文摘
客观的。采用心从循环死后捐赠(以便)是一种有前途的方法来扩大供体池。然而,以便决定心温暖经历严重的缺血/再灌注(I / R)损伤。最近的研究表明,条件培养液(CM)来源于骨髓间充质干细胞(bmsc)减少器官I / R损伤的潜力。因此,我们调查以便决定是否心与性常温保存体外心脏灌注(EVHP)和BMSCs-CM治疗可以减轻心肌I / R损伤在民国的心温暖。方法。我们供体鼠随机分为两组:(1)DCD-Control组和(2)DCD-CM组。民国前心与性常温保存EVHP系统105分钟,老鼠遭受25分钟热缺血损伤的论证过程。车辆或厘米(300μl)被添加到灌流液灌注过程的开始。的心在DCD-Control心脏功能和DCD-CM组测量每30分钟。此外,non-DCD心被收割的老鼠心脏。结果。抗体阵列显示包含14 CM生物活性因子参与细胞凋亡、炎症和氧化应激。热缺血损伤导致显著增加水平的氧化应激,炎症和细胞凋亡在民国DCD-Control组的心。此外,与DCD-Control组相比,CM治疗增加了开发的压力, 和 左心室的心在90分钟的EVHP DCD计划。此外,管理厘米减毒的氧化应激水平,炎症和细胞凋亡的心DCD计划DCD-CM组。结论。性常温EVHP结合厘米治疗可以减轻温暖I / R损伤的心DCD计划通过减少氧化应激水平,炎症反应,和细胞凋亡,这可能会缓解缺乏捐赠的心脏采用民国的心。
1。介绍
心脏移植是最适当的治疗终末期心力衰竭(1]。不幸的是,尽管越来越多的心力衰竭患者,缺乏合适的捐献者的心脏心脏移植的发展[有限2]。最近的研究表明,采用心从循环死后捐赠(以便)可以显著扩大供体池(3]。在英国,据预测,采用严格的论证捐赠者选择标准将导致心脏移植的数量增加了56% (4),这将显著降低死亡率候补名单。此外,相比之下,传统的脑死亡(BD)心脏移植、心脏移植DCD计划提供了一个类似的30天或1年术后存活率(5,6]。然而,由于不可避免的热缺血时间,以便决定心经历更严重的心肌缺血/再灌注(I / R)损伤(7]。
多能间充质干细胞(msc),自我更新的细胞(8]。介绍了msc政府作为一个有前途的细胞疗法缓解器官I / R损伤(9]。此外,应用msc可以显著减轻I / R损伤在器官保存(10]。msc的治疗效果是归因于他们杰出的免疫调节和再生能力11]。然而,最近的研究表明,移植msc的长期存活率相对较低(12,13),说明msc的旁分泌作用可能扮演了一个重要的角色在他们的治疗效果14]。越来越多的文献表明条件培养基(CM)源自msc包含各种各样的生物活性因子,如趋化因子/细胞因子(15)以及生长和凋亡因素,可以产生显著的治疗效果在不同的疾病(16,17]。Korkmaz-Icoz等人显示保存BD供心CM-enriched cardioplegic解决方案提高了移植后移植物的收缩性能在大鼠心脏移植18]。此外,机器灌注与CM的供心保护心肌I / R损伤在15个月大的老鼠19]。此外,冷藏的血管移植后移植物的CM减轻血管内皮功能障碍在体外在BD I / R损伤大鼠(20.]。
静态冷藏已被视为一个可靠的和传统的心脏保护策略,这很简单,便宜,而且能够保护标准供心与接受移植的结果[4到6个小时21]。然而,这种存储方法可能不被认为是最好的保护策略,以便决定心,像energy-depleted DCD计划的心几乎不能容忍其他冷缺血(22]。近年来,性常温体外心脏灌注(EVHP)已经被认为是一个有前途的新颖策略以便保存。性常温EVHP可以用含氧供应捐赠的心,温暖,新blood-based灌流液semiphysiological状态在器官储存(23]。因此,与静态冷藏相比,性常温EVHP可以减弱心肌I / R损伤心DCD计划,评估实时的心收缩功能,延长储存时间,提供一个独特的平台为修复心DCD计划交付小说药物直接进入机器灌注电路(24,25]。直到现在,保护作用的治疗性常温EVHP结合厘米保存以便心里并没有被研究过。
因此,在当前的研究中,我们探讨了护心的潜力性常温EVHP结合厘米治疗方法的(在我们的老鼠模型26]。我们假设的结合性常温EVHP和CM治疗可能是一个新颖而承诺捐赠的心脏保护策略来改善心肌I / R损伤和改善心脏功能以便决定心,从而增加心脏移植的移植移植数量。
2。材料和方法
2.1。动物
男性无菌Sprague-Dawley老鼠从查尔斯河实验室购买(中国,北京)和驯化前1周的实验。所有的动物得到照顾按照指南的护理和使用实验动物(国立卫生研究院出版85 - 23号1996年修订)。实验伦理委员会批准的协议了,实验动物研究中心的南方医科大学南方医院。老鼠们被安置在一致的温度( °C)房间12-12小时暗光周期和被给予食物和水消毒。
2.2。隔离和骨髓间充质干细胞的文化
骨髓间充质干细胞(bmsc)获得雄性老鼠的骨髓(8-week-old)。短暂,过量戊巴比妥钠(100毫克/公斤)被用来使安乐死老鼠腹腔内注射。分离骨髓、股骨和胫骨刷新了磷酸盐(PBS、Meilunbio、大连,中国)。bmsc停牌MEMα基本(1 x) (αmem、Gibco大岛屿,美国)补充1% penicillin-streptomycin(美国大岛屿Gibco)和10%胎牛血清(美国大岛屿Gibco),然后培养在37°C公司为5%2。当达到80% confluency,主文化亚文化的比率1:2。在接下来的实验中,只使用bmsc的第三段。
2.3。准备BMSCs-CM和灌流液
的简化示意图BMSCs-CM收集协议如图1。confluency bmsc超过80%后在第三个通道,媒介是吸气,然后,bmsc与PBS洗3次。然后,αmem与bmsc添加到培养瓶,和培养瓶放在孵化器不断在37°C。孵化24小时后,主要厘米是收集和集中到15倍顺序通过超滤单元5000 g 2 h在4°C。最后,300年μlαmem (DCD-Control组)或BMSCs-CM (DCD-CM集团)添加到12毫升blood-based灌流液。
2.4。抗体阵列
67 g系列大鼠细胞因子数组(美国亚特兰大RadBiotech)是用于检测67的相对表达目标蛋白质在CM中。
2.5。实验设计
24男性Sprague-Dawley老鼠(8 - 12个月;200 - 300 g)被用作心脏捐献者,老鼠,和另一个24男性Sprague-Dawley老鼠(12 15-week-old;300 - 400克)介绍了献血者准备blood-based灌流液性常温EVHP系统。所有的捐赠的心被性常温保存EVHP系统。心脏功能评估EVHP期间。结束的时候性常温EVHP操作,心脏组织收集评估细胞凋亡水平,氧化应激和炎症反应(图2)。
心脏供体老鼠被随机分为两组:(1)DCD-Control组和(2)DCD-CM组。心与性常温EVHP系统保存DCD计划前105分钟,老鼠遭受DCD计划的过程和25分钟温暖的缺血损伤。20毫升冷Custodiol cardioplegic解决方案是用来灌注DCD计划的心。启动性常温EVHP之前,300年μl CM或αmem是添加到20毫升blood-based灌流液。除此之外,从心跳老鼠non-DCD心直接收获,心脏组织立即被收集。
2.6。手术过程
2.6.1。麻醉
戊巴比妥钠(60毫克/公斤,腹腔内)被用来麻醉Sprague-Dawley老鼠。适当的麻醉深度是由踏板前反射实验。老鼠放在加热垫保持体温。
2.6.2。收获捐赠者的血液
腹部动脉插入了2英寸,18 G输液导管。导管连接到20毫升注射器,包含1250 IU肝素和用于撤回9毫升血液。的blood-based灌流液由胰岛素(160 IU / l;诺和诺德公司;丹麦)、甲强龙琥珀酸钠(500 mg / l;辉瑞公司;比利时;瑞士)、甘露醇(25 g / l), 6毫升Krebs-Henseleit修改解决方案(117毫米氯化钠,葡萄糖10毫米,4.5毫米氯化钾,1.2毫米不2警察丁,NaHCO 25毫米3,0.512毫米MgCl2CaCl, 2毫米2),9毫升血液退出供体血鼠。的blood-based灌流液添加到灌注电路然后为15分钟,含氧和PaO2维持在150 - 250毫米汞柱。
2.6.3。收获的供体心脏
16 G, 2英寸输液导管插管到气管切开术后的气管,和老鼠机械通风。右颈动脉插管的22 G, 1英寸输液导管实时血压监测、注射肝素和交付的Custodiol cardioplegic解决方案。之前死循环的感应,肝素(2000 IU /公斤体重)是通过对颈动脉注射肝素化心脏捐献者,老鼠。
下面的论证过程进行DCD-Control和DCD-CM组的老鼠。简而言之,循环引起的死亡是与蚊子钳夹紧气管。空心的导管进入右颈动脉被连接到先生的压力。死循环可以完成当观察心搏停止或收缩压低于30毫米汞柱24,25]。25分钟后热缺血时间(智慧,相当于不干涉),执行胸骨切开术,主动脉弓之间左颈总动脉和夹头臂动脉干。下腔静脉后被切断,左心房打开,20毫升冷Custodiol cardioplegic解决方案在恒压灌注到民国的心(60毫米汞柱)通过正确的颈动脉,和民国的心放进冰。主动脉远端肺动脉及左锁骨下动脉被切断,分别。逮捕的心脏切除,然后14 G自制主动脉导管插管。
2.6.4。EVHP的操作
性常温ESHP系统包括一个氧合器(Micro-1鼠氧合器;中国),东莞Kewei microperistaltic泵(BT101L铅液;中国),一个水库,16 #聚乙烯管材,注入注射泵(Perfusor-space;b·布劳恩,德国)用于肾上腺素的政府,和自制的水浴箱,包括水、搅拌器、加热器、主动脉插管,控温开关。湿润气体混合物中包含了95%的O2/ 5%股份有限公司2用于气体氧合器。
之前描述的详细性常温EVHP协议(26]。短暂,EVHP系统被连接到供体心脏主动脉插管。水库部分被淹没在水中的水浴箱,和孤立的心将低于水的水平面。保持的温度流入第35 - 37和孤立的心°C,保温袋用于包装薄膜氧合器,和盒子里的水温控制在41-42°C。性常温EVHP灌注率的是初2毫升/分钟,和目标灌注率(1毫升/体重100克/分钟)是慢慢在10分钟内到达。经过15分钟的稳定时间,肾上腺素( 毫克/公斤体重/ h)是通过注入注射器注入泵。第35 - 37孤立的心的温度维持在°C和PaO2在150 - 250毫米汞柱性常温EVHP期间。灌流液的补充是40μl 5%的碳酸氢钠溶液和20μl 50%葡萄糖溶液每15分钟。
2.6.5。在EVHP心脏功能评估
最后15分钟的稳定时间,乳胶气球连接到一个压力传感器插入到通过左心房左心室。评估阶段的开头(T0), 0.15毫升的生理盐水慢慢注入气球的脑室压力测量心脏捐献者,每30分钟(诸如T30, T60, T90)。心脏移植的心脏功能参数EVHP期间包括开发压力(收缩压-舒张期压力,DP)、心率(HR)、最大左心室压力的上升速度( ),和最大压力下降率( )。
2.6.6。样品收集
两个1 - 2毫米厚心室片按顺序收集105分钟后沿长轴EVHP。第一个心肌组织从顶点是用于免疫印迹和免疫组织化学的第二个和组织学分析。
2.6.7。氧化应激
免疫组织化学分析确定的表达4-hydroxynonenal (HNE)作为氧化应激的指标。
2.6.8。炎症反应
肿瘤坏死因子的表达α(肿瘤坏死因子-α),核因子kappa-B p65 (NF -κBp65)和白细胞介素- 6 (il - 6)通过免疫组织化学方法测定。的表达髓过氧化酶(MPO)被免疫印迹分析。
2.6.9。免疫组织化学
后固定在多聚甲醛溶液(4%)、心肌组织嵌入在石蜡,然后切成4 -μ米厚的部分。肿瘤坏死因子-的免疫反应性α(1:200年,Abcam ab109322、美国),il - 6(1: 500年,Abcam ab9324,美国),HNE(1: 1000年,Abcam ab46545,美国),和NF -κProteintech B p65(1: 500年,66535年,中国)评估。可视化Diaminobenzidine反应抗原抗体反应。每个片被随机选择的字段和记录下盲目传统光学显微镜。Image-Pro +软件(美国媒体控制论)被用来执行图像分析。四个不重叠的和随机领域的评估进行的心脏组织。每只动物的平均值计算。TNF的表达α,il - 6、HNE和NF -κB p65测量通过计算集成光密度(IOD)。
首款。细胞凋亡
dna链断裂的供心的检测是通过末端转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色。TUNEL-positive细胞的数量在荧光显微镜下计数。心肌细胞凋亡率的代表是4的比例 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) tunel double-labeled核核的总数与DAPI染色。的表达裂解caspase-3, b细胞lymphoma-2 (Bcl2)和Bcl2-associated X蛋白(伯灵顿)被西方墨点法测量。
2.6.11。西方墨点法
目标蛋白的表达在供体心脏被西方墨点法评估。MPO的表达(美国Abcam 1: 250稀释,ab65871),裂解caspase-3(1: 1000稀释、9664、细胞信号技术生物试剂(上海)有限公司,中国),Bcl2 (Proteintech 1: 4000稀释,60178年,美国),伯灵顿(Proteintech 1: 8000稀释,60267年,中国),和细胞色素c(1: 1000稀释,146 f3、细胞信号技术生物试剂(上海)有限公司,中国)评估。
2.6.12。统计分析
结果表示为 的意思(SEM)。通过GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析(GraphPad软件公司,圣地亚哥,美国)。的常态Shapiro-Wilk测试之前测试的数据统计测试应用。用单向方差分析进行多重比较图基的事后测试紧随其后。如果没有正常的数据测试,非参数克鲁斯卡尔-沃利斯检验其次是邓恩的事后测试使用。双向方差分析进行比较分析脑室压力测量记录在不同时间点之间DCD-Control和DCD-CM组。的值 被认为是具有统计学意义。
3所示。结果
3.1。蛋白质制成的CM描述
基于抗体的蛋白质阵列分析表明,可溶性分泌的生物活性因子的bmsc包括粘附分子、细胞因子/趋化因子、生长因子和其他蛋白质(图3)。其中,至少14生物活性因素参与氧化应激、细胞凋亡和炎症(表1)。
3.2。性常温EVHP结合厘米治疗改善心脏功能损伤DCD计划的心
如图4显示,与DCD-Control组相比,添加BMSCs-CM EVHP系统导致显著增加DP (T0 T90,图4 (b)), (从T0 T90图4 (c)), (从T0 T90图4 (d)),这表明,CM治疗可以保护心脏功能以便从温暖的心缺血/再灌注损伤。然而,在心率两组之间无显著差异(T0 T90,图4(一))。
(一)
(b)
(c)
(d)
3.3。治疗性常温EVHP结合厘米心DCD计划减少氧化应激和炎症
评价心肌炎症反应,HNE的表达,il - 6、TNF -α和NF -κB在心肌组织通过免疫组织化学方法,检测和分析了MPO的表达蛋白免疫印迹。与non-DCD心相比,HNE的表达(图5(一)),il - 6(图5(b)), TNF -α(图5(c)), NF -κB(图5(d))和MPO(图6DCD-Control组)显著增加,这意味着温暖的缺血/再灌注损伤可能增加心肌细胞凋亡,氧化应激,炎症在民国的心。然而,与DCD-Control组相比,CM治疗显著降低HNE的表达,il - 6、TNF -α和NF -κB在民国心DCD-CM组(图5)。然而,差异无显著意义的表达MPO DCD-Control和DCD-CM组(图6)。
(一)
(b)
3.4。性常温EVHP结合厘米治疗减少心肌细胞凋亡在民国的心
TUNEL染色法进行评估心肌的细胞凋亡。的表达裂解caspase-3,伯灵顿,细胞色素c, Bcl2被免疫印迹检测。作为数据6和7显示,与non-DCD心相比,TUNEL-positive核的数量和裂解的表达caspase-3,伯灵顿,细胞色素c显著增加,Bcl2 DCD-Control组显著减少的表达。然而,与DCD-Control组相比,CM治疗显著降低TUNEL-positive核的数量和裂解的表达caspase-3,伯灵顿,细胞色素c,建议厘米治疗减少心肌细胞凋亡在民国的心。没有发现显著差异表达的Bcl2 DCD-Control和DCD-CM团体之间。
(一)
(b)
4所示。讨论
目前的研究表明,性常温EVHP结合厘米治疗可能是一个小说,并承诺以便心脏保护策略,从而减轻心肌I / R损伤大鼠心,DCD计划显示EVHP期间改善心脏功能,减少心肌细胞凋亡水平,炎症和氧化应激后的心DCD计划EVHP时期。
在当前,以便决定心脏移植已收到大量的注意力在过去的15年27),这个有前途的临床策略可以显著扩大供体池(28]。然而,使用方法的心被严重阻碍了I / R损伤结果的固有热缺血损伤(29日]。性常温EVHP正在成为一个有吸引力的和开拓性战略以便保护的心。与传统的静态冷藏方法不同,性常温EVHP可以保留捐赠心脏灌注,semiphysiologic状态(30.),它可以提供一个全面评估心脏捐献者,生存能力的31日]和供体心脏的修复机器灌注与干细胞,基因和药物治疗(32]。符合这个理论,我们之前的研究(13)表明,性常温EVHP结合减褪黑激素治疗心肌I / R损伤的心DCD计划通过抑制NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis。因此,性常温EVHP结合小说药理剂治疗有望使越来越多的DCD计划的心脏移植。
最近的研究表明,保护CM-enriched cardioplegic解决方案减轻心肌I / R损伤和改善心脏功能具有重要的捐助者的心在大鼠心脏移植模型(18,19,33]。bmsc释放许多种类的生物活性因子,包括趋化因子、生物活性脂质,代谢物,细胞因子,生长因子,可能占心血管效应的一些观察。在最近的研究中,CM的描述基于抗体的蛋白质组分析表明Decorin(宽带),激活素A, Galectin-1, TIMP-1, VEGF-A可能参与了心脏保护和改善心脏功能。
Decorin,细胞外基质(ECM)蛋白多糖的组成部分,具有强大的抗炎,antifibrotic,反血管增生和抗氧化性能34]。它已经表明,decorin可能发挥心血管效应对I / R损伤(35]。此外,大岛渚等人表明,激活素抑制心肌细胞凋亡诱导的急性缺血和缺氧(36]。此外,Galectin-1被认为是心血管内稳态的关键中介由于其突出的抗炎,proangiogenic和procatabolic活动(37]。TIMP1调节器的血管生成、细胞凋亡和增殖38]。Singla麦当劳和玻璃Singla表明TIMP-1来源于胚胎干细胞改善心脏重建通过抑制心肌细胞凋亡心肌梗死后(39,40]。此外,沈阳市盲校等人发现VEGF-A发挥了重要作用心肌的修复伤口愈合招聘干细胞和减少心肌细胞凋亡41]。依照这些先前的研究,目前的数据表明,可溶性生物活性因素中确定厘米的鸡尾酒效应会减弱I / R损伤和改善心脏功能的心EVHP期间,建议性常温EVHP结合厘米治疗可能是一种有效的心脏保护DCD计划策略。然而,进一步调查才能阐明其他生物活性的作用因素中确定厘米源自bmsc对I / R损伤的DCD计划的心。
在心脏移植,温暖冷缺血和再灌注损伤不可避免地发生在心脏捐献者,从而导致PGD在移植的心脏。I / R损伤是一个关键的病理过程影响心脏移植的临床结果(42)由于ATP的缺失,细胞内钙超载,炎性细胞因子,ROS的生成和氧化应激43,44]。氧化应激、炎症和细胞凋亡被认为是参与I / R损伤的病理机制,导致组织损伤供体心脏。还存在细胞凋亡的重要介质。的激活caspase-3(其裂解形式的存在)是一种细胞凋亡率的可靠指标,从而导致蛋白质基质的乳沟和凋亡的DNA碎片(45]。在目前的研究中,25分钟热缺血损伤显著增加氧化应激水平(HNE表达的增加),炎症(TNF的表达增加αil - 6, NF -κB, MPO)和细胞凋亡(伯灵顿的表达增加,caspase-3裂解,细胞色素c DNA链断裂,和减少表达Bcl2)在民国的心。然而,与DCD-Control组相比,治疗性常温EVHP结合厘米降低氧化应激水平(HNE)的表达减少,炎症(降低TNF的表达α、il - 6和NF -κB)和细胞凋亡(减少的伯灵顿的表达,caspase-3裂解,细胞色素c)和DNA链断裂的民国EVHP后心脏。因此,治疗性常温EVHP结合厘米可以保护心脏DCD计划对I / R创伤性移植功能障碍通过抑制氧化应激,炎症和细胞凋亡。
一些局限性在目前研究中需要澄清。首先,CM的灌流液的浓度EVHP系统上下文中可能不是最优的心脏保护。因此,有必要设计不同浓度的CM确保未来的研究更合适的浓度。其次,它会更临床相关的调查以便心脏移植后心脏功能的老鼠心脏移植模型。第三,本研究无法准确识别信号通路或特定细胞因子的保护作用负责厘米保护的心。充分理解其确切机制,未来实验研究应通过抑制或overexpressing的一些特定的细胞因子和信号通路。
5。结论
总之,目前的研究表明,性常温EVHP结合厘米治疗显著减弱心脏功能障碍对I / R损伤鼠的心,DCD计划部分通过减少氧化应激、细胞凋亡、炎症反应。针对临床,结合性常温EVHP和CM治疗可能是一个小说,并承诺以便心脏保护策略,从而增加移植移植在心脏移植的数量。
数据可用性
原始数据支持了本文的结论将由作者提供,没有过度的预订。
伦理批准
所有程序和处理动物在综述了调查和动物实验中心伦理委员会批准的南方医科大学南方医院。
的利益冲突
作者声明,这项研究是在没有进行任何商业或财务关系可能被视为一个潜在的利益冲突。
作者的贡献
Z.Z.,L.X., Y.X., and Y.R. performed the experiments, analyzed the data, and participated in the writing of the manuscript. Z.Z., Y.X., P.Z., J.L., and C.N. conducted the experiments and collected the data. S.Z., P.Z., and Z.X. designed the experiments and revised the manuscript. The authors read and approved the final manuscript. Zifeng Zeng, Liwei Xu, Yu Xu, and Yongsheng Ruan have contributed equally to this work and share the first authorship.
确认
这项研究支持由中国国家自然科学基金(82170274,82170274,82270410),广东基础研究和应用基础研究基金会(2022 a1515011747 SL2023A04J01841),广州主要研发项目(202206010065),广东省国际科技合作项目(2022 a0505050036),广州科技计划项目(202201011317),和总统基金会的南方医院、南方医科大学(2019 c030和2021 b020)。所有数据修改Servier医学艺术(http://smart.servier.com/),下许可的创造性的常见的归因3.0通用许可证(https://creativecommons.org/licenses/by/3.0/由Figdraw)或。