文摘

背景。传统干预可以扮演特定角色衰减溃疡性结肠炎(UC),被称为一种炎性肠道疾病,但有时并不是有效的。子宫内膜再生细胞(伦理委员会)已经被证明对不同型号的炎症,免疫抑制效应和条件媒体(CM)干细胞在细胞疗法的优势容易访问和直接的行动。然而,ERC-CM能否减轻结肠炎尚不清楚,本研究将探讨。方法。经血是来自健康的女性志愿者获得伦理委员会和ERC-CM。急性结肠炎诱导3%葡聚糖硫酸钠(DSS), ERC-CM注入在天4,6,8,分别后归纳。疾病活动指数计算通过体重变化的记录,出血,大便在治疗过程中粘度。组织学特性,巨噬细胞和CD4细胞⁺在脾脏T细胞和结肠癌,测量血清和结肠癌细胞因子的概要文件。此外,一个在体外淋巴细胞增殖试验测定在这项研究中使用CCK-8工具包。结果。ERC-CM治疗显著改善小鼠结肠炎的症状和组织学变化。ERC-CM亚群比例增加脾脏和结肠癌但M1的百分比减少巨噬细胞和Th1和Th17细胞在脾脏和结肠Th17细胞的人口减少。此外,ERC-CM治疗降低TNF -当地的表达式α在结肠、il - 6和进气阀打开。此外,ERC-CM增加抗炎细胞因子il - 10的水平和IL-27但减少促炎细胞因子il - 6和IL-17血清。此外,ERC-CM显著抑制ConA-induced小鼠淋巴细胞增殖在体外。结论。结果表明ERC-CM可以产生相似的治疗效果可以探索伦理委员会和未来应用脱细胞疗法治疗结肠炎。

1。介绍

溃疡性结肠炎(UC)以来,一种类型的炎症性肠病(IBD),另一种类型是克罗恩病)发病机理不明,正式成立于1875年,在加州大学医学研究已经逐渐加剧(1]。溃疡性结肠炎的发病机制非常复杂,涉及遗传因素(2),肠道微生物因素(3),和肠上皮屏障功能障碍(4]。被认为是天然免疫与适应性免疫发病机制中发挥重要作用的加州大学(5]。尽管有许多可供UC治疗策略,如传统药物(mesalamine、糖皮质激素和thiopurines) (6)、生物治疗(7,8),和饮食疗法9,10),然而,长期使用免疫抑制和抗炎药物会增加感染的风险和某些恶性肿瘤(11]。不幸的是,许多患者中度到重度溃疡性结肠炎最终不可避免地需要手术。近年来,炎症性肠病的治疗已从简单地控制症状转为正常化血液标记,完成粘膜愈合,症状消失(12]。然而,许多现有的处理方法不能满足病人的需要。因此,迫切需要一种新型治疗溃疡性结肠炎。

子宫内膜再生细胞(伦理委员会)经血扮演作为一种新型的成体干细胞来源,不仅有潜在的自我更新13),间充质干细胞(MSC)像表型(14),和免疫调制(15),但也有noninvasiveness的独特优势,相对无限的来源,增殖能力强,避免道德问题(16,17]。我们和其他人的先前的研究已经表明,伦理委员会可能在急性肝炎和其他调节免疫内稳态模型,如异位心脏移植和肾缺血再灌注损伤小鼠通过不同的途径18- - - - - -22]。在溃疡性结肠炎,伦理委员会不仅可以调节结肠炎也被修改为更好的疗效[21,23]。

尽管越来越感兴趣msc、MSC-based策略仍然存在的一些局限性;例如,大多数细胞被注入的复杂网络导致肺弱效率(24]。更严重的是血栓形成的可能性与细胞政府和其他风险,如心律失常、骨化,钙化(25,26]。此外,一些干细胞冷冻保存协议可能会使更少的功能和可行的(27]。所有这些颗粒制剂的效果和可以避免的担忧。越来越多的研究表明,msc的疗效不仅由于细胞间直接接触,还分泌细胞因子,趋化因子,生长因子,细胞外囊泡,等等。因此,由于msc的特点和存在的各种限制,颗粒治疗策略在上升,有几个优点在细胞疗法,因为他们可以获得更容易、更经济和可以生产,包装,运输直接(28,最重要的是,他们不会被拒绝。分泌蛋白,EVs和自由从msc、线粒体中可以找到条件培养液(CM)可能产生类似的治疗功能,细胞治疗。此外,CM-based疗法已被确定是功能在治疗许多炎症性疾病如肝衰竭和急性肺损伤(29日,30.]。然而,ERC-CM能否对实验性结肠炎起到治疗作用尚不清楚。因此,在目前的研究中,ERC-CM的影响减轻结肠炎小鼠系统性地探讨。

2。材料和方法

2.1。隔离和伦理委员会的识别

经血是来自健康育龄女性志愿者。所有操作对人类的伦理委员会批准天津医科大学总医院(irb2021 - wz - 116)。提取进行了伦理委员会的协议如前所述[19]。短暂,月经杯是插入到阴道了4个小时,然后删除,和收集经血被用于混浊层细胞收集的标准聚蔗糖法,然后悬浮在杜尔贝科修改鹰的介质有10%胎牛血清(HyClone)和1%青霉素、链霉素和培养皿培养37°C和5%孵化器有限公司₂条件。当伦理委员会会长到通道3 (P3),形态和表面标记(CD90、CD105、CD45、CD79a HLA-DR)伦理委员会被确定显微镜和流式细胞术,分别为(22,23,31日]。

2.2。制备ERC-CM

伦理委员会在常规形状和好的P4-P5被选中的状态,和无血清培养基(中国NC0103 Yokon)取代直到80% confluency然后收集后48 h。接下来,细胞培养基,细胞碎片等杂质被清除通过离心(3000 r / min, 20分钟),集中20倍使用超滤离心过滤装置(美国Billerica的微孔,MA)的分子量截止值3 kDa然后消毒过滤通过0.22μm离心过滤器(美国微孔,Billerica的)。集中配置管理存储在-80°C进行进一步的治疗在活的有机体内。

2.3。和实验动物组

雄性老鼠重22 - 25 g在这个实验中是购自中国国家食品和药物控制机构和被放置在标准饲养环境标准提供饮食和水在动物保健功能天津普通外科研究所。动物实验操作都是通过研究所的动物保健和使用委员会天津医科大学总医院和执行按照指南的护理和使用实验动物(irb2021 - wz - 116)。

急性结肠炎诱导在BALB / C小鼠(图1(一))接受3%葡聚糖硫酸酯钠(中国YEASEN DSS)饮用水消耗了7天,然后正常水3天。24小鼠随机分为四组( ):(我)天真的正常老鼠饮用蒸馏水为10天(正常组),(2)DSS-induced结肠炎小鼠没有任何治疗(治疗组),(3)DSS-induced结肠炎小鼠腹腔注射300μl正常的无血清培养基(天4、6和8)车辆控制(车辆组),和(IV) DSS-induced结肠炎小鼠腹腔注射300μl (ERC-CM(天4、6和8)(ERC-CM组)。老鼠监控和记录每天的体重变化,粪便一致性,在粪便和血液疾病活动指数(DAI)计算基于标准标准(32]。老鼠牺牲,样本收集(脾、结肠和血清)在第十天从一开始就进行进一步分析。

2.4。病理检查

结肠组织固定在10%福尔马林48小时然后脱水,石蜡包埋,切成5μ米部分苏木精和伊红染色())。组织病理学评分进行评估和计算,在先前的研究33]记录基于以下标准:(一)炎症严重程度:0(没有),1(轻微),2(温和的)和3(严重);(b)的深度损伤:0(没有),1(粘膜),2(粘膜和粘膜下层的),和3(透壁的);(c)地下室伤害:0(没有),1(基底1/3损伤),2(基底2/3损伤),3(地穴失去,只有表面上皮完整)和4(整个隐窝上皮细胞失去了);和(d)百分比参与:1(1 - 25%),2(26 - 50%),3(51 - 75%)和4 (76 - 100%)。

2.5。免疫组织化学染色

免疫组织化学染色法被用来分析TNF的表达α在炎症性肠、il - 6和进气阀打开。首先,片,洗水后,切片被淹没在一个适当的EDTA溶液和沉浸在100°C水浴15分钟实现抗原检索。其次,消除内源性过氧化物酶后用3%过氧化氢为30分钟,10%的非特异性抗体吸附被山羊血清30分钟,然后,细胞被孵化与主要抗体TNF -α(1:400年,Abcam ab92486、英国),il - 6(1: 800年,Abcam ab6672,英国),和伊诺(1:1000年,Abcam ab283655,英国),分别在4°C。接下来,与PBS的部分被洗了三次,增加了反应剂在室温下一滴一滴地和孵化20分钟,然后孵化与anti-rabbit IgG抗体(中山金桥、pv - 9000、中国)在室温下另一个20分钟。最后,与刚做好的民建联孵化的部分解决方案(中山金桥,zli——9018年,中国)清洗后,和苏木精核染色,然后添加一滴一滴地扫描图像分析。ImageJ软件被用来分析图像。

2.6。制备固有层单核细胞和脾细胞悬液

隔离小鼠固有层单核细胞从结肠组织指导下进行描述(34,35]。短暂、粘液和结肠上皮细胞被从新鲜标本在连续的步骤与二硫苏糖醇(中国D8220德勤,Solarbio)和乙二胺四乙酸(EDTA, Solarbio E8040,中国),其次是与胶原酶消化四世(400 U /毫升,Solarbio C8160,中国)和脱氧核糖核酸酶(0.15毫克/毫升,Solarbio D8071,中国)为90分钟37°C。细胞沉淀与4毫升40% resuspended Percoll (Cytiva,美国),然后,2.5毫升80% Percoll慢慢添加到离心管的底部。LPMCs在1000 g密度梯度离心获得的20分钟,然后用PBS。

小鼠脾脏地面分开,脾细胞悬液溶解后得到红细胞。洗两次后,调整细胞浓度 与PBS的解决方案。

2.7。流式细胞术分析

不同的免疫细胞识别使用流式细胞仪。流式细胞术单克隆抗体和实验试剂用于从BioLegend或eBioscience购买公司,主要包括僵尸NIR™染料(死/活试剂),anti-mouse CD4 (FITC-labelled)、干扰素-γ(PE-labelled) IL-17 (Percp-labelled)、CD25 (PE-labelled), Foxp3 (APC-labelled) CD11b (FITC-labelled) F4/80 (APC-labelled)和CD86 Percp-labelled Th1细胞(CD4检测⁺干扰素-γ⁺),Th17细胞(CD4细胞⁺IL-17a⁺),(CD4细胞亚群⁺CD25⁺Foxp3⁺巨噬细胞)和M1 (CD11b⁺F4/80⁺CD86⁺在脾脏和/或肠。额外的,细胞内染色协议进行了如前所述[21]。此外,准确地识别Th1和Th17脾细胞和结肠LPMCs首先coincubated为6小时刺激器,分别,紧随其后的是荧光抗体染色。

2.8。酶联免疫吸附试验(ELISA)

老鼠牺牲后10天DSS诱导后,血液收集得到血清。il - 10的水平、IL-27 IL-17,血清il - 6的被用来评估炎症状态和测量使用相应的ELISA试剂盒(DAKEWE,北京),和细节进行根据制造商的指示。

2.9。在体外扩散分析

淋巴细胞的增殖反应ConA测量使用CCK-8工具包。简单地说,BALB / c脾细胞悬液( 细胞/)与ConA培养(20μg / ml)的ERC-CM表示浓度。文化孕育了72 h, 10μl (CCK-8结束之前被添加到每个文化,和OD_450海里被记录。

2.10。统计数据

数据显示在这项研究中被表示为 ,和多个组之间的差异进行了分析使用单向方差分析(方差分析);GraphPad棱镜8软件应用。在整个文本、数字和传说,以下术语用来表示统计学意义: , , ,和 。

3所示。结果

3.1。描述伦理委员会

在P3,伦理委员会展出纺锤状,呈形态和克隆形成能力(图2(一个))。伦理委员会以流式细胞仪显示的高表达CD90 CD45和CD105和低表达,CD79a,和HLA-DR与msc的表现型(图一致2 (b))。

3.2。ERC-CM减毒症状DSS-Induced实验性结肠炎

BALB / C小鼠遭受严重的结肠炎引起的DSS(图1(一))的特点是减肥,腹泻带血,戴一般增加饮用蒸馏水包含3% DSS(数据1 (b)- - - - - -1 (d))。冒号收集来自不同群体表现出不同的长度,和结肠ERC-CM集团似乎比这长得多的时间治疗和/或车辆组(ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )。这个结果暗示ERC-CM可能大大减弱结肠的缩短(数字1 (e)- - - - - -1 (f))。

3.3。ERC-CM显著减轻结肠炎结肠损伤

组织病理学变化评估结肠部分的苏木精和伊红染色。粘膜结构失调、炎症细胞浸润,上皮细胞,和结构破坏的地下室非常强烈的治疗组和工具组,而这些变化ERC-CM治疗组明显减弱。组织病理学评分被用来评估损失,ERC-CM组的得分显著低于未经处理的车辆和/或组(ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )(数据3(一个)和3 (b))。

3.4。ERC-CM Th1细胞的百分比减少,Th17细胞,巨噬细胞M1,但增加的百分比treg DSS-Induced结肠炎小鼠的脾脏

确定ERC-CM的免疫调节作用,脾细胞制备和染色进行分析。如数据所示4(一)和4 (c)M1巨噬细胞的百分比,Th1细胞,Th17细胞增加ERC-CM治疗后治疗组显著减少(图4 (d)M1: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, ;图4 (g)Th1: ERC-CM组vs。组, ;ERC-CMvs。车, ;图4 (f)Th17: ERC-CMvs。如果不治疗, ;ERC-CMvs。车, )。此外,Treg种群在未经处理的呈下降趋势和/或车辆组而是ERC-CM治疗后(ERC-CM组明显增加vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )(数据4 (b)和4 (e))。这表明ERC-CM成功地执行一个免疫调节功能。

3.5。ERC-CM Th17的比例减少,但增加的百分比亚群在结肠

加州大学已被证明是由过度激活缺乏Th17细胞亚群(32]。为此,Th17和亚群CD4的表达⁺T细胞通过流式细胞术分析。正如预期的那样,Th17细胞在固有层的积累的重要治疗组小鼠比正常组小鼠和治疗组(ERC-CM组相对较少vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )(数据5 (b)和5 (d))。相比之下,亚群的数量在固有层异常表达下调的治疗组比正常组小鼠和治疗组(ERC-CM组显著增加vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。车, )(数据5(一个)和5 (c))。在此基础上观察,Th17细胞亚群的规定在固有层ERC-CM可能与结肠炎的提高。

3.6。ERC-CM减少促炎细胞因子水平和巨噬细胞浸润在结肠

检测的监管效果ERC-CM促炎细胞因子和炎症细胞在结肠,我们检测TNF的表达α通过免疫组织化学、il - 6和M1巨噬细胞。如数据所示6(一)和6 (b)肿瘤坏死因子-α和il - 6治疗组显著增加,但减少ERC-CM治疗后(图6 (d)肿瘤坏死因子-α:ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, ;图6 (e)il - 6: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )。同样,如图6 (c)和6 (f)M1巨噬细胞(进气阀打开⁺细胞)显示显著浸润ERC-CM治疗后治疗组和减少(ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )。

3.7。ERC-CM调节血清中细胞因子水平

进一步评估细胞因子在小鼠,我们从血清进行单独分析。值得注意的是,促炎细胞因子il - 6和IL-17都增加,而抗炎细胞因子il - 10和IL-27降低了治疗组血清(数字7(一)- - - - - -7 (d))。ERC-CM治疗后,上述情况是相反(il - 6: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, ;IL-17: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, ;il - 10: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, ;和IL-27: ERC-CM组vs。治疗组, ;ERC-CM集团vs。汽车集团, )。这表明,治疗改善ERC-CM与小鼠炎性细胞因子水平的变化。

3.8。ERC-CM抑制淋巴细胞的增殖在体外

评估ERC-CM的免疫抑制作用在体外脾细胞增殖试验进行。如图8,ERC-CM可以抑制淋巴细胞增殖在体外与车辆控制(ERC-CM组vs。汽车集团, )。ERC-CM显著抑制ConA-induced小鼠脾细胞增殖。

4所示。讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎性疾病,瘟疫世界,目前有效的治疗策略仍有待探讨。在这项研究中,饮酒所致急性结肠炎成功3% DSS在BALB / c小鼠和与临床症状。接受不同的治疗后,一些变化不同表现出不同的组织;结肠炎的症状明显减毒ERC-CM组。此外,病理变化,局部炎症细胞浸润,结肠和促炎的蛋白质表达,以及血清促炎细胞因子水平,显著改善ERC-CM-treated组相比与车辆和/或未经治疗的团体,这表明ERC-CM能有效治疗结肠炎起到治疗作用。此外,在体外化验显示,ERC-CM有效地抑制淋巴细胞增殖。

越来越多的研究表明,msc发挥他们的疗效不仅依赖的方式接触到细胞也在旁分泌活动,线粒体转移,等旁分泌功能,另一方面,不可避免地与微泡的分泌和细胞因子通过msc (36,37]。等msc、各种细胞因子分泌的胰岛素样生长因子- 1 (igf - 1)、血管内皮生长因子(VEGF)、il - 10, TGF -β参与组织修复和免疫细胞的规定(38- - - - - -40]。这些细胞外囊泡和细胞因子是包含在厘米在体外。与细胞疗法相比,使用厘米可以更准确地控制剂量,和细胞系可用于大规模生产没有侵入性提取程序的病人,可以节省时间和成本(41]。CM徒以更直接的方式,不同的细胞可能会被各种宿主防御机制。此外,细胞因子仅是昂贵的和可能会夸大炎性反应。因此,许多不同的因素的结合是最好的治疗方式42]。的媒体可以满足这样的条件。先天和适应性免疫被认为是溃疡性结肠炎的发病机制中发挥重要作用。其中,T细胞和巨噬细胞是主要的球员5,众所周知,Th1细胞等细胞,Th17细胞,巨噬细胞M1和他们分泌的细胞因子,如干扰素-α,IL-17 il - 6和TNF -α,参与加州大学的发病机制43,44]。众所周知,CD4细胞⁺T细胞(Th1细胞,Th17细胞亚群需要加州大学和他们维持肠道内稳态平衡是至关重要的。在炎症环境中,Th0细胞转换为炎症Th1和Th17细胞,导致驾驶结肠炎的初始阶段。促炎细胞因子的释放不仅招募中性粒细胞受损区域也促进更多的促炎细胞因子生产通过负反馈调节机制。亚群作为关键有效的抑制自身免疫性疾病,不仅抑制Th0细胞的增殖在体外和在活的有机体内(45)也发挥其功能通过产生免疫调节细胞因子,如il - 10和TGF -β(46]。此外,先前的证据表明,纯化treg阻止了天真的CD4细胞⁺SCID小鼠T细胞transfer-induced结肠炎(47]。正如上面提到的,破坏CD4之间的动态平衡⁺T细胞是参与结肠炎的发病机制,在UC患者值得注意的是,Th17细胞丰富和亚群是稀缺的,众所周知,Th17细胞亚群之间的平衡可能是一个潜在的监管目标,改善结肠炎模型(48,49]。巨噬细胞占肠道免疫细胞的大部分,他们可以启动和协调的免疫反应对外国机构违反了上皮屏障(50]。在炎症条件下,血液单核细胞/巨噬细胞转变成一个促炎的表型和生产大量的炎性细胞因子il - 6和il - 12等,通常称为经典激活巨噬细胞(例如,M1巨噬细胞)51]。

在目前的研究中,Th1细胞百分比,Th17细胞,和M1巨噬细胞显著增加脾脏和结肠DSS-induced结肠炎与正常小鼠相比,Th1细胞的结果一致,Th17细胞,巨噬细胞M1可能参与加州大学的发病机理。此外,百分比的亚群在脾脏和结肠增加ERC-CM-treated组与未经处理的和/或车辆组相比,这暗示ERC-CM的治疗效果。在体外实验还表明,ERC-CM施加影响淋巴细胞的数量的治疗效果。肠系膜淋巴结是一个重要的组织反应在肠道炎症,在我们未来的研究将进一步分析。炎症性肠病的各种致病途径可以相互作用,和细胞因子可以关联到其中任何一个52]。例如,il - 6产生STAT3信号通路的激活,调节多种基因参与细胞生存,细胞迁移,细胞凋亡(53]。确定ERC-CM改善结肠炎通过调节细胞因子的水平,一些细胞因子含量化验。我们的研究表明,促炎细胞因子il - 6、TNF -α,IL-17下降和抗炎细胞因子IL-27和il - 10 ERC-CM治疗后增加。值得注意的是,IL-27最初认为是促炎细胞因子,但IL-27信号的抗炎作用已经体现在许多最近的研究(54,55]。它已经表明,对Th1 IL-27有广泛的影响,Th2, Th17细胞以及亚(56]。这也验证了上述各种细胞的比率的变化。因此我们推断各种变化发生在结肠炎小鼠与多种细胞因子有关。

我们之前和其他人证明伦理委员会发挥治疗作用在各种疾病,包括加州大学(18,23];然而,无论是ERC-CM颗粒治疗结肠炎的衰减有强有力的影响仍然未知。基于之前的工作,据我们所知,我们是第一个探索ERC-CM在结肠炎的治疗效果。结果显示ERC-CM非常有前途的治疗前景。然而,仍存在一些问题,包括潜在的治疗机制,和厘米的策略来提高治疗效果需要进一步调查。

5。结论

这项研究的结果表明,ERC-CM显著减弱小鼠结肠炎,表明ERC-CM策略可以作为一种新颖的无细胞炎性肠道疾病的治疗中潜在的应用程序。

缩写

伦理委员会:	子宫内膜再生细胞
伊诺:	诱导一氧化氮合酶
TGF -β:	转化生长因子-β
igf - 1:	胰岛素样生长因子- 1
决策支持系统:	右旋糖酐硫酸酯钠
德勤:	二硫苏糖醇
EDTA:	乙二胺四乙酸
硕士:	间充质基质细胞
il - 6:	白细胞介素- 6
肿瘤坏死因子-α:	肿瘤坏死因子-α。

数据可用性

所有的数据都包含在这个手稿可以可用。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

秦Chenglu太阳,Jingpeng,和香港进行设计和研究,分析了数据,并起草了手稿。杨林朱,乡里,Baoren张这里秦,宏达Wang和李光明进行研究。王郝的构思和设计研究,提供行政和财政支持,并帮助修改手稿。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。Chenglu太阳,Jingpeng,和香港秦co-first作者在本文。

确认

这项工作是支持由中国国家自然科学基金(82071802),科技项目天津卫生委员会(没有。TJWJ2021MS004),李Jieshou肠道屏障研究专项基金(没有。LJS_201412)、天津市自然科学基金(18号jczdjc35800),孵化基金的天津医科大学总医院(ZYYFY2019011号和ZYYFY2019017)和天津卫生委员会(批准号RC20095)。