胞环境中容易ferroptosis [21,22]。Ferroptosis扮演着一个重要的角色在心血管疾病引起的高脂肪的饮食23,24]。因此,它是合理的推测ferroptosis成骨细胞在高脂肪环境骨质流失的一个重要途径是由于高脂肪饮食当老鼠有一个长期的高脂肪饮食。这为未来带来了临床治疗骨质疏松症引起的高脂肪的饮食。

2。材料和方法

2.1。动物

实验协议是南方医院动物保健和使用委员会批准,并按照南方医科大学南方医院进行指导实验室动物。实验老鼠住在传统的实验环境中,老鼠接受了每天12小时的光/ 12小时黑暗周期,保持在一个温度控制在25°C和50%相对湿度与免费的食物和饮用水。经过一个星期的适应性喂养,老鼠被随机分配到三组:正常控制老鼠,高脂肪食物的老鼠,老鼠和高脂肪饮食+抑制剂。高脂肪饮食组的老鼠和老鼠高脂肪饮食+ Fer-1组被给予HFD(美国研究饮食D12492)共12周时成型。给予高脂肪饮食+ Fer-1组小鼠高脂饮食以及一个腹腔内注射1毫克/公斤Fer-1(美国hy - 100579多国评价)开始。造型结束后,老鼠被处决的颈椎脱位的方法,为进一步的实验和组织提取。

2.2。ct机

执行的老鼠后,腿部组织减少,股骨被盐水洗。其次是一夜之间在4%多聚甲醛固定在一个寒冷的房间在4°C和研究了利用高分辨率CT扫描(1172年Skyscan力量MicroCT, Kontich,比利时)。扫描进行使用x射线的能量55千伏峰值和145毫安的电流,与体素的大小12μm和集成400毫秒的时间。得到一个明确的骨小梁的变化在该地区股松果体的老鼠,我们使用定量分析是使用IPL执行软件(图像处理语言V5.15 Scanco医疗AG)、瑞士)进行定量分析。实验的区域(ROI)被选中开始1毫米以下的参考水平远端骺板和扩展2毫米的长度方向远端骨小梁的histomorphometric分析。

2.3。组织化学染色

老鼠的股骨与软组织分离和固定在4%多聚甲醛为36小时。其次是脱钙作用在0.5乙二胺四乙酸(EDTA, pH值8.0)10天,其次是石蜡包埋。结果石蜡包埋样本纵向切成4μ米厚的部分。碱性磷酸酶(ALP)染色和antitartrate酸性磷酸酶(陷阱)染色进行,与伊红染色组织形态学形象化())。更好地评估数量的骨骨小梁表面的成骨细胞和破骨细胞活性在实验的老鼠中,和光阱的kouichi /高山污点工具包(猫。294 - 67001年),和制造商的指示是:每毫米骨表面的成骨细胞数(n . Ob /毫米)和陷阱的数量每毫米+细胞骨表面(陷阱+ n)。成骨细胞的数量每毫米骨表面(n . Ob /毫米)和陷阱+细胞的数量每毫米骨(n .陷阱+ /毫米)量化。

2.4。组织和细胞的免疫荧光染色

2.4.1。免疫荧光染色的组织

4μm石蜡脱蜡、水化成柠檬酸钠抗原修复解决方案和水沐浴2小时在75°C,与PBS冲洗3次/分钟,与BSA和关闭一个小时。其次是孵化与初级抗体GPX4 (Abcam ab125066 1: 200)在一夜之间在4°C,然后用荧光标记的二次抗体室温1小时。组织与anti-fluorescence-attenuated拦截器包含DAPI染色作为复染色(Solarbio S2110,中国)。部分被认为与蔡司Axio成像仪。D2 (Axio成像仪M2显微镜,德国)。我们随机选择两个不重叠的位置在三个部分每个鼠标标本的量化阳性细胞。

2.4.2。细胞免疫荧光染色

细胞从细胞培养24小时后高脂介质刺激和Mc3t3-E1-E1细胞经历了七天的成骨分化脂肪中刺激后,与PBS洗了三次,然后,和4%多聚甲醛固定前15分钟洗细胞与PBS的三倍。膜坏了有0.1% tritonx - 100 15分钟,随后关闭5% BSA一小时。结束时关闭高脂肪中被用来刺激细胞刺激后24小时主要抗体Gpx4 (Abcam ab125066 1: 50), Slc7a11 (Proteintech, 26864 - 1 - ap, 1: 50),和Ki67 (Abcam ab15580 1: 50)观察细胞内ferroptosis标记蛋白和增殖的变化。细胞进行七天的成骨分化治疗原发性抗体Osterix (Abcam ab209484 1: 50)、骨钙素(Proteintech, 23418 - 1 - ap, 1: 50),和Rux2 (HUABIO ET1612-47 1: 50)观察细胞内osteogenic-associated蛋白质的变化。细胞与蔡司Axio成像仪观察。D2 (Axio成像仪M2显微镜,德国)。

2.5。生物化学分析

总谷胱甘肽的水平减少谷胱甘肽(GSSG, (G263、同仁堂、日本),丙二醛(M496、同仁堂、日本)和二价铁离子(l291、同仁堂、日本)在小鼠骨组织和Mc3t3-E1细胞测定使用商业套装根据制造商的指示。测量是通过商业工具,遵循制造商的指示。

2.6。细胞培养

MC3T3-E1 (GNM15细胞库的典型文化保护委员会的中国科学院,中国)细胞培养介质中含10%的边后卫αmem。调查是否造骨细胞脂肪条件下媒体(中国AAPR156-D500 Pythonbio)接受ferroptosis和减少了成骨的能力,我们播种MC3T3-E1细胞密度 细胞/ six-well板块。细胞分为控制,高脂肪,高脂+ Ferrostatin-1组的浓度5μmol / l。收集细胞24 h后ferroptosis-related化验。成骨分化,MC3T3-E1细胞分为对照组、高脂组和高脂+ Ferrostatin-1组Ferrostatin-1(多国评价、hy - 100579、中国)的浓度为5μmol / l。24小时后的治疗高脂和高脂+ Ferrostatin-1组,中了回到传统的成骨分化诱导介质。第七天,高山和bone-formation-associated蛋白进行免疫荧光染色,染色和高山染色的结果量化。

2.7。成骨细胞的分化和高山染色

碱性磷酸酶(ALP)染色分析被用来评估细胞的抑制效应ferroptosis高血脂条件下Mc3t3-E1cells成骨分化。Mc3t3-E1细胞悬浮液添加24-well板( 细胞每)在传统的孵化器和孵化12小时。中被更改为普通介质,高脂肪中,高脂+ Ferrostatin-1媒介。孵化后24小时内,所有的媒体都改为成骨分化诱导介质,用50μg / ml抗坏血酸(σ,A4544-25G), 10 nmol / l地塞米松(多国评价,hy - 14648)和10更易/ lβ甘油磷酸酯(σ,G9422-10G)。成骨诱导后七天,一半的细胞染色高山使用的高山染色装备板块(Beyotime C3206)和染色根据工具包执行指南。用亮场显微镜观察。照片然后用亮场显微镜((奥林巴斯,BX63)。另一半是化验高山活动使用高山量化工具。收集上清液,吸光度测量在405 nm (Beyotime P0321S),和细胞ALP活性定量计算。

2.8。统计数据

所有定量数据都表示为 。细胞培养实验中,所有从独立复制的实验结果,至少独立重复三次。两组之间的比较,独立的学生 - - - - - -测试使用。单向方差分析(方差分析)和Bonferroni事后测试是用于多个比较。统计分析软件使用GraphPad用于数据,7.0版本软件(美国GraphPad软件)。值< 0.05被认为是一个统计上的显著差异。

3所示。结果

3.1。Ferrostatin-1 Ferroptosis抑制剂可以防止HFD-Induced骨质流失

研究的功效Ferrostatin-1骨形成和骨吸收高脂肪食物的老鼠,我们使用的模型长期高脂饮食引起的骨质疏松。高脂肪饮食的老鼠有Ferrostatin-1腹腔内注射,结果表明,管理局高脂饮食的小鼠股骨骨小梁减少导致质量。这种脂肪diet-mediated骨质流失被Ferrostatin-1抑制。远端股骨的形态学分析表明,BV /电视和数字(Tb.N)减少,这种变化被Ferrostatin-1抑制。然而,Ferrostatin-1对骨小梁厚度的影响(Tb.Th),但骨小梁分离(Tb.Sp)在小鼠高脂饮食并不显著(图1 (d))。

3.2。高脂饮食诱导成骨细胞的损失

由于ct机的分析数据,长期高脂肪饮食改变长骨头在老鼠的骨骼结构。我们在实验调查HFD-fed小鼠的骨髓微环境是否会导致成骨细胞的数量减少。这再次验证了组织学检查他染色,骨质流失的高脂肪食物的老鼠可以减轻Ferrostatin-1,由圆)染色(图如图所示2(一个))。在我们的研究中,我们确定了成骨细胞的前体形成的重要作用。Proosteoblasts骨形成的一个重要的人口在骨髓腔。为了检测成骨细胞骨骨小梁表面的变化。高山染色被用来量化成骨细胞实验(数据的数量2(一个)和2 (b))。结果表明,表面的成骨细胞骨骨小梁数量减少高脂肪食物的老鼠,Ferrostatin-1抑制减少他们的数量,因为骨骼的新陈代谢的平衡是由破骨细胞形成和骨吸收之间的平衡。出于这个原因,骨组织是实验性地沾染了陷阱(数据2(一个)和2 (c))来评估破骨细胞活动的变化在小鼠的骨髓腔高脂肪的饮食。然而,我们观察到的数量无显著差异的陷阱⁺骨细胞的小鼠高脂饮食。因此,这些结果表明,高脂肪食物可能会主要诱导成骨细胞在小鼠体内的损失。

3.3。Ferroptosis扮演着一个重要的角色在高脂肪食源性骨质流失

在先前的研究中,研究人员发现,Gpx4 ferroptosis的关键蛋白,高脂肪的环境中显著改变。Immunofluorescent染色骨组织的小鼠高脂饮食建议Gpx4蛋白表达降低骨髓腔,这个过程可以由Ferrostatin-1逆转(图3(一个))。老鼠的胫骨骨组织也受到ferroptosis的生化指标测定,即总谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率,MDA,价内容。结果表明,这些MDA和价明显升高小鼠骨骼组织的高脂肪食物。然而,总谷胱甘肽,谷胱甘肽(GSSG比率明显较低。这些数据表明,ferroptosis扮演着一个重要的角色在高脂肪食源性骨质流失。

3.4。Ferroptosis Mc3t3-E1细胞是一个重要的方式接受死亡

多年的研究表明,Mc3t3-E1细胞的成骨分化为骨形成是很重要的。如果ferroptosis Mc3t3-E1细胞的增加在高脂肪的环境中,它的功能和增殖能力将大大受到影响。确定Mc3t3-E1经历ferroptosis在高脂肪的情况下,免疫荧光染色Gpx4和Slc7a11 ferroptosis的关键蛋白质,ferroptosis和生化指标的执行。结果显示,总谷胱甘肽和总GSH / GSSG比率降低Mc3t3-E1细胞治疗高脂介质相比,控制数据4 (e)和4 (f)),而价高和MDA Mc3t3-E1治疗高脂介质(数字4 (d)和4 (g))和增加,Gpx4 Slc7a11蛋白质相比显著降低控制。此外,Mc3t3-E1细胞的增殖功能有点限制与对照组相比。这个过程可以通过Ferrostatin-1抑制。这些结果表明,ferroptosis Mc3t3-E1细胞培养中存在的高脂肪的环境中。

3.5。高脂肪的环境抑制Mc3t3-E1细胞的成骨分化

虽然细胞死亡影响骨量的变化是一个重要的因素在老鼠中,受损Mc3t3-E1细胞的成骨分化有重要影响小鼠骨量减少。因此,Mc3t3-E1细胞的成骨分化能力在这个实验检查。在成骨分化的细胞,我们发现成骨分化的早期标志,高山,Mc3t3-E1细胞治疗脂肪中显著降低成骨分化诱导(第七天的数据5(一个)和5 (b))。osteogenic-related蛋白质Osterix、骨钙素和Rux2也不同程度(数据减少5 (c)- - - - - -5 (e))。这个过程可以被Ferrostatin-1抑制。

4所示。讨论

慢性高热量饮食引起的肥胖对人类有很大的负面影响骨密度(BMD) (25]。长期减少BMD和因此骨质疏松增加社会的经济负担26]。然而,骨质流失的确切机制引起的高脂肪饮食(不知道25]。因此,寻找的确切机制骨质疏松引起的高热量饮食是非常重要的预防和治疗骨质疏松。细胞ferroptosis的本质是脂质过氧化作用,降低核心蛋白的表达Gpx4和Slc7a11发生在应对外部刺激损害细胞的抗氧化系统,也影响胱氨酸新陈代谢的运输(27,28]。在以前的研究中,细胞ferroptosis的发生之间的联系和在高脂肪细胞功能异常环境密不可分。高脂肪的环境之间的联系和细胞ferroptosis主要心血管相关方面(29日),如动脉脂质沉积导致斑块的形成(30.),心脏射血能力(31日),和改造32),但背后的机制是酒精性肝病(33]。我们可以从这些研究表明,高脂饮食之间有一个联系和细胞ferroptosis的发展。因此,它是合理的假设细胞ferroptosis现象中扮演一个重要的角色在骨量的丧失在小鼠高脂饮食。在高脂肪的环境中,大多数细胞经历积累的脂肪和过多的活性氧积累(34,35]。这些是必要条件ferroptosis发生。因此,抑制ferroptosis过程中是重要的细胞功能受损引起的高脂肪的环境。在目前的实验中,小鼠高脂饮食注入Ferrostatin-1, ferroptosis抑制剂,显示显著减少骨质流失(图1)。体内实验证实ferroptosis重要作用的骨质流失由于高脂肪饮食。在目前的研究中,高脂肪饮食导致小鼠骨质疏松骨的破坏主要是由于平衡和骨质溶解,成骨细胞数量较低,导致受损成骨矿化,减少骨形成(图5)。在目前的研究中,我们第一次在动物体内实验证明ferroptosis是一个重要的由于高脂肪饮食对骨质疏松的影响。后在体内实验中,我们发现受损的骨合成代谢的一个重要因素是高脂肪食源性骨质流失。ferroptosis在老鼠骨骼组织的生化参数也证实ferroptosis发生骨质流失的过程中由于高脂肪饮食(图3)。由于成骨细胞的成骨分化是细胞最直接影响骨骼合成,在接下来的研究中,我们使用体外成骨细胞的文化(Mc3t3-E1细胞)来验证是否影响成骨细胞的骨形成某种程度上的高脂肪的环境和细胞ferroptosis是影响成骨细胞成骨分化的一个重要因素在高脂肪的环境中。细胞化验的结果表明,高脂肪的环境确实降低成骨细胞增殖(图4)和成骨分化(图5),这个过程可以减轻ferroptosis抑制剂。体外实验的结果是一致的与体内实验。它证实了ferroptosis发生在高脂肪的环境和变弱的细胞的正常生理功能。这项研究的结果提供了一种可能的治疗造成的骨矿物质密度减少高脂肪的饮食。然而,在这项研究中有几个缺点。首先,高脂肪饮食不仅会影响骨骼的生长发育也不同程度的其他重要器官。其他重要器官损伤是否可能间接导致骨质流失也没有在本研究调查。例如,它已经建立了脂质沉积由于高脂肪饮食对血管有不利影响整个身体和H-vessel,代表骨合成代谢,也可能显著降低,从而减少营养物质的供应,以股松果体和间接导致骨质流失。其次,其他细胞代表骨合成代谢没有目标和分析在这个实验中,如是否数量和功能的骨髓间充质干细胞,具有多向分化的潜力,以某种方式受到了影响,因此是一个因子在小鼠高脂饮食的骨质流失。在未来的研究中,我们将探索细胞ferroptosis骨质疏松的临床翻译由于高脂肪饮食,以调查潜在机制。

5。结论

在目前的实验中,我们发现,长期摄入高脂肪饮食导致小鼠骨质疏松对食用高脂肪饮食(a)和细胞ferroptosis参与整个过程。结果表明骨合成代谢受损骨质流失的一个重要因素在高脂肪饮食的老鼠(b),减少高脂肪的条件下成骨细胞分化功能影响骨形成是一个主要因素。先前的研究发现,高体重由于高热量骨质流失是一个重要的因素。随着人们的生活水平已经得到改善,他们的饮食发生了变化,长期摄入高热量会导致破坏骨微观结构。因此,在这个实验中发现的高脂肪饮食会干扰正常的通过ferroptosis骨合成代谢途径具有一定的临床意义。可能的途径,高脂肪饮食会导致骨质流失从机械的角度描述。ferroptosis通过政府的对立的抗氧化药物减缓骨质流失由于高脂肪饮食也可能是一个潜在的临床治疗骨质疏松由于高脂肪饮食。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

RunJiu朱、王照拂,徐元的贡献同样这项工作。朱RunJiu起草手稿;RunJiu朱、王照拂,徐元,香港杨画了这幅画。HaoYang Wan、明瑞歌和鑫张画了图笔记;本玉和玉柴监督研究和修订后的手稿。

确认

本研究支持由中国国家自然科学基金重大项目(没有。81830079,B.Y.);中国博士后科学基金(批准号:2020 m672720);广东省自然科学基金(批准号:2019 a1515011778);总统的基础南方医院,南方医科大学(授予数量:2019 z011);杰出青年发展计划南方医院、南方医科大学(2018 j012);广东基础研究和应用研究基金会(授予数量:2019 a1515110818);和广东基础研究和应用研究基金会(授予数量:2019 a1515110053)。