文摘

多能干细胞已经被认为是一种强有力的工具,在再生医学中使用。高效的一代已经通过染色质调节器如trichostatin (TSA)可能会改变他们的MHC分子表达谱。PSC代的效率及其免疫原性的主要障碍为临床使用。因此,我们的目标是调查是否使用TSA在PSC生成影响MHC表达水平。三行PSC是由万能,NT-ESCs, IVF-ESCs B6D2F1小鼠胚胎成纤维细胞的重编程方法。建立PSC线路特点是碱性磷酸酶测定(高山)和免疫细胞化学。他们的染色体检查富达核型分析。多能性基因的表达水平(oct4、nanog sox2 klf4),hdac (hdac1、hdac2 hdac3(包括),免疫相关基因Qa-1,Qa-2,H2kb,H2kd,H2db,H2db,CIITA,H2-IE-βb,H2-IE-βd在iPSC和ESC线被实时PCR分析评估。MHC分子的存在表面的多能干细胞也检查了流式细胞仪技术。显著增加的多能性标记,oct4,nanog,sox2,klf4在100 nM TSA-treated观察样本。100海里TSA诱导显著upregulationH2db在生成的万能。H2-IE-βd非常下调50和100 nM TSA-treated iPSC线。其他免疫相关基因的表达水平并不是在很大程度上受TSA iPSC和NT-ESC线。得出使用短期和低浓度的TSA在PSC代重组过程显著提高PSC生成效率,但不影响MHC建立细胞系中表达,在细胞移植在再生医学的好处。

1。介绍

重编程体细胞转化为多能干细胞(已经)生成一个无限数量的细胞能够分化成几乎所有类型的细胞。已经,在再生医学价值的细胞来源,是由体外受精(IVF),体细胞核移植(SCNT)和重编程体细胞(即。诱导已经被(万能))1]。然而,它们的生成效率低和潜在免疫原性限制其临床应用。因此,有必要提高细胞重新编程的效率没有显著改变PSC免疫相关基因表达谱。

建立胚胎干细胞(从体外受精胚胎的ESCs) (IVF-ESCs)是负担得起的和快速的,但ESCs的获得并非基因相同的收件人,细胞移植期间增加移植排斥的风险。ESCs源自SCNT建立从克隆胚胎提供histocompatible细胞用于再生医学。然而,alloantigenicity不匹配造成的细胞核移植的ESCs线粒体可能刺激宿主免疫反应(2,3]。自体的细胞则被考虑为一个理想的候选人来规避在细胞治疗移植排斥到赵等人发表了一个意想不到的报告则来自同源的老鼠的免疫原性(4]。除了已经被内在的免疫原性,方法用于提高生成效率会影响其免疫原性,必须考虑进一步的临床使用。

到目前为止,各种小分子目标不同信号通路与细胞状态,功能,表观遗传学被用来提升重编程的能力5]。使用小分子如染色质调节器在ESC的生成和细胞则有效地提高多能性基因的表达水平进而提高重组率。DNA甲基转移酶抑制剂,组蛋白甲基转移酶抑制剂,组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDI)目前用于PSC代促进重组过程。在这些调节器中,组蛋白脱乙酰酶抑制剂是最早的因素被广泛用于提高组蛋白乙酰化水平,引起染色质重塑,改变基因表达模式(6,7]。Trichostatin (TSA),一个著名的人类发展指数,加速重组过程通过促进组蛋白乙酰化作用也减少压抑的组蛋白甲基化Sox2,原癌基因,Oct4发起人,hypermethylated和hypoacetylated分化细胞(8,9]。由于这些小分子造成广泛的表观遗传改变,它可能提高免疫相关基因的改变的担忧,已很少研究。

Upregulation等免疫相关基因的主要组织相容性复合体(MHC)分子通过改变染色质调节器可以触发免疫反应在细胞移植(10]。已经表明,MHC II级分子是在细胞表面表达后的浆细胞肿瘤表观遗传药理剂激活的TSA使得他们作为一个有效的抗原呈递细胞被免疫细胞(11]。然而,TSA并不影响MHC表达式以类似的方式在不同细胞类型的差异三个类CIITA, MHC的主控因子表达式,推广者在不同的细胞。因此,有必要开发标准和高效重组方法有最小的几种基因改变在代clinical-grade胚胎干细胞和诱导多能干细胞。

在这项研究中,九ESC线路产生的体外受精和SCNT技术从B6D2F1 MEF细胞。九iPSC行也起源于MEF细胞实验的因素。测试组之间重组的效率,研究了重组的不同浓度的TSA和对照组在TSA的缺失。建立细胞系的形态学特征,高山的活动,和蛋白质分析。染色体基因组完整性的细胞系进行核型分析。多能性基因的表达,hdac和MHC分子在不同细胞系建立被实时PCR和流式细胞术进行评估。

2。材料和方法

2.1。体细胞核移植

受体卵母细胞获得B6D2F1雌性小鼠超数排卵5 IU的孕马血清促性腺激素(PMSG)和5 IU的人类绒毛膜促性腺激素(hCG) 48小时间隔(12]。14hours after the last injection, mice were sacrificed, and cumulus-oocyte complexes were incubated in FHM medium with 300 U/ml hyaluronidase. Denuded oocytes were collected and washed in FHM. Enucleation of denuded MII oocytes was performed in KSOM with 5 μ克/毫升细胞松弛素b去核过程后,核自组织映射聚类在卵母细胞培养在37°C。B6D2F1小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)细胞分离和胰蛋白酶的洗PBS三次。接下来,他们离心机和溶解在DMEM媒体。准备MEF细胞被注入无核的卵母细胞。元后,卵母细胞的一半都被100海里TSA作为实验组,和下半年保持治疗作为对照组。两组被放置在一个湿润孵化器有限公司37°C的5%2preactivate 2 h。在接下来的过程中,卵母细胞被激活在10毫米SrCl2和5克/毫升细胞松弛素B-supplemented核自组织映射聚类有/没有calcium-free TSA 6 h (12,13]。核自组织映射聚类到胚胎仍在胚泡期(96 h)。的数量都有,4细胞、桑椹胚的胚胎囊胚和记录在4天。

2.2。多能干细胞(PSC)生成和文化

我们生成9 iPSC行(S1, S2、S3 T1, T2, TSA和T3+组,E1、E2和E3 TSA- - - - - -组)从B6D2F1 MEF细胞。pMXs-c-Myc,总之,pMXs-Oct3/4 pMXs-klf4, pMXs-sox2 (Addgene)向量被转染进Platinum-E (Plat-E)细胞通过Lipofectamin 3000 (Thermofisher)根据制造商的指示14]。随后,病毒上清液收集,聚凝胺提高转换效率。此时,各种浓度的TSA(50和100海里)被添加到TSA-positive组。万能的殖民地是拿起10天,扩大。被培养的细胞则不活跃的MEF作为支线层。新鲜培养基包含DMEM F12 KSR补充15%,L谷氨酰胺(2毫米),丙酮酸钠(1毫米),mLIF (1000 U /毫升),2-mercaptoethanol (100μ米),不必要的氨基酸(0.1毫米),青霉素和链霉素(50 U)。媒介是每天刷新,细胞被山肩每周两次(15]。

六NT-ESCs和三行IVF-ESC也来源于B6D2F1囊胚内细胞团(ICM): S1, S2和S3 TSA+组、F1、F2和F3 TSA- - - - - -组和M1、M2和M3作为对照组。胚泡的透明带(ZP)被tyrodic酸( )。接下来,ZP-free mef囊胚是放在无所作为。已经被最初的ESC培养基培养如上所述。这些已经被适应feeder-free N2B27媒介。

2.3。iPSC和ESC表征
2.3.1。碱性磷酸酶(ALP)染色

碱性磷酸酶检测设备(Sigma-Aldrich 86 r-1kt)是用于验证万能殖民地。殖民地被30秒4%多聚甲醛固定,彩色根据指令。获得的图像的彩色殖民地奥林巴斯CKX41显微镜与奥林巴斯DP72相机。

2.3.2。免疫细胞化学

细胞是由新鲜的4%多聚甲醛溶液固定在室温20分钟。他们清洗和permeabilized PBS-tween 0.05%和0.7% Triton x - 100和屏蔽2%牛血清白蛋白(BSA、Sigma-Aldrich、美国)。与单克隆细胞孵化鼠标IgM反/鼠标SSEA1(猫# MAB2155、研发系统、美国)和鼠标oct4抗体(猫# MAB1759、研发系统、美国)一夜之间在4°C。随后,oct4和SSEA1被二次抗体标记,Alexa(美国表达载体A11020)和FITC(猫# 71 - 1900,英杰公司,美国),分别在室温下了一个小时。细胞核是沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(美国Sigma-Aldrich D8417) [16,17)和荧光显微镜观察到(奥林巴斯U-RFL-T,德国)。

2.3.3。染色体计数

已经被秋水仙胺治疗(120μL在5毫升培养基稀释)为90分钟。殖民地使胰蛋白酶化、收集和暴露于低渗的溶液中含有柠檬酸钠和钾氯20分钟。细胞被冷乙醇固定,轻轻的掉在干净的载玻片和彩色染色。捕获的图像是由蔡司光学显微镜,分数A1,伊卡洛斯和分析的软件。

2.4。H3lys9乙酰化作用

组蛋白H3乙酰Lys9酶联免疫试剂盒(活动主题,猫# 53114)是应用于监控HDAC活性和组蛋白乙酰化作用在多能干细胞的数量。组蛋白溶解提取的缓冲区,和之后的乙酰化分析是由制造商的协议。吸光度测量使用热科学™Multiskan™去微型板块分光光度计(美国热科学™)在450海里。

2.5。rt - pcr和基因表达分析

总RNA提取GeneAll工具包(314 - 106、GeneAll生物技术有限公司、韩国)根据制造商的指示。互补DNA合成使用Yekta Tajhiz互补脱氧核糖核酸合成装备在两个步骤。rt - pcr是多能性基因(nanog oct4、klf4,sox2)、MHC基因(Qa-1,Qa-2,H2kb,H2kd,H2db,H2dd,CIITA,H2-IE-βb,H2-IE-βd),hdac基因(hdac1、2和3)使用Yekta Tajhiz PCR混合和大师β肌动蛋白底漆来验证cDNA生产。实时PCR反应进行(StepOne实时PCR系统,应用生物系统公司)使用SYBR绿色PCR反应混合液(应用Yekta tajhiz)。基因的信使rna表达水平相对规范化的β肌动蛋白。信使rna表达水平计算使用ΔΔCt方法。表1(补充数据)列出所有引物用于这项研究。

2.6。流式细胞术

MHC分析(MHC类我和MHC II级)的多能干细胞和MEF细胞被流式细胞术分析。主要组织相容性复合物被发现使用抗体MHC类我分子(MHCI马伯非结合的,猫# nb120 - 6405,罗福斯)和MHC II级分子(MHCII马伯非结合的猫# sc - 32247, Santa Cruz)。二次抗体包括山羊anti-mouse免疫球蛋白(H + L)抗体(FITC)(猫# orb688924)。消极的控制,以适当的isotype-matched控制细胞被染色。第二章BD流式细胞仪细胞分析仪是用来进行流式细胞术分析,和数据分析使用FlowJo 6.4.7软件。

2.7。统计分析

我们TSA-treated相比,参与多能干细胞组和mef体细胞使用单向方差分析(方差分析)。分析与GraphPad Prism 5.0 (GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。给出的数据 。 值< 0.05被认为是重要的。

3所示。结果

3.1。生成和特征的万能,NT-ESCs IVF-ESCs

研究设计的示意图表示如图1(一)。三行PSC完全由万能,NT-ESCs, IVF-ESCs重组方法。在iPSC代,mef从纺锤状的形态polygonal-shaped细胞重新编程后24小时(图1 (b),2nd天)。典型的鼠标ESC-like殖民地出现重组后10天(图1 (b),生成的殖民地)。类似rounded-shaped殖民地在TSA-positive观察组和对照组。这些ESC-like殖民地得以放大,形成新的殖民地后回升,他们不断自我更新和多潜能属性后15 subpassages(图1 (b)后,15章节)。

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图1
已经被鉴定。(一)研究设计的示意图表示。(b c)都出现了殖民地(IVF-ESCs TSA-iPSCs TSA +万能干细胞,TSA + NT-ESCs)代表典型的ESC-like形态。在100 nM (d)高山活动TSA-treated万能(a), 50 nM TSA-treated万能(b), TSA-negative万能(c)和ImageJ分析显示50和100 nM TSA浓度显著增加(g)的细胞则产生的高山表达。TSA治疗ESCs (d),参与ESCs (e),和IVF-ESCs (f)显示高(h)高山活动。(e)细胞株证实了核型分析的正常核型。(f)的建立已经表达典型的多能性标记,包括OCT4(绿色)和SSEA-1(红色)。核与DAPI染色(蓝色)。(g h)荧光强度OCT4、SSEA1 iPSC和ESC殖民地ImageJ量化。 显示统计学意义( )与对照组相比。 代表 。#显示统计学意义( )团体之间。

ESC殖民地成长从囊胚的内细胞团,这是由SCNT和体外受精过程(图1 (c)胚泡)。TSA-subjected和控制NT-ESC殖民地以及IVF-ESC殖民地表现出明确的边界和rounded-shaped形态(图1 (c),生成的殖民地)。iPSC殖民地,他们放大,形成新的殖民地与自我更新和多潜能特性15 subpassages之后(图1 (c)后,15章节)。

高山染色进行所有的细胞系(图1 (d))。iPSC殖民地都变成红治疗后高山的衬底和腌制后使他们的活动(数据1 (d)和1(一)- - - - - -1 (c))。TSA-treated iPSC团体(50和100纳米浓度)显示出类似的高山活动模式还明显高于对照组( 值< 0.05),由ImageJ分析(数据作为证据1 (d)和1 (g))。IVF-ESCs、NT-ESCs TSA-treated NT-ESC团体表达了类似的高山(数字1 (d)——(f)和1 (h))。指出,高山活动后被发现在ESC殖民地15章节。

核型分析分析表明95%的参与建立保存正确的染色体组的细胞则40(数字1 (e)和1(一))。80%的TSA-treated则保持染色体稳定在15文化通道(数字1 (e)和1 (b))。90%的IVF-ESCs显示正常二倍体核型染色体组40(数字1 (e)和1 (c)),而TSA-negative NT-ESCs和TSA-positive NT-ESCs似乎更多变量染色体数。他们显示染色体富达85和80%,分别为(数字1 (e)和1 (d)和表2(补充数据))。

采用免疫染色进行评估OCT3/4多能干细胞标记物的表达,在既定的PSC殖民地SSEA-1(图1 (f))。ImageJ分析显示100年激烈的表达OCT4 TSA-treated万能干细胞随后50 nM受到TSA样品和对照组。同样,OCT4的表达水平显著增加在100 nM TSA-subjected NT-ESCs相比,参与NT-ESC殖民地(图1 (g))。

SSEA1鼠标多能干细胞的表面标记检查在所有组。相同的表达水平SSEA1表面检测到所有iPSC和NT-ESC组(图1 (h))。

3.2。H3Lys9乙酰化和HDAC表达TSA-Treated多能干细胞

我们检查了H3lys9乙酰化的标记HDAC活动建立了ESC和iPSC组。我们可以看到在图2(一个)没有明显差异,H3lys9乙酰化在TSA-positive和TSA-negative组。我们也调查了hdac基因表达水平在建立多能干细胞及其亲代细胞(MEF)的存在和缺乏TSA。rt - pcr结果表明,hdac1、2和3 TSA-treated表示在同一水平和参与多能干细胞(万能和ESCs)。然而,MEF细胞表现出明显的表达hdac 1, 2, 3与多能干细胞( )(数据2 (b)- - - - - -2 (d))。

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图2
组蛋白乙酰化分析和HDAC表达式。(一)组蛋白乙酰化作用是检查H3Lys9乙酰化分析的接受50和100海里的细胞则TSA在重组和100 nM TSA-treated NT-ESCs。所有的组织比较相关的对照组。(b) - (d)hdac1、2和3的表情评估通过rt - pcr对所有测试组和对照组相比。ns:不显著; , ,和 显示统计学意义 , , ,分别与对照组相比。
3.3。TSA显著提高重组率

出现iPSC菌落数的总数在高山染色和ESC-like形态学评估每个重组方法的效率。在iPSC生成过程中, ESC-like菌落数在10天的posttransduction,而参与盘子 殖民地出现在50 nM TSA-treated盘子。此外,殖民地数量提高 每相同数量的种子细胞在100 nM TSA-subjected盘子。50和100 nM TSA治疗增强效率的iPSC生成3 -和7.5倍,分别(图3(一个))。

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图3
PSC的生成效率。(一)iPSC殖民地数字显示,TSA治疗增加iPSC集落形成。(b)多能性基因评价实时PCR在不同样本的万能和ESCs。(c)的胚胎发展和ESCs的一代。 , ,和 显示统计学意义, , , ,分别与对照组相比。

实时PCR分析评估多能性基因的细胞系(Oct4,Sox2,Nanog,Klf4在mRNA水平)。多能性基因都是稍微调节在50 nM TSA-treated iPSC样本相对于对照组,但无统计学意义。100海里TSA-treated则显示所有多能性基因的表达水平高于对照组。然而,这只是增加显著Sox2,Klf4,Nanog分别为( )。同样,NT-ESCs显示大幅上升Sox2和Klf4以及增加Nanog。有轻微upregulationOct4,但没有统计学意义(图3 (b))。

41胚泡起来来自57个胚胎在体外受精过程(约72%),而97从225年胚胎囊胚是实现TSA-treated SCNT技术(43%)。28囊胚只是从303个增加胚胎TSA-free SCNT后测试。IVF-blastocyst的27.3%和25%的TSA-treated NT-blastocysts变成ESC殖民地时放在MEF支线层,而只有12%的参与NT-blastocysts形成ESC殖民地(图3 (c))。

3.4。TSA重组期间治疗诱发MHC一级和二级表达的变化可以忽略不计

实时PCR分析显示的表达Qa -1 (MHC class-Ib)略有下降50 nM TSA-subjected样本统计无关紧要。然而,它并没有改变在100 nM TSA-treated万能和NT-ESCs。Qa -1表达水平也为父母的体细胞(MEF)和监控显示表达水平高于建立多能干细胞( )(图4(一))。

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图4
MHC一级表达水平。(一)直方图显示的实时PCR分析Qa-1,Qa-2,H2kb,H2kd,H2db,H2ddTSA-treated ESCs和万能与参与对照组和父母MEF细胞。(b)流式细胞术分析的表达MHC I分子表面的ESCs,万能,MEF细胞。ns:不显著; 和 显示统计学意义, , ,分别与对照组相比。

TSA治疗期间重组减少引起的Qa -2 (MHC class-Ib)表达在50和100海里TSA-subjected测试组。的表达水平Qa -2减少50和100 nM TSA-treated iPSC组织浓度的方式。另一方面,TSA-subjected NT-ESCs表现出增加Qa -2基因,也无统计学意义。MEF细胞显示的一种极端表达Qa -2相比ESCs和万能( )(图4(一))。我们还观察到SCNT过程增加了Qa -(图2表达水平1(年代),补充数据)。

类似于Qa -1的表达水平H2kb表达下调50 nM TSA的使用后,没有发现明显的变化在100 nM TSA-treated万能团体和TSA-treated NT-ESCs。此外,MEF细胞有相同的H2kb表达水平的ESCs和万能(图4(一))。H2kb相比显著减少TSA-negative NT-ESCs IVF-ESCs(图1(年代),补充数据)。

我们并没有发现任何明显的表达水平的变化H2kd和H2dd在所有组。然而,MEF细胞显著表达H2kd和H2ddESCs相比,和万能( )(图4(一))。相比之下,SCNT组的结果的差别明显对这些表示H2dd基因TSA-negative NT-ESCs(图1(年代),补充数据)。

我们没有观察到任何重要的表达水平的变化H2db在50 nM TSA-treated iPSC集团,而使用100 nM TSA的急剧增加HS2db基因相比,参与集团( )。正如所料,H2db显著表达MEF细胞( )(图4(一))。的表达水平显著下降H2db发生在TSA-treated NT-ESC组( )。类似于TSA-treated NT-ESCs,H2db大幅下调在参与NT-ESC组(图1(年代),补充数据)。

MHC表达式在ESC和iPSC表面由流式细胞术。50和100海里TSA-treated组显示6.97和9.08% MHCI-positive细胞群,分别,而5.57%的“诱导多能性”细胞对照组代表MHCI表面。TSA - 7.65和8.89%的ESCs TSA-positive表达MHC I表面。相比之下,61.5%的MEF细胞MHC I代表(图4 (b))。

重编程过程的短期刺激TSA略有增加CIITA转录水平在50和100 nM TSA-treated万能。NT-ESCs显示戏剧性的减少CIITA表达水平与对照组相比。我们没有观察到任何重要的表达CIITA MEF细胞相比,多能细胞(图5(一个))。CIITA表达水平也显著下调中参与NT-ESCs(图1(年代),补充数据)。

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图5
CIITA和MHC ii级表达水平。(一)直方图显示的实时PCR分析CIITA, H2-IE-βb,H2-IE-βdESCs TSA-positive和消极的万能。MEF细胞研究父母的体细胞。(b)流式细胞术分析的表达MHC II分子表面的ESCs,万能,MEF细胞。ns:不显著; 显示统计学意义, 。

MHCII基因,包括H2-IE-βb和H2-IE-βd,被实时PCR分析评估。从图可以看出5,没有观察到显著变化的团体之一H2-IE-βb表达水平。另一方面,H2-IE-βd明显下调50和100 nM TSA-treated万能( ),虽然没有改变观察NT-ESCs MEF细胞与对照组相比(图5(一个))。

流式细胞术测定也进行ESC研究MHC II表达式,万能,MEF细胞的表面。结果表明,50和100年的2.46%和3.6%人口nM-treated万能表达MHC II表面,分别,这是类似于TSA-negative万能(2.85%)。TSA-negative ESCs的2.96%和2.24%的ESCs TSA-treated表示MHC II表面。只有4.48%的MEF MHC II(图)阳性细胞5 (b))。

4所示。讨论

化学成分的使用是一个的策略提高PSC生成效率。虽然已经提出许多化合物促进重组,目前还不清楚是否这些代理所产生的基因表达谱的已经被认为是类似的传统已经被(18,19]。在此,我们使用TSA在万能的生成和NT-ESCs评估人类发展指数的影响复合重编程效率和MHC表达水平。

建立了PSC线都是通过20多倍没有分化,和他们保持自我更新功能。万能和NT-ESCs代表高高山活动,与ESCs-like圆形菌落形态和正常核型。免疫细胞化学在TSA-treated确认upregulation OCT4 iPSC样品浓度的方式。尽管低浓度的TSA能够移植OCT4转录因子作为万能的关键一代,其高浓度OCT4转录因子上有深远的影响。Upregulation TSA治疗在重组后的OCT4显然与稳定的OCT4 hyperacetylation子有关。像万能,OCT4显著调节在TSA-treated NT-ESCs,显示稳定的乙酰化OCT4子即使在短期TSA SCNT过程处理。SSEA1多能性的表面标记是调节在iPSC和NT-ESC线。和SSEA1相似的表达水平在所有的细胞系,这表明所有的细胞系都成功重组多能状态(20.]。

TSA促进的表观遗传记忆通过可逆HDAC抑制酶在多能干细胞生成。在这个研究中,H3Lys9的乙酰化水平没有明显不同TSA-positive和TSA-negative组织证实了暂时的和可逆的TSA艾滋病在重组过程的影响。TSA的锌离子可逆高度hdac的催化部位;TSA去除后,HDAC催化网站和锌离子成为自由,和酶活性恢复(21]。分析hdac mRNA水平TSA-treated万能和ESCs透露,TSA治疗期间重组并不影响派生万能或ESCs的hdac表达式,可以防止对表观遗传学的建立则和ESCs consequentional影响。

根据菌落计数结果,iPSC集落形成增加了3 - 7倍的50和100 nM TSA,分别。胚泡的形成也增加了13%在TSA-treated NT-ESC组。因此,运输安全管理局作为组蛋白脱乙酰酶抑制剂提高编程效率,与文献[在协议22]。

TSA的实时和稳态行动组蛋白乙酰化的直接和间接DNA脱甲基之前确认(23]。在我们的研究中,实时PCR分析表明,多能性基因等Oct4,Sox2,Klf4,Nanog调节在TSA-subjected iPSC样品相比,控制,稳定的乙酰化作用造成的。Upregulation TSA-treated万能干细胞多能性基因的浓度。

虽然TSA治疗的效率显著提高胚泡形成和ESC SCNT发放的方法,这仍然是低与体外受精技术相比。类似于iPSC组,TSA-treated NT-ESC样本代表更高的多能性基因表达相比,参与NT-ESCs,证实了稳定的组蛋白乙酰化作用在这些细胞多能性基因的启动子。这些催化剂依次是转录因子的目标来提高基因表达,并帮助保护已经被多能性和自我更新功能。

解决TSA的几种基因的影响,我们研究了MHC的表达水平类,二世模MHC, CIITA TSA的存在并没有在iPSC和NT-ESC生成。转录的mhc i和mhc ii基因已经被认为是由一组守恒的调控元件在启动子,这可能会影响到小分子用于开发重组程序(24]。我们的结果显示Qa -1 (MHC class-Ib)表达式保持不变在TSA-treated万能干细胞和NT-ESCs相对于其相关的对照组。Qa -1是一个主要的抑制性受体的配体CD94 / NKG2A和参与抑制NK细胞和CD4 + T细胞(24保护)和诱导抑制性信号Qa -1-expressing细胞对NK细胞。因此,在免疫耐受中起着至关重要的作用。的Qa -1表情已经TSA治疗后可能会帮助他们不会被免疫系统,这是该方法的优势。rt - pcr分析的差别决定了对这些Qa -2 TSA-treated浓度的方式则不显著。然而,NT-ESC样品显示略有增加Qa -2 SCNT过程造成的影响不是TSA(图1(年代),补充数据)。Qa -2是MHC Ib的另一个成员的家庭,这可以通过交互Lys49c抑制NK细胞对NK细胞受体(25,26)和干预免疫耐受。文献表明,Qa-2抑制作用即使在低表达水平和能保护细胞免受移植排斥(27]。在这项研究中,我们发现,TSA没有明显影响Qa-2表达在细胞疗法的好处。然而,更多的研究MHC Ib表达在这些细胞分化及其派生细胞需要明确解决的机制保护ESC和万能NK细胞。

短期治疗iPSC TSA的生成过程没有影响H2kb,H2kd,H2dd表达,这可能与不稳定的乙酰化作用的启动子在这些细胞系。指出,干细胞的研究表明,非经典数理MHC I类MHC I和分子的表达明显减少PSC表面,保护他们的T细胞和B细胞识别。虽然在细胞治疗是有益的,但缺乏MHCI和模MHC PSC表面会受到这些细胞被自然杀伤细胞(10,28]。最小的表达MHC分子已经被“表面因此必要的失败他们的免疫系统排斥。此外,许多癌症研究小组调查了TSA在MHC分子的影响,作为人类发展指数代理商用于化疗。这些研究表明,TSA可能增加肿瘤免疫原性的超表达MHC分子在癌细胞,而且它还担心在重组过程中使用TSA (10]。TSA抑制组蛋白脱乙酰酶一级(HDACI)酶活性,导致MHC I表达式。永久使用TSA在PSC文化媒体也增强MHCI PSC表面分子的表达。

与先前的研究相反,我们的结果表明的信使rna表达水平H2kb,H2kd,H2dd保持不变在不同细胞系中产生50和100 nM TSA的浓度(29日,30.]。相信TSA的使用很短的时间在重组过程不产生稳定的乙酰化作用H2kb,H2kd,H2dd启动子。令人惊讶的是,我们观察到的急剧增加H2db表达水平的100 nM TSA在iPSC线,这可能可能的增加有关H2db的启动子乙酰化作用由TSA引起的。TSA对基因表达有不同的影响,选择性地诱导乙酰化作用不同的促进剂,抑制/刺激不同的基因表达在永久/临时订单23]。因此,各种单体型可能对TSA的反应不同。与细胞则不同,表达的水平H2db减少TSA-treated NT-ESCs,分配给SCNT过程但不是TSA的影响H2db表达下调在参与NT-ESCs IVF-ESCs相比(补充数据,图1)。

短期使用50和100海里的TSA在重组过程中稍微调节CIITA浓度的方式表达水平。不同的研究强调的重要性CIITA通过招募histone-modifying MHC II级表达调控酶和转录因子。CIITA是由DNA甲基化和组蛋白修饰在转录水平(10,31日]。的变更CIITA表达水平可能会改变下游MHC II分子的表达。使用高浓度的TSA在iPSC代移植CIITA表达和不推荐在临床方法。令人惊讶的是,100 nM TSA-treated NT-ESC样本显示的显著减少CIITA表达式。的比较TSA-negative NT-ESCs, TSA-positive NT-ESCs,及其控制IVF-ESCs透露,明显降低CIITA有关SCNT过程(图1(年代),补充数据)。因此,TSA政府在SCNT过程在短时间内将减少CIITA表达水平,随后MHC II的差别可能导致对这些分子。MHCII分子,包括H2-IE-βb和H2-IE-βd,仅限于抗原递呈细胞(APC)。

相比CIITA,H2-IE-βb没有接受任何TSA-treated万能干细胞的变化,这表明轻微增加的CIITA在转录水平可能不会影响H2-IE-βb表达水平。令人惊讶的是,在NT-ESCs MHC II基因并未改变,可能会通过SCNT过程能够诱导基因表达(图1(年代),补充数据),或乙酰化作用由TSA的直接影响H2-IE-βb和H2-IE-βd启动子,反抗CIITAdownregulation。出乎意料,H2-IE-βd浓度的方式表达下调在TSA-treated则表示,TSA可能抑制H2-IE-βd表达式。此外,流式细胞术结果证实,所有iPSC和ESC组表达MHC I和II在较低水平。没有显著变化的测试组中观察到的rt - pcr的结果。因此,相信TSA艾滋病在重组期间不会影响MHC在生成已经在蛋白质水平。

5。结论

高效、准确建立PSC线在细胞治疗是至关重要的。TSA作为人类发展指数显著增加了重组率。然而,其对免疫相关基因表达的影响仍不清楚。本研究调查的影响TSA治疗MHC分子和万能和NT-ESCs CIITA表达式。我们的研究结果表明,模MHC并不受TSA在TSA-treated iPSC和ESC团体。在MHC I基因,只有H2db单体型增加100海里TSA的存在,而其他MHCI分子保持不变。CIITA基因的表达水平增加TSA-subjected万能浓度的方式。TSA并不影响MHC II建立细胞系。总之,TSA治疗PSC代期间增加的速度通过upregulation多能性基因重组。低浓度和临时使用TSA在重组过程中不大大影响MHC分子表达已经被认为有利于细胞替代疗法。

数据可用性

数据集支持本文的结论都包含在这篇文章和它的补充文件。

伦理批准

所有动物保健和伦理委员会批准的程序鲁瓦扬研究所德黑兰,伊朗(IR.ACECR.ROYAN.REC.1397.275)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

科幻小说收集、处理、分析、解释数据并写手稿。SMH、HG、SH和女士设计实验和解释数据。SH分析和解释数据。女士和SH概念化设计实验和回顾了手稿。作者通过最后的手稿。

确认

萨米拉Mehdi Hesaraki先生,女士Soori Sepideh Molamohammadi,和Niloofar Kalantari感激地承认他们的援助与iPSC的一代。本研究在经济上得到Shahid Beheshti医疗的支持。

补充材料

图1 (s)(补充数据):ESC免疫相关基因表达存在和缺乏TSA IVF-ESCs相比控制。Qa-1显著降低TSA-negative NT-ESCs比较IVF-ESCs和TSA-positive NT-ESCs。Qa-2显示在这两个测试组略有增加。H2kb大大减少了在比较IVF-ESCs和参与TSA NT-ESCs TSA-treated NT-ESCs。测试组H2kd没有任何变化。大幅减少H2db TSA-treated观察和参与NT-ESCs。SCNT过程诱导大幅减少H2dd TSA-negative NT-ESCs比较体外受精和TSA-subjected ESCs。CIITA表现出显著减少TSA-treated和参与NT-ESCs。H2-IE -βb细胞系都相同的表达式。H2-IE -βd显著增加TSA-negative NT-ESCs ESCs比较TSA-positive和体外受精。表1 s(补充数据):引物用于实时聚合酶链反应分析列出(实时PCR)。表2 s(补充数据):核型分析分析。染色体数目不同的细胞系进行了核型分析。TSA-negative万能和ESCs显示正常核型95和90%,分别。80%的TSA对待iPSC 40行保留正确的染色体组。85%的TSA-negative NT-ESCs显示正常二倍体核型染色体组40。和80%的TSA-positive NT-ESCs显示稳定的染色体组。(补充材料)