文摘

血管再生纸浆的组织的一个基本流程和挑战(代表)再生牙髓学的过程。在这方面,目前的研究旨在合成三氧化矿物骨料- (MTA)基础支架作为众议员的生物材料聚ε己内酯(PCL) /壳聚糖(CS) / MTA支架被红外光谱构建和评估,SEM, XRD和TGA分析。人牙髓干细胞的增殖和附着力(hDPSCs)评估这些支架通过扫描电子显微镜(SEM)和MTT检测,分别。血管生成标记的表达是研究基因和蛋白质水平实时聚合酶链反应和免疫印迹试验。我们的研究结果表明,获得适当的物理化学特征的支架可以适合众议员hDPSCs的粘附和增殖水平显著增加播种后PCL / CS / MTA支架。Tie2 VEGFR-2的表达水平,而基因在统计学上增加PCL / CS / MTA脚手架。支持这些发现,免疫印迹结果显示这些标记在蛋白质水平的upregulation PCL / CS / MTA支架( )。目前的研究结果表明,PCL / CS / MTA支架提供适当结构的粘附和增殖hDPSCs除了诱导这些细胞的血管生成过程。

1。介绍

坏死和炎症不成熟的恒牙的治疗被认为是一个具有挑战性的临床情况1]。最近,根结束与三氧化矿物骨料壁垒——(MTA)基础材料已经使用在这些情况下。然而,这种方法的局限性是应用的困难顶端停止,防止根发展,增加牙齿断裂的风险(2,3]。

为了克服这些局限性,介绍了再生牙髓学的过程(代表)作为一个有前途的方法完成复杂的再生(4- - - - - -6]。组织工程(TE)基本面,支架(作为一个载体和导电剂),干细胞(更新元素),和biofactors(如刺激器)是主要的组件代表的策略。此外,在代表,应提供适当的血管生成再生纸浆组织,根的延续发展,顶端关闭,增厚的牙质的墙壁5,7,8]。果肉组织是一个高度血管化组织牙质包围。由于这种架构完成复杂,血管生成过程在组织再生是具有挑战性的9]。

牙髓干细胞(DPSCs)多功能干细胞的细胞种类区完成复杂,能够分化成各种细胞类型的再生过程,促进髓组织(10,11]。

合适的脚手架作为另一个至关重要的部分代表应该构建一个三维微环境细胞渗透、迁移、粘附、增殖和分化。聚ε己内酯(PCL)是合成生物相容性和生物可降解材料在矿化能力,成功地用于象牙质和骨组织工程(12,13]。除了PCL,壳聚糖(CS),通常来源于虾和其他海洋甲壳类动物的壳,是一种天然多糖,广泛应用在组织工程支架(14]。这种聚合物具有较高的亲水性、生物相容性和生物降解性(15]。CS诱导矿化的能力,螯合,消炎抗菌效果,把它变成一个有效的梯度在牙髓组织再生(16,17]。此外,CS聚合物结合磷酸钙颗粒会导致矿化组织的形成(18]。

自1993年以来MTA用于牙髓学的治疗。这种钙silicate-based材料的应用在牙髓学的包括穿孔治疗,apexification不成熟的牙齿,和修复根突起的19,20.]。这种生物材料可以导致hDPSCs牙质生成(21]。然而,这种生物材料有着悠久的凝结时间和困难的处理和操作过程被认为是缺点(3]。此外,它没有多孔和相互联系的结构,这是必不可少的组织工程(22- - - - - -24]。MTA通常被认为是一个障碍材料,而不是在治疗牙髓学的脚手架。MTA并不是可吸收,这是一个做材料。因此,似乎包含这个生物材料支架的设计和制造提供一个更好的结构再生牙髓学的目的。因此,当前研究构建PCL / CS / MTA支架和评估他们的能力在hDPSCs诱导血管生成。

2。材料和方法

2.1。材料

聚ε己内酯(PCL)、胶原酶和戊二醛(25%)从Sigma-Aldrich有限公司购买(斯泰纳姆,德国)。CS从穿越化工有限公司提供的二甲亚砜(DMSO),氯仿、无水甲醇(甲醇),和醋酸从默克化工有限公司获得磷酸盐(PBS)、胎牛血清的边后卫,trypsin-EDTA解决方案,high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM / HG)、青霉素、链霉素和Gibco。3 -(溴化4 5-Dimethylthiazol-2-yl-2 5-diphenyltetrazolium) (MTT)粉从英杰公司(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德)。MTA (ProRoot MTA)获得Dentsply(塔尔萨,好吧)。

2.2。支架的制备

首先,准备5 wt % PCL溶液,PCL (70 - 90 kD,西格玛奥德里奇)溶解在冰醋酸,然后2 wt % c粉(250 kD,脱去乙酰基85%)添加到该解决方案。混合均质在20000 rpm的聚乙烯醇(PVA)作为表面活性剂数小时,直到一个清晰的、粘性解。准备PCL / CS / MTA样本,MTA (30 wt %,与聚合物总重量)添加和使用均质机均质。之后,在一夜之间解决方案被转移到一个模具和冷冻在-70°C。然后,被冻结的支架是冻干的在一个冷冻干燥器中脱至少2天完全移除溶剂。

2.3。支架评价和特征

MTA和PCL / CS之间的分子间的相互作用和相组成的支架进行评估通过傅里叶变换红外光谱(FTIR)和x射线衍射(XRD),分别。红外光谱测试是由张量27(力量、德国),化学学院,大不里士大学。准备样本,这些样本是首先涌入一个统一的粉一比一百纯溴化钾。粉是用平板电脑,放置在特殊的管子,光谱波数为400到4000厘米1都被记录下来。XRD测试是由力量发现8 x射线衍射仪(德国)40岁使用Cu-K kV和40 mAα辐射在一个2θ范围从5°- 78°。此外,热重分析(TGA)是由加热的装配式脚手架10°C /分钟的速度从30°C到600°C下氮气流(TGA / SDTA851 /梅特勒-托利多,西班牙)。

此外,在体外退化和肿胀的装配式脚手架进行了评估。退化分析、PCL / CS和PCL / CS / MTA支架都沉浸在PBS (pH值7.4)在37°C 72 h。标本被重0、6、12、24、48和72 h。减肥比例测量根据以下公式, 和 指支架样品的重量和初始体重在不同时间,分别。

剩余的重量报告按照下列公式:

对膨胀率的分析,PCL / CS和PCL / CS / MTA支架被切成2×2厘米2块,沉浸在去离子水(15毫升)和孵化24小时37°C。在特定的时间间隔,样本从解决方案,然后,消除表面的吸附水的样本,他们稍微压的滤纸。支架被浸泡前后体重测量干( )和湿( )权重。肿胀的合成支架计算根据以下方程:

2.4。灭菌的支架

PCL / CS和PCL / CS / MTA支架被紫外线照射下30分钟,然后在70%的乙醇溶液浸泡20分钟。之后,乙醇蒸发,样本与PBS溶液清洗,去除多余的乙醇。消毒支架是孵化在DMEM 37°C 24 h,像前面描述的那样25]。

2.5。细胞分离、鉴定和hDPSCs文化

hDPSCs的隔离和表征加工根据我们之前的协议描述研究[25,26]。简单地说,在获得知情同意的患者或他们的父母,完整的恒牙提取基于矫正治疗计划。提取牙齿被送到实验室,清洗后,在牙槽被切断。然后,牙科纸浆沿槽被分割了的牙齿。果肉组织被切小块,手术剪刀,随后通过胶原酶酶消化我和dispase类型。使离心后,细胞悬浮液在25 cc培养瓶培养包含D-modified鹰的中/高葡萄糖(DMEM / HG), 10%胎牛血清的边后卫,青霉素100单位/毫升和100毫克/毫升链霉素。DPSCs孵化在37°C在一个潮湿的大气中含有5%股份有限公司85 - 95%2。培养基是刷新每72 h。根据流式细胞术分析在我们之前的研究25),80%以上的扩大细胞表达间充质干细胞表面抗原如CD90、CD166 CD105, CD73,而只有不到4%的人表示分化细胞抗原表位包括CD64、CD106, CD11b和CD31。为此,近100% confluency第三通道,DPSCs被分成6 fluorescence-activated细胞排序圆底管(Becton Dickinson猎鹰,桑尼维尔CA)的密度 细胞每管,然后沾免疫球蛋白G-fluorescein isothiocyanate-conjugated或phycoerythrin-conjugated anti-CD105, CD90、CD166 CD73, CD64、CD106, CD11b和CD31(贝克曼库尔特,Villepinte,法国,每20毫升)。管是孵化20分钟在室温下在一个黑暗的地方。后上层清液被清洗和离心法,细胞被固定为1%甲醛。所有数据进行评估使用库尔特史诗XL(贝克曼库尔特)和评估使用EXPO32 ADC软件(贝克曼库尔特)和WinMDI 2.8版。

2.6。扫描电子显微镜(SEM)成像

HDPSCs(第三段)在DMEM培养/ HG放大与青霉素、链霉素的边后卫10%和1%。精疲力竭的培养基是每三天更换一次,直到细胞融合达到了80%,消毒支架上培养。

PCL / CS / MTA支架的表面形态和hDPSCs支架上培养的评估由SEM播种后3天。在评估之前,hDPSCs固定在2.5%戊二醛如我们之前所述研究[27]。固定后,支架,没有细胞减少和涂层的纳米厚的金层。FE-SEM 1430 vp (MIRA3 FEG-SEM Tescan,捷克)应用于样品成像。

2.7。细胞增殖MTT测试分析

在hDPSCs评估支架的毒性,MTT试验进行;简单地说,细胞(第三段)被播种在PCL / CS和PCL / CS / MTA支架。支架放置在48-well盘子,然后由5000细胞/播种。为了培养细胞在支架的大小相同,第一,100年μL悬挂含有细胞的培养基添加到支架。孵化后板一小时,300年μL培养基被添加到每个。细胞培养在一个没有支架的介质被认为是对照组。hDPSCs扩散在支架评价3、7、14天之后播种。100年μL MTT的解决方案(5毫克/毫升)被添加到每个。板块在37°C和5%孵化有限公司24小时。之后,MTT /媒介解决方案在100年取代了μL DMSO溶液。然后,100年μ从每个被转移到96 L的解决方案——孔板,和溶解的吸光度蓝色甲瓒晶体决心在570 nm的ELISA读者。

2.8。基因表达的定量实时PCR

培养细胞的血管生成修改进行评估播种后7天 hDPSCs装配式脚手架。形状的支架被削减的气缸直径14毫米和2毫米高度和放在6-well盘子。6-well板上培养的细胞(第三段)是相同的(不带支架)和对照组。短暂,在细胞培养有/无支架在血管生成中,总RNA提取根据Ambion制造商指令试剂盒缓冲区(猫没有。15596 - 026年,英杰公司,美国),和获得的质量RNA决心NanoDrop(美国马热科学、沃尔瑟姆)。接下来,使用1执行互补脱氧核糖核酸的合成μg中提取RNA的互补脱氧核糖核酸合成工具包(Yekta Tajhiz Azma,德黑兰,伊朗)。最后,定量实时PCR试验(存在)是由混合SYBR绿色主人混合(Yekta Tajhiz Azma,德黑兰,伊朗),合成cDNA、引物设计,并根据制造商蒸馏水协议。设计的引物序列和融化温度在表1。每个数据在三个独立的实验,重复三次。数据分析是由Pfaffl方法。

表1
引物列表。
2.9。通过免疫印迹分析蛋白表达

免疫印迹分析是用来测量血管生成蛋白质的表达,包括VEGFR-2,而,Tie2蛋白质在播种hDPSCs PCL / CS / MTA支架。短暂,细胞在冰冷的细胞溶解细胞裂解缓冲溶液(氯化钠、NP-40和Tris-HCl)包含鸡尾酒酶抑制剂。在那之后,细胞溶解产物和受到污点分析做好准备。墨迹是孵化与每个主要抗体(而:猫没有。sc - 517593,β肌动蛋白:猫不。sc - 47778, Tie2:猫不。sc - 293414,圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯,CA;VEGFR-2:猫不。ab39256 Abcam)一夜之间在4°C和二级HRP-conjugated anti-IgG抗体(猫没有。sc - 2357,圣克鲁斯生物技术有限公司)在室温下1 h。Immunopositive乐队是由一个增强可视化chemifluorescent标签工具包(Amersham淀粉微球的生物技术,皮斯卡塔韦,新泽西)。

2.10。统计分析

在这项研究中,提出了数据 分析了单向方差分析和图基事后测试使用GraphPad棱镜软件(8.0版本,GraphPad、圣地亚哥、钙、美国)。 值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有实验都进行相同的牙髓干细胞系在一式三份。

3所示。结果

3.1。物理化学和形态学特性的PCL / CS / MTA支架

红外光谱谱PCL / CS, PCL / CS / MTA,和MTA是显示在图1(一)。MTA的红外光谱谱提出了阿宝的特定的乐队43 -从拉伸和弯曲模式(673厘米1,918厘米1),哦- - - - - -(673厘米1,3559厘米1从MTA)28,29日]也有限公司32 -(1458厘米1)碳酸MTA (29日]。此外,SiO的乐队44 -(526厘米1,975厘米1),哦- - - - - -(3857厘米1,3732厘米1,2923厘米1,2854厘米1)具体钙硅酸盐水合物也出现在红外光谱(30.,31日]。具体的有限公司32 -从CaCO3(1411厘米1,1514厘米1,885厘米1(30.,31日])也确定了。

(一)
(一)
(b)
(b)
图1
(一)红外光谱谱PCL / CS, PCL / CS / MTA, MTA。(b) x射线衍射模式PCL / CS, PCL / CS / MTA, MTA。

发现在2945年和2868年的山峰,厘米1(CH2拉伸),1096、1096和962厘米1(o c振动),1243和1177厘米1(C-O-C拉伸),可以批准PCL / CS脚手架的成功发展。此外,乐队在1732厘米1与PCL的C = O伸展。MTA的光谱混合支架(PCL / CS / MTA)提供了一个轻微的改变位置的特征频段的哦组(从3430年到3436厘米1从1177年到1185厘米1)由于氢键的形成与MTA哦和北半球2分别组PCL和CS。此外,XRD分析证实了合成工艺应用于实现PCL / CS / MTA是成功的。如图1 (b)水晶的性质准备支架为特征,和PCL / CS的模式显示衍射峰 ,这可以归因于(110、200)计划的PCL组件,分别。新高峰的出现在PCL / CS / MTA模式确认MTA发达脚手架的存在。此外,MTA的XRD模式显示公司峰在23.580和26.587°2θ,代表氧化钽。除了氧化钽,MTA的主要组件是氧化硅酸钙和硅酸钙,具有特征峰在34.2和29.6°2θ。

确认成功加载MTA的脚手架、热降解的PCL / CS和PCL / CS / MTA进行了热重分析(TGA)(图2)。这个数字表明,水的蒸发和残留溶剂引起的体重低于120°C。此外,第二阶段,200°C到300°C,是由于聚合物的热降解。第三个阶段是发现从300°C到400°C和归因于聚合物材料碳化。此外,较低的减肥了脚手架相比没有MTA由于MTA的更高的熔点。MTA的内容可以根据TGA曲线计算。在这里,这个值是30% PCL / CS / MTA。同时,PCL / CS / MTA支架的表面形态是通过SEM(图成像3(一个))。图3 (b)表明hDPSCs附加在PCL / CS / MTA支架。


图2
热重分析(TGA)曲线的PCL / CS和PCL / CS / MTA。
(一)
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(b)
(b)
图3
扫描电镜的图像(a) PCL / CS / MTA脚手架和(b)粘附的hDPSCs PCL / CS / MTA支架经过7天的文化。

退化的PCL / CS和PCL / CS / MTA支架进行了评估,结果显示在图4(一)。基于这些结果,装配式脚手架被时间的流逝退化。MTA的加入后,退化的程度随着时间的增加相关的高孔隙度由MTA,导致水分子的扩散到水凝胶结构,和快速减肥。如图4(一)观察,剩下的重量约26%和34%的PCL / CS / MTA和PCL / CS支架在pH值为7.4,分别。

(一)
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(b)
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图4
(一)在体外退化的PCL / CS和PCL / CS / MTA支架在pH值7.4。(b)肿胀程度(%)的PCL / CS和PCL / CS / MTA支架在不同的时间间隔。

此外,发达支架的膨胀指数图所示4 (b)。结果表明,将MTA支架增加了肿胀率由于孔隙度较高的结构。

3.2。PCL / CS / MTA支架增加hDPSCs扩散

PCL的影响/ CS和PCL / CS / MTA hDPSCs的增殖和细胞生存能力评估后,MTT测定3、7、14天。结果表明,细胞增殖有(图增加了时间5)。细胞增殖明显高于在PCL / CS / MTA支架在所有实验时间。之间的显著差异PCL / CS和PCL / CS /观察MTA天7和14。根据调查结果,它可能是说,PCL / CS / MTA支架对hDPSC扩散有积极的影响。


图5
MTT检测对PCL / CS hDPSC可行性评估和PCL / CS / MTA支架培养3、7、14天。 , ,和 。
3.3。PCL / CS / MTA支架增加hDPSCs血管生成基因和蛋白的表达

血管生成因素的修改在hDPSCs /没有支架进行评估在基因和蛋白质水平(图6)。根据存在结果,VEGFR-2的表达水平,Tie2,而大大增加了在培养hDPSCs PCL / CS / MTA支架比较细胞没有支架( , ,和 ,)(图6(一))。血管新生因子基因表达实验的验证,在蛋白质组学水平进行了分析。基于免疫印迹发现,hDPSCs的播种MTA-based支架VEGFR-2的表达明显增加,Tie2,而相对于对照组( , ,和 ,)(图6 (b))。

(一)
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(b)
(b)
图6
(a)表达水平的VEGFR-2, Tie2,而基因hDPSCs播种在PCL / CS和PCL / CS / MTA支架后7天。(b)的蛋白质免疫印迹分析这些标记显示,hDPSCs增加这些蛋白质的水平,。 , , ,和 。

4所示。讨论

摘要牙本质牙髓复合体通过促进再生概念出血在根管空间被Obstby在1960年第一次描述了。简而言之,在这个理论中,重建血管网络或血管再生的根管诱导组织再生(8]。在代表,血管再生的根管空间是至关重要的修复和重建完成复杂(32]。没有足够的血液供应,再生过程不能完成,就可以形成和坏死或纤维组织(33]。本研究旨在构建PCL / CS / MTA支架和评估他们的能力在hDPSCs诱导血管生成。根据我们的结果,捏造PCL / CS / MTA支架血管生成标记的表达增加hDPSCs在基因组和蛋白质组水平。此外,这些支架提供一个适当的环境,这些细胞的粘附和增殖。

最近,众所周知,支架材料及其物理化学相互作用在组织工程起着关键作用,因为他们提供结构支持干细胞和模拟细胞外基质(34,35]。在这方面,它已经被验证,开发不同的支架与PCL和其他合适的材料理想的再生属性,模拟细胞外基质可以提供3 d环境对细胞粘附、增殖和分化8,36]。此外,PCL-based支架的成矿潜力相当大在牙质再生刺激牙原性的分化hDPSCs [12]。CS聚合物应用于完成复杂的再生由于矿化诱导,溶解度低,螯合剂,抗炎,抗菌效果(17,18,37]。因此,它可能是,这些合成和天然高分子的结合可以提供一个适当的结构的再生完成后复杂。

在最近的研究中,添加MTA PCL /基于cs支架显著增加hDPSCs扩散在所有实验的日子。授权的这一发现,它可以提到Thalita等人加载MTA collagen-based支架的骨再生诱导成骨细胞。他们表明细胞生存能力和矿化程度增加的感应(38]。

不同钙的血管生成感应silicate-based水泥表明PMTA (ProRoot MTA) RMTA (RetroMTA)和MMTA (MicroMega MTA)的mRNA表达VEGF增加,FGF-2, Ang-1。然而,这些增加更高PMTA组(21]。因此,PMTA加载在PCL / CS背景在当前的研究中。

结果表明,VEGF的表达受体激活分子和细胞级联形成血管,和需要诱导血管再生和分化hDPSCs [39,40]。在这方面,优素福等人评价血管生成感应与MTA hDPSCs治疗。结果显示调节VEGF水平标记MTA-treated组与对照组相比,(41]。此外,周等人证明了他们的分泌物,作为血管生成的另一个基本因素,通过接触hDPSCs升高钙silicate-based水泥像PMTA42]。它已经报道,hDPSCs可以分泌VEGF等proangiogenic因素,FGF-2, PDGF, MMP-9, igf - 1 (43]。在最近的研究中,VEGFR-2的表达水平,Tie2,而hDPSCs进行评估确认的血管生成感应潜力捏造PCL / CS / MTA支架。结果证明这些支架的制造成功。此外,增强血管生成能力的PCL / CS骨干MTA加法后显示该结构的有效性。然而,这项研究是最初的一步,为临床应用和进一步研究这些MTA-based支架应该进行。

5。结论

MTA有潜在再生效果作为根修复材料,可以是一个有前途的未来再生牙科组件。同时,这种材料不提供一样细胞外基质结构,为组织再生是至关重要的。因此,建设MTA-based支架可以是一个有前途的替代再生牙髓学的过程。总之,在当前的研究中,MTA-based支架成功制造并提供一个适当的结构hDPSCs的粘附和增殖。此外,血管生成的潜力hDPSCs播种在PCL / CS / MTA支架增加。在一个更为普遍的观点是,可以说,MTA的PCL / CS支柱可以增加血管生成感应,和这些结果可以应用于未来再生牙髓学的过程。

数据可用性

所有生成的数据和/或分析在这个研究包括在发表的这篇文章。和/或使用的数据集分析在当前研究可从相应的作者以合理的要求。

伦理批准

所有实验协议经伦理委员会批准的大不里士大学医学科学(TUMS)遵守赫尔辛基宣言(批准号TBZMED.REC.1394.1041)。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

我们值得庆幸的是承认的大不里士大学干细胞研究中心的医学科学支持这个项目。