文摘

巨噬细胞是一种非常有前途的细胞类型癌症免疫疗法,但很难获得足够的功能临床细胞疗法的巨噬细胞。在此,我们雅思一个可靠的方法来生产功能性巨噬细胞通过人类诱导多能干细胞的分化(hiPSCs)。通过优化拟胚体的大小控制(EBs),我们加快了巨噬细胞的分化过程,增加巨噬细胞的生产没有衰减巨噬细胞功能。我们最终的收益率开始万能的巨噬细胞接近50倍。在体外显示巨噬细胞吞噬能力和异种移植肿瘤模型。M0巨噬细胞进一步分化为M1和M2亚型,和M1细胞表现出典型的促炎的特征。此外,我们发现,造血分化源于外部的EB和逐渐成熟的。综上所述,我们的协议提供了一个有效的方法对巨噬细胞的生成与血液巨噬细胞,为细胞疗法和基因编辑提供潜在价值的研究。

1。介绍

过继细胞疗法,如嵌合抗原受体(汽车)T细胞疗法,为癌症的治疗提供了一个革命性的方法,但在实体肿瘤中的应用仍有一定的局限性1]。巨噬细胞,大多数塑料类型的白细胞的免疫系统,在开发中扮演着重要角色,体内平衡和癌症(2]。因为他们可以专心于肿瘤环境,增强T细胞的细胞毒性效应,和细胞毒性较小,CAR-macrophage显示更多的优势治疗实体肿瘤(3]。然而,由于终端分化的巨噬细胞的特点4),很难获得充足的细胞。

最常见的人类巨噬细胞的来源包括外周血或骨髓单核细胞,骨髓细胞株(比如THP-1),多能干细胞。然而,隔离的单核细胞是耗时的,收益率很低,和骨髓细胞株无法复制的复杂性体内巨噬细胞(5]。巨噬细胞来源于人类胚胎干细胞具有相同的功能从外周血和骨髓单核细胞巨噬细胞,但涉及伦理问题(5]。hiPSCs成为一个有利的选择,因为他们没有道德限制,可以很容易被基因组编辑技术(6- - - - - -9]。

在过去的几年中,iPSC-derived巨噬细胞的分化方案(IPSDMs)不断提高和用于疾病模型(10- - - - - -15],macrophage-pathogen交互建模[16,17),和细胞疗法18]。最初,细胞在某些方法需要coculture OP9鼠标基质细胞(10,19,20.),但这种方法逐渐被弃用,因为使用的异基因的细胞,限制了临床应用。目前,hiPSC分化方案主要是基于EB的形式或单层培养(表S1)。与单层培养协议相比,EB协议允许连续收获的好处的悬浮细胞长期生产的巨噬细胞与细胞因子(相对较少21- - - - - -26]。相比之下,单层培养协议实现一次性回收率更高的巨噬细胞分化的步骤,修改等因素的复杂的混合物(27- - - - - -30.)(11个因素)、缺氧条件(28],CD14排序(29日,30.]。在过去,万能的种子数量/ EB在大多数EB-based协议是不固定的。EB的大小是随机的,收益率是不稳定的22- - - - - -25,31日,32]。连续代IPSDMs导致累积产量高,但放大的效率不够高,在很短的时间内获得足够的大量的巨噬细胞(21,22,25]。因此,有必要建立一个方便、便宜分化方案,可以在短期内实现更高的收益率。

在这项研究中,通过优化EB大小,我们加快了巨噬细胞的分化过程,增加巨噬细胞的生产没有衰减巨噬细胞功能。

2。材料和方法

2.1。hiPSC文化

hiPSCs feeder-free培养,血清PSCeasy®II中(Cellapy)和confluency通道当细胞达到70% -80%。细胞,通过媒介是吸气和1毫升0.5毫米EDTA(英杰公司)被添加到每个6-well板块之一,然后,细胞培养4 - 5分钟在37°C。每个的一个6-well板可以被转移到一个6-well板1:6分流比。2毫升每口井的媒介是分发基底膜基质(BD生物科学)涂布6-well盘子,盘子是回到孵化器在37°C, 5%的公司₂。

2.2。hiPSCs分化为巨噬细胞

我们进行造血分化hiPSCs通过使用两个版本的EB-based造血分化协议。首先,hiPSC殖民地孵化1毫升TrypLE表达(Gibco)在室温下2分钟。P3500协议,TrypLE吸气,表达和细胞resuspended APEL(干细胞技术)和中断的单个细胞悬液移液,补充了10μM岩石抑制剂Y27632(干细胞技术),10 ng / ml BMP4(研发系统),和10 ng / ml重组人类bFGF(研发系统)。细胞(3500 /)被播种到60井中间的一个未经处理的圆底96孔板(配角3788)和离心机 在室温下为5分钟。从第二天到14天,细胞培养在APEL包含BMP4 (10 ng / ml), bFGF (10 ng / ml), VEGF (PeproTech) (10 ng / ml),和自洽场(PeproTech) (50 ng / ml)。14天,APEL介质被移除,然后,巨噬细胞分化培养基RPMI 1640中基本(Gibco)补充说,补充10%胎牛血清(的边后卫,Gibco), 1% penicillin-streptomycin (PS, NCMBIO), 100 ng / ml - csf (PeproTech)和25 ng / ml IL-3 (PeproTech)。22天,EBs和单个细胞悬架被收获,然后透过100μm细胞移除EBs过滤器。细胞在1000转离心5分钟,播种到6-well细胞培养板。后22天,吸入了介质和添加新鲜的巨噬细胞分化培养基(RPMI 1640 + 10%的边后卫+ 1% PS + 100 ng / ml - csf)根据需要,如果中变黄。

P8000协议,细胞resuspended APEL补充10μM摇滚抑制剂Y27632 10 ng / ml重组人类bFGF, 20 ng / ml BMP4, 20 ng / ml VEGF,现金流量表和40 ng / ml。细胞(8000 /)被播种到60井在100年参与圆底96孔板μ每口井的媒介。从0到8天,100μl APEL中摘除和上述介质(没有Y27632)每2 ~ 3天添加。8天,吸入APEL介质和替换用新鲜巨噬细胞分化培养基(PS RPMI1640 + 10%的边后卫+ 1% + 100 ng / ml - csf + 25 ng / ml IL-3)。14天,EBs和细胞收集和播种到圆底6-well板块(3471年配角),和悬浮细胞在上层的收获。EBs被移除,直到天22。其余P3500协议中描述的一样。

2.3。流式细胞术分析

细胞被洗一次,沾抗体或同形像控制30分钟在4°C流式细胞术缓冲区。样品在流式细胞仪分析了石中剑(BD +章)和数据分析使用FlowJo v10 (FlowJo, LLC)。以下使用抗体:CD45-APC-Cy7 (2 d1, IgG1κ从BioLegend -APC-Cy7);CD34-PE (4 h11, IgG1κpe)和CD14-PE (61 d3, IgG1κpe)表达载体;CD11b-APC (M1/70 IgG2bκapc)、CD80-PE (2 d10.4 IgG1κpe)、CD86-PE-Cy7 (IT2.2 IgG2bκ-PE-Cy7)、CD163-PE (GHI / 61, IgG1κpe)和CD206-PE-Cy7 (19.2, IgG1κ从eBioscience - PE-Cy7)。

2.4。Wright-Giemsa染色

细胞在500转离心5分钟和固定在显微镜幻灯片使用cytospins (Tharmac Cellspin)其次是染色Wright-Giemsa污渍。

2.5。CD14⁺单核细胞隔离

外周血单核细胞(PBMCs)从健康的捐赠者的血液分离Ficoll-Paque (Cytiva)和CD14⁺单核细胞分离使用人类从PBMCs CD14微(Miltenyi研究)根据制造商的指示。

2.6。分化的巨噬细胞亚型

细胞分化成M0细胞在天25 - 30天。M0细胞极化48 h M1细胞巨噬细胞分化中补充了100 ng / ml有限合伙人(σ)以及20 ng / ml IFN -γ(PeproTech), M2巨噬细胞细胞分化中补充了20 ng / ml il - 4 (PeproTech)。细胞分离使用Accutase (Gibco)或5毫米EDTA 5 - 10分钟。

2.7。荧光珠吞噬作用分析

Fluoresbrite™1.0多色的红色μm乳胶珠子(18660年Polyscience Inc .)被添加到细胞培养基。24小时后,巨噬细胞被清洗和分析了共焦显微镜和流式细胞术。

2.8。肿瘤吞噬作用分析

盐土和Nalm6肿瘤细胞被沾染了赫斯特33342年在37°C(生命技术)20分钟。然后,和PBS的细胞被洗了三次 巨噬细胞与肿瘤细胞cocultured比例为1:1,1:2或1:4,分别,然后孵化2小时37°C。细胞被播种到一个圆底96孔板的密度 200年μ巨噬细胞中。细胞收获和沾CD11b-APC抗体在4°C 30分钟,然后,吞噬率是衡量流式细胞仪石中剑。巨噬细胞与肿瘤细胞的比例cocultured 1: 4 M0、M1、M2吞噬试验。

2.9。免疫荧光

首先,细胞被固定在4%多聚甲醛(PFA) 20分钟,然后洗了三次用PBS。珠吞噬作用测定,细胞被沾染了5μg / ml麦胚凝集素(WGA), Alexa萤石633配合(表达载体)10分钟,然后洗两次用PBS DAPI紧随其后(1:500)染色标准程序。未分化hiPSCs被用作控制。肿瘤吞噬试验,cocultured细胞被封锁10%山羊血清然后孵化CD11b-APC抗体在4°C过夜;然后,抗体被水冲走。这些照片是被共焦激光扫描显微镜(徕卡SP8)。

2.10。EBs的冰冻切片,免疫荧光

EBs收集和嵌入式使用最佳切削温度复合其次是冰冻切片,显微镜载玻片是储存在-80°C。免疫荧光,显微镜载玻片离开在室温下15分钟,沉浸在PBS 10分钟删除10月之后,EBs被封锁10%山羊血清和孵化CD34-PE和CD45-APC-Cy7抗体(1:100)在4°C一夜之间,然后,这些细胞被洗和DAPI染色如上所述。

2.11。细胞因子检测

M0巨噬细胞培养的巨噬细胞分化中直到达到confluency 90%以上。然后,M0细胞极化对M1和M2细胞与前面提到的细胞因子。收集细胞上清液和细胞因子的浓度检测到AimPlex®多元分析的流™(QuantoBio)。

2.12。动物研究

所有老鼠研究按照国家指导方针进行人道对待动物和被批准的机构动物保健和使用委员会(IACUC)上海交通大学。CB17-SCID小鼠被分为三组,细胞resuspended在100年μl矩阵和接种到小鼠皮下注射(a) Raji每个老鼠细胞,(b) Raji细胞+ 每个鼠标PBDMs, (c) Raji细胞+ IPSDMs每个鼠标。肿瘤形成密切观察,和肿瘤体积测量肿瘤可见时每隔2 - 3天。肿瘤增长到一定规模时,老鼠牺牲和肿瘤的解剖,拍照,和体重。肿瘤组织是嵌入在石蜡块切片,与苏木精和伊红染色。

2.13。统计分析

所有的实验都重复三次或更多。双尾学生的未配对 - - - - - -成对测试是用于统计分析,和多个组进行评估通过单向方差分析或双向方差分析Bonferroni多个对比测试。给出的数据 。 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。种子细胞的数量影响hiPSCs分化成巨噬细胞的过程

巨噬细胞分化的细胞则需要三个步骤:造血分化,扩大髓系祖细胞,巨噬细胞的成熟。在这里,我们使用了两个协议,P3500 P8000,巨噬细胞分化功效从hiPSCs(图进行比较1(一))。P3500协议,hiPSCs(3500 /)被播种在一个未经处理的圆底96孔板和培养基是取代巨噬细胞分化中14天。在P8000协议,hiPSCs(8000 /)被播种,培养基取代了8天。CD34的百分比⁺CD45⁺细胞80%以上P3500协议(图14天1 (d),图S1a),但CD34的速度⁺CD45⁺细胞和CD45不超过20%⁺CD14⁺/ CD45⁺CD11b⁺细胞达到40% ~ 60%在第14天P8000协议(数字1 (c)和1 (d),图S1a)。髓细胞可以从EB文化收获上层清液在第14天P8000协议,这是比早些时候P3500协议(数字1 (b)- - - - - -1 (d))。从14到22天,CD34⁺CD45⁺造血祖细胞(手持电脑)分化成髓系祖细胞在P3500协议。22天,CD45的百分比⁺CD14⁺/ CD45⁺CD11b⁺细胞在P3500协议达到了约70%,而积极的P8000协议较高(数据率1 (c)和1 (d),图印地)。在第二步中,细胞可以被冻结或分化成一个更成熟的状态。30天,没有CD45的百分比的差异⁺CD14⁺/ CD45⁺CD11b⁺细胞之间的两个协议(数字1 (c)和1 (d),图就是S1c)。总的来说,巨噬细胞的分化过程P8000协议的速度比在P3500协议。更重要的是,总细胞收获P8000协议的数量高于P3500协议22天,一天30(图1 (e))。最后,对 每96孔板细胞收集P8000协议在30天。P3500协议在分化过程中,细胞的第14天,22天,每天30被Wright-Giemsa染色(图染色1 (f))。14天,主要是不成熟的造血细胞。22天,单核细胞表现出典型的形态特征和有更多的空泡在细胞质中比在外周血单核细胞。30天,细胞更成熟,像“煎蛋。“这些结果表明,种子细胞的数量和时间添加细胞因子确定分化效率。

3.2。更多的播种细胞促进了EBs手持电脑的发展

进一步探索手持电脑的发展在EBs, EBs的两个协议在不同时间点被冻结部分和免疫荧光染色观察。在第四天,CD34⁺和CD45⁺细胞可以观察到P8000协议,但几乎在P3500协议通过免疫荧光(图2(a))。6天,CD34⁺和CD45⁺细胞首先P3500协议通过免疫荧光(图中找到2(b))。此外,我们发现CD34蛋白主要位于外层的EBs直接与细胞因子和逐渐减少,因为它向内,而CD45主要是表现在EBs的内层是较弱的向外(数字2(一)-2(c))。这些结果证实手持电脑从EB外层分化到内部囊和更大的EB提升HPC分化。

3.3。hiPSC-Derived巨噬细胞具有吞噬作用的功能

外围血液巨噬细胞能吞噬外来物质(PBDMs),所以我们也想看看巨噬细胞来源于hiPSCs吞噬功能。首先,我们使用了荧光珠确定巨噬细胞的吞噬功能(如前所述)(28]。巨噬细胞与荧光珠孵化后24小时内,巨噬细胞和激光共焦显微镜观察。排除少量的荧光珠仍然坚持细胞造成假阳性,我们使用hiPSCs作为控制。显然,巨噬细胞内的荧光珠在,而表面的荧光珠散落在hiPSCs组(图3 (c))。流式细胞术还证实荧光珠由巨噬细胞的吞噬能力,和巨噬细胞的吞噬作用没有区别两个分化之间的协议(数字3(一个)和3 (b))。

接下来,我们进一步验证了对肿瘤细胞巨噬细胞的吞噬能力。首先,白血病细胞系,Nalm6盐土,与赫斯特33342年荧光染料标记,然后,巨噬细胞和肿瘤细胞coincubated。当巨噬细胞对肿瘤细胞的比例是1:4,巨噬细胞吞噬了肿瘤细胞的比例是最高的,这是40%以上-50%(数据3 (d)和3 (f))。我们假设增加接触肿瘤细胞和巨噬细胞促进巨噬细胞的吞噬作用。巨噬细胞的吞噬作用在肿瘤细胞也被激光共焦显微镜(图3 (e))。吞噬作用的动态过程被记录活细胞的实时荧光成像技术(补充数据、电影)。

确定分化的巨噬细胞也有体内抗肿瘤活性,Raji细胞有或没有PBDMs或IPSDMs皮下接种到CB17-SCID老鼠。经过超过一个月的观察,没有明显差异在三组之间的肿瘤重量和大小(数字S2a和开通)。然而,在PBDMs治疗组或IPSDMs,解散和腔内肿瘤组织(图中被发现S2c)。这些结果表明,尽管我们IPSDMs没有显示一个明显的体内抗肿瘤作用,IPSDMs的功能在我们的协议相当PBDMs。

3.4。识别不同的极化IPSDMs亚型

巨噬细胞通常分为两个不同的激活状态,即M1(或经典激活)类型和M2(或交替激活)类型。M1表型是促炎拥有强大的抗菌和抗肿瘤活性,而M2是促进组织重建和肿瘤的生长33]。- csf的连续感应下,骨髓祖细胞坚持six-well板,并分化成M0巨噬细胞。对M1 M0细胞可以分化细胞由有限合伙人和干扰素-γ。对M2使用il - 4, M0细胞可以分化细胞。M0细胞形状细长,M1更突出,M2细胞(图更加全面4(一)),如前所述29日]。CD80和CD86的表达调节细胞M1, CD163的表达和CD206 M0价格高,M2细胞(图4 (b))。PBDMs和IPSDMs获得类似的结果。此外,轻微区别IPS-M0 IPS-M2细胞表明M-CSF-induced巨噬细胞的表型转向M2细胞,所讨论的Zhang et al。31日]。然后,我们调查是否在不同的激活巨噬细胞的吞噬能力不同。结果表明之间的吞噬能力没有区别M0和M2细胞,而细胞M1略有下降但没有统计学意义(数字4 (c)- - - - - -4 (e))。,的吞噬活动IPSDMs相媲美,PBDMs(数字4 (d)和4 (e))。细胞因子分泌显著表明,更高水平的促炎细胞因子(il - 6和TNF -α)在PB-M1和IPS-M1分泌细胞(图4 (f))。结果证实,从万能干细胞可以分化成不同的亚型巨噬细胞巨噬细胞来源于PB。

4所示。讨论

在这项研究中,我们展示了一个优化的分化方法IPSDMs生产成熟的巨噬细胞在相对较短的时间和更高的收益率。巨噬细胞在癌症研究中一直是一个热门话题由于其与肿瘤关系密切,和自体巨噬细胞在临床试验用于癌症治疗在上个世纪(34]。最近,CAR-macrophages已被证明导致促炎的肿瘤微环境和提高抗肿瘤人源化小鼠模型(T细胞活动3,35]。因此,我们的协议将促进IPSDMs的研究和随后的临床应用。

在这项研究中,我们调整大小的EB通过增加数量的播种和成熟的巨噬细胞产生的细胞则在相对较短的时间和更高的收益率。我们最后的巨噬细胞接近50倍的收益率则开始, 巨噬细胞在一个月内每96孔板。范法相比Wilgenburg et al。21),收益率的巨噬细胞在第一个月协议增加了10倍的区别(表S1)。根据播种万能,我们协议的放大效率高于大多数协议(表一个月S1)。最近,Gutbier等人修改了协议的范Wilgenburg et al。21),计算每iPSC产量(一个月)(表相媲美,我们的协议S1)[36]。崔迪等人开发了一种高收益单层分化有关的协议 单核细胞/播种hiPSC [30.]。在细胞明显增大规模生产和高效的低温贮藏部分补偿单层培养的其他限制。为我们的研究中,如何进一步扩大累积产量和延长持续时间将是重点。考虑各种协议的多样性,包括PSC线、文化条件下,分化时间,性能和成本,未来发展方向可能确定具有成本效益的,标准化的协议为大规模的临床应用。

在这里,我们表明,造血分化源于外部EB和逐渐成熟的。EB的初始大小决定分化效率但没有影响巨噬细胞的吞噬作用。虽然最广为人知的理论是,巨噬细胞来源于循环单核细胞起源于骨髓,近年来的研究表明一些tissue-resident巨噬细胞出现在早期胚胎发育阶段,独立维持在一个稳定的状态37- - - - - -40]。EB在结构上类似于胚胎发育的早期阶段,它可以模拟原始造血过程从胚胎外的结构在哺乳动物卵黄囊。

虽然我们IPSDMs没有显示一个明显的体内抗肿瘤作用,IPSDMs的功能在我们的协议相当PBDMs。就像我们IPSDM PBDMs,治疗肿瘤组织内解散和蛀牙引起的。IPSDMs相比,张等人发现,iPSC-derived CAR-expressing巨噬细胞细胞——(CAR-iMac)治疗动物显示减少卵巢肿瘤负荷(18]。Klichinsky等人也证明CAR-M-treated小鼠表现出明显减少SKOV3肿瘤负荷(35]。此外,尽管所有的动物最终进展,一个注入CAR-Ms导致延长总生存期(35]。因此,这些证明IPSDMs结合汽车将发挥其独特的作用在临床实体瘤的治疗。

5。结论

总之,我们描述一个优化和可再生的分化方法从细胞则产生成熟的巨噬细胞在相对较短的时间和更高的收益率,这可能促进巨噬细胞的细胞疗法。

数据可用性

请联系作者的数据请求。

伦理批准

根据研究的伦理原则的生物医学研究伦理审查办法涉及人类和《赫尔辛基宣言》。儿童医学中心的伦理委员会隶属于上海交通大学批准“诱导多能性”细胞的诱导实验(SCMCIRB-K2014050)。

同意

主题提供了书面知情同意出版信息的图像、视频等等。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

李y和高频负责概念化;SL、ZZ LS, YZ、YY LY,赫兹,WH, WW负责调查;SL、高频和y李负责分析;SL、高频和y李负责撰写/审查和编辑;李y和高频负责资金收购。

确认

这项工作是支持中国国家重点研发项目的一部分(2018 yfc1313000/2018yfc1313005 y L),中国国家自然科学基金(81972341和81972341 y李;82072896和82072896 h F、82072896 l S;81800118 h . Z),浦东新区科技发展基金(PKJ2018-Y47),地方高水平大学建设项目的上海交通大学医学院的y,上海市科学技术委员会(19 jc1413500)、上海市临床医学教育Commission-Gaofeng格兰特(20161310)的支持,上海学术/技术研究和项目领导人(21 xd1403100)高频。

补充材料

图S1:流仪分析细胞的14天,22天,30天。(一)不同的标记(CD34的百分比⁺CD45⁺、CD45⁺CD14⁺、CD45⁺CD11b⁺)P3500协议(上半部分)和P8000协议(下图)在14天。(b)不同的标记(CD45的百分比⁺CD14⁺和CD45⁺CD11b⁺)P3500协议(上半部分)和P8000协议(下图)在22天。(c)不同的标记(CD45的百分比⁺CD14⁺和CD45⁺CD11b⁺)P3500协议(上半部分)和P8000协议在30天(下图)。图S2:巨噬细胞在体内的抗肿瘤效果的验证。(一)肿瘤体积的折线图,(b)肿瘤小鼠牺牲后的重量。(c) Hematoxylin-eosin染色石蜡的部分肿瘤组织。箭头:巨噬细胞。酒吧,250μ在左侧列中,50μ在中间和右列。表S1:总结协议由万能干细胞分化的巨噬细胞。巨噬细胞分化的主要出版物列表协议包括coculture OP9细胞,EB-based协议和单层培养(组织巨噬细胞子集,比如小胶质细胞不包括)。电影:33342年对Reh-Hoechst IPSDMs吞噬作用显然是观察活细胞实时荧光成像技术(https://drive.google.com/file/d/1rLwt6xMU46n2u4J5JIOOqWWyHEeGCf7D/view?usp=sharing)。(补充材料)