文摘

人类gingiva-derived间充质干细胞(业务)是孤立的从牙龈固有层有前途的再生,免疫调节和抗炎作用。最近,一些研究,包括我们,发现业务有神经再生和皮肤疾病的治疗潜力等各种类型的细胞本身,脱细胞条件培养基、细胞外囊泡(EVs)。然而,业务的mechanobiological行为密切相关的文化条件。因此,本研究的目的是评估人类的功能业务咪喹莫特- (IMQ)诱导小鼠psoriasis-like皮肤炎症在二维(2 d)和三维(3 d)培养条件。这里,我们孤立和业务特征在2 d和3 d的文化条件和发现业务在2 d和3 d输液可以显著改善IMQ-induced小鼠psoriasis-like皮肤炎症,减少的Th1 -以及Th17-related细胞因子IFN水平γ肿瘤坏死因子-α、il - 6、IL-17A IL-17F IL-21, il - 22生成时,和移植脾CD25的百分比⁺CD3⁺T细胞表达下调时脾IL-17的百分比⁺CD3⁺T细胞。总之,我们的新发现揭示业务在2 d和3 d注入可能具有治疗效果治疗牛皮癣。

1。介绍

间充质干细胞(msc) multilineage细胞自我更新和多功能分化和免疫调节/抗炎作用扮演着至关重要的角色在组织修复和再生1,2]。他们出现在几乎所有的组织,包括脂肪组织,骨髓、脐带,滑膜,骨骼肌,牙髓,牙龈,羊膜,胎盘,皮肤3- - - - - -5]。msc通常表达了类似的细胞表面分子,如CD29、CD44, CD73, CD90、CD105,但通常缺乏造血细胞标记,如CD14、CD19, CD34、CD45 [2,6]。人类gingiva-derived间充质干细胞(业务)是孤立的从牙龈固有层有前途的再生,免疫调节和抗炎作用。类似的属性与其他msc共享,包括bmsc, UMSCs ADMSCs,业务有一些独特的特点,特别是高增殖能力。此外,业务可以稳定MSC特点和节目形态和长期的文化条件下维持端粒酶活性。除了分化潜力(骨细胞和脂肪细胞),业务拥有潜力transdifferentiate成神经细胞,内皮细胞,角质细胞、牙原性的细胞在不同的诱导条件下。最近,一些研究,包括我们,发现业务有神经再生和皮肤疾病的治疗潜力等各种类型的细胞本身,脱细胞条件培养基、细胞外囊泡(EVs) [7- - - - - -9]。大量的研究发现,msc的mechanobiological行为密切相关的文化条件。最近,一些研究发现,3 d球体业务显著增加干细胞属性和治疗效果。二维培养的业务相比,3 d球体业务显示增强multipotency和分泌趋化因子和细胞因子水平的增加与细胞迁移、增殖,血管生成;体内,3 d球体文化业务改善缓解口腔粘膜炎。本研究的目的是评估人类的功能业务咪喹莫特- (IMQ)诱导小鼠psoriasis-like皮肤炎症在二维(2 d)和三维(3 d)培养条件。

牛皮癣是一种T细胞介导炎症性自身免疫性皮肤病,Th2和Th1 / Th17细胞因子之间的不平衡(10]。msc可以缓解牛皮癣皮肤损伤通过抑制血管生成的地方和促炎介质和抑制DC-mediated CD4细胞的活化和分化⁺T细胞(11,12]。最近,一些研究表明,msc可以有效治疗牛皮癣(11- - - - - -17]。最新的,有9个临床试验MSC-based治疗牛皮癣。(2]。目前,这是因为简单的可访问性,基因组稳定、高度增殖活动,减少发病率的收获,强大的免疫调节,和再生潜力,以及良好的耐受性,所有接收方主机没有任何明显的系统性不良反应(18]。业务已经成为一个有吸引力的来源的成体干细胞再生治疗和组织工程。

然而,业务是否也有一个有效的治疗牛皮癣和这种效果是否与业务的不同mechanobiological行为是未知的。到目前为止,一些研究报道,msc在3 d球体文化的聚合可以显著提高多功能分化,消炎,和血管生成和组织再生的影响19]。在这项研究中,我们孤立和业务特征在2 d和3 d的文化条件和发现业务在2 d和3 d输液可以显著改善IMQ-induced小鼠psoriasis-like皮肤炎症,减少的Th1 -以及Th17-related细胞因子IFN水平γ肿瘤坏死因子-α、il - 6、IL-17A IL-17F IL-21, il - 22生成时,和移植脾CD25的百分比⁺CD3⁺T细胞表达下调时脾IL-17的百分比⁺CD3⁺T细胞。我们新颖的研究结果显示,在2 d和3 d业务注入可能具有治疗效果治疗牛皮癣。

2。材料和方法

2.1。业务隔离和文化

Binhaiwan中心医院的伦理委员会批准的东莞,人类牙龈组织样本收集临床健康无牙周疾病病史的患者。人类业务的隔离是前面描述的3]。牙龈组织治疗无菌和洗几次磷酸缓冲盐(PBS)。然后,组织碎成小碎片(1 - 3毫米³)和胶原酶消化IV(σ)解决方案在37°C 1 h和离心5分钟,每分钟1000转,上层的丢弃。细胞悬浮在完成最低必要的媒介α(αmem)含10%胎牛血清的边后卫,青霉素(100 U /毫升),和链霉素(100μg / ml),然后放入10厘米细胞培养皿,维持在37°C和5%的公司₂在湿润孵化器。媒介是每三天更新一次。达到80%的融合后,细胞消化trypsin-EDTA解决方案(0.25%)。通道3 - 8细胞被用于本实验。

2.2。多能干细胞分化的业务

2.2.1。成骨分化

的业务被播种在6-well板( 细胞/)和孵化αmem,一夜之间可以遵循,取而代之的成骨诱导介质(三英洁具细胞)每3天。四个星期后,体外矿化化验了茜素红染色。

2.2.2。脂肪形成的分化

如上所述,在脂肪形成的分化培养基培养的业务(三英洁具细胞)。每3天中被刷新。两周后,这些细胞被固定和评估油红O染色。

2.3。球体的生成和分解

业务被播种到超低附件菜( )和孵化完成αmem允许3 d球体形成长达3天。收购spheroid-derived业务,孵化了球状体0.25%胰蛋白酶在37°C 15分钟而移液每5分钟;离心收集单个细胞。

2.4。细胞增殖分析

CCK-8 (Dojindo)分析是用来衡量业务的可行性在二维(2 d-gmscs)和3 d业务(3 d-gmscs)正常培养板培养条件。每口井的短暂,总共1000个细胞培养在五个复制井在96孔板。然后,10μl CCK-8试剂添加到每个好,培养了2 h。吸光度测量在使用标450海里。我们做这个试验1天,3天,第五天,第七天。

2.5。流式细胞术

收集业务和悬浮在细胞染色缓冲区(0.5% BSA在PBS 2毫米EDTA)其次是孵化CD14 (PE)、CD19 (PerCP-Cy5.5)、CD29 (APC), CD34 (PE), CD44 (FITC)、CD45 (PE), CD73 (PE), CD90 (FITC)和CD105抗体(PE) (Biolegend)在黑暗中在室温下30分钟。细胞内染色,先从小鼠脾细胞染色与CD3 (APC / Cy7), CD4 (FITC)和CD25 (APC)抗体(Biolegend),然后固定,permeabilized,染色细胞il - 4 (PE / Cy7)和IL-17 (PE)。染色后,细胞被洗两次与PBS和提交给流仪分析(BD)。数据分析使用FlowJo 7.6软件。

2.6。细胞因子分析

对组织细胞因子分析,从皮肤组织中提取的蛋白质,然后匀浆离心机在10000 g×10分钟在4°C,和上层的收集。蛋白质浓度测定用BCA蛋白质化验设备。细胞因子(il - 6、il - 10, IL-17A、IL-17F IL-21, il - 22生成时,TNF -α和干扰素-γ)血清和皮肤溶解产物测定的LEGENDplex Multi-Analyte流分析工具(Biolegend, 740749)制造商的指示。简单地说,25μl的标准血清或皮肤溶解产物,和缓冲的解决方案是添加到井中。每个25μl混合珠子了。然后,封板覆盖着一盘机和摇500 rpm在室温下2小时。2洗后,25岁μl的生物素化的检测抗体被添加到每个。盘子被覆盖着一盘封口机和震动500 rpm 1 h在室温下。随后,25μl Streptavidin-phycoerythrin被添加到每个好,封板覆盖着一盘机和摇30分钟在室温下的500 rpm。2洗后,样本在流式细胞分析仪进行测试。结果使用LEGENDplex数据分析软件进行分析。每个分析物的浓度在象形图量化每毫升。

2.7。RNA序列

收集细胞和细胞溶解的试剂盒,和总RNA提取根据制造商的指示(表达载体)。RNA是量化使用Nanodrop分光光度计(热科学)。RNA序列是由广东Longsee生物医学有限公司有限公司标准协议。标准的生物信息学分析是由广东Longsee生物医学有限公司有限公司

2.8。动物

女性C57BL / 6小鼠体重20克(8周)从广东购买医学实验动物中心(佛山,中国)。动物实验研究的动物实验伦理委员会批准广东医科大学符合国家动物保健和使用指南。老鼠群居饲养在聚碳酸酯的笼子里的动物设施控制温度( ),湿度40% - -65%,12小时光/暗周期。小鼠适应至少1周之前的研究中,用一个标准实验室的饮食,并允许自由获取饮用水。

2.9。建立和治疗IMQ-Induced鼠Psoriasis-Like皮肤炎症

15小鼠被随机分为三组,每五个老鼠,如下:IMQ对照组,2 d-gmsc治疗组,3 d-gmsc治疗组。0,当天的小鼠剃使用脱毛机和奶油。5%咪喹莫特(IMQ)奶油(四川Mingxin)被用来诱导psoriasis-like皮肤炎症每日剂量为62.5毫克从第一天到第七天,连续。

管理业务的影响进行了测试 200年2 d-gmscs或3 d-gmscsμl通过小鼠尾静脉在第一天和PBS连续第四天IMQ治疗。IMQ对照组收到200的静脉注射μl通过尾静脉PBS的第一天,第四天。银屑病皮肤炎症的严重程度评估使用银屑病面积严重程度指数(PASI)。红斑的程度、缩放、规模或增厚是每个得分从0到4,如下:0,没有;1、轻微;2、温和;3、标志;4、严重。累计PASI评分(红斑+缩放+增稠)计算反射炎症的严重程度。所有的老鼠都牺牲了8天,和血液、脾、和皮肤采集样本进行进一步的研究。

2.10。组织学和免疫组织化学分析

后面所有小鼠的皮肤和10%多聚甲醛溶液固定(PFA)。组织学研究,石蜡包埋部分沾hematoxylin-eosin(他)染色。免疫组织化学研究石蜡包埋部分(4μ米)和二甲苯deparaffinized,患者分级乙醇,加热10 L更易与柠檬酸钠缓冲(pH值6.0)为抗原检索。与2.5%的山羊血清PBS阻塞后,一夜之间被孵化的部分在4°C (TNF -主要抗体α、白介素、干扰素-γ,发现IL-17A),然后使用通用immunoperoxidase ABC工具包。所有的部分都与苏木精复染色。使用光学显微镜图像捕获(奥林巴斯)。

2.11。统计分析

所有数据了 至少有三个独立的实验。实验和对照组之间的差异进行了分析双尾未配对的学生的 - - - - - -使用GraphPad棱镜7软件进行测试。一个值小于0.05的被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。描述的2 d和3 d的文化条件下业务

如图1(一),我们已经成功地从牙龈组织和细胞表现出孤立的业务spindle-like形态(图2 d文化条件1(一))、自发地聚合成三维球状体增长条件下的超低附件(图1(一)B)。分化成骨、脂肪形成的实验的结果表明,业务有多种分化能力(图1(一)C和D)。流式细胞仪分析显示业务细胞强烈MSC阳性标记CD29、CD44, CD73, CD90、CD105,但对造血细胞标记CD14不利,CD19, CD34、CD45(图1 (b))。这些与我们先前的研究结果一致3]。流式细胞术分析的结果表明,3 d-gmscs也消极CD14表达,CD19, CD34、CD45(图1 (b))。和的表达CD29、CD44、CD73 CD90、CD105是减少,而2 d-gmscs(图1 (b))。细胞增殖的结果表明,增殖率三维培养条件下的业务(3 d-gmscs)相比,减少业务在2 d文化条件下(2 d-gmscs)(图1 (c))。值得注意的是,当3 d-gmscs重新种植在2 d文化条件,重新种植的细胞增殖率3 d-gmscs (RA-3D-GMSCs)恢复,类似于2 d-gmscs(图1 (c))。RNA 13844筛选基因测序结果显示,共1312个,1022个基因表达明显调节显著下调3 d培养业务相比,二维培养业务( )(数据2(一个)- - - - - -2 (c))。基因本体论分析差异表达基因的注释使用数据库,执行可视化和综合发现(大卫)在线工具。去的结果分析发现,改变的生物过程(BPs)差异表达基因显著改变信号转导,炎症反应和氧化还原过程(图2 (d))。细胞中差异表达基因的改变组件(CC)主要是位于质膜,细胞外的外来体,和细胞外区域(图2 (d))。在分子水平上改变基因的功能(MF)主要是与细胞外基质结构组成,胶原蛋白绑定和生长因子活动(图2 (d))。

3.2。业务减弱IMQ-Induced小鼠Psoriasis-Like皮肤炎症的症状在2 d和3 d的文化条件

确定业务也有一个有效的治疗牛皮癣,这种效应是否与不同mechanobiological业务的行为,我们建立了小鼠模型的IMQ-induced psoriasis-like皮肤炎症,被注射2 d-gmscs和3 d-gmscs。在图所示的干预策略3(一个)。背部皮肤的形态观察图所示3 (b)。IMQ对照组小鼠表现出最严重的症状红斑、缩放、严重程度和厚度不断增加到年底IMQ应用7天。然而,2 d-gmsc和3 d-gmsc治疗显著降低小鼠的皮肤损伤的严重程度。我们也评估的严重性psoriasis-like皮肤和皮肤损伤的总分天通过PASI评分系统1 - 8。帕斯分数逐渐增加IMQ对照组老鼠。有趣的是,2 d-gmsc和3 d-gmsc治疗明显降低PASI评分(图3 (c))。这些结果表明,业务减弱IMQ-induced小鼠psoriasis-like皮肤炎症的症状在2 d和3 d的文化条件。

3.3。业务减弱皮肤炎症IMQ-Induced鼠Psoriasis-Like皮肤炎症在2 d和3 d的文化条件下

他染色进一步证实2 d-gmscs和3 d-gmscs明显降低表皮厚度(图4(一))。免疫组织化学研究表明,治疗2 d-gmscs和3 d-gmscs抑制TNF的表达α、白介素、干扰素-γ和IL-17A(数字4 (b)和4 (c))。我们还分析了水平的il - 6、IL-17A IL-17F, IL-21, il - 22生成时,TNF -α和干扰素-γ在皮肤上溶解产物。2 d-gmsc和3 d-gmsc治疗显著降低il - 6的水平,TNF -α,IL-17F IL-17A IL-21和增加皮肤的il - 10水平相比,在控制(图4 (d))。这些结果表明,业务大幅减少促炎反应,而移植IMQ-induced小鼠psoriasis-like皮肤炎症的抗炎反应在2 d和3 d的文化条件下。

3.4。业务强烈影响炎症介质的表达和脾CD25⁺CD3⁺和IL-17⁺CD3⁺IMQ-Induced小鼠的T细胞反应Psoriasis-Like皮肤炎症在2 d和3 d的文化条件下

此外,老鼠脾脏体积和脾脏/体重比2 d-gmsc和3 d-gmsc组减少IMQ相比对照组(图5(一个))。此外,我们确定的百分比Th17 Treg细胞在小鼠的脾和脾细胞CD3的老鼠染色,CD25和IL-17A。2 d-gmsc和3 d-gmsc治疗后,IL-17A的百分比⁺CD3⁺T细胞明显减少,而CD25的百分比⁺CD3⁺T细胞是与IMQ对照组相比显著增加(数据5 (b)和5 (c))。这些数据表明,业务可以调节脾脏Th17 Treg IMQ-induced小鼠psoriasis-like皮肤炎症反应在2 d和3 d的文化条件。我们还分析了水平的il - 6、il - 10 IL-17A, IL-17F IL-21, il - 22生成时,TNF -α和干扰素-γ在血清中。如图5 (d)水平的il - 6、TNF -α,IL-17A il - 10和小鼠的血清il - 22生成明显减少2 d-gmsc和3 d-gmsc组与IMQ相比对照组(图5 (d))。这些数据表明,业务可以调节血清炎症介质的表达IMQ-induced鼠psoriasis-like皮肤炎症在2 d和3 d的文化条件下。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们成功地从人类牙龈组织分离出业务,这些细胞显示成骨和脂肪形成的分化能力。此外,隔离业务积极表达CD29、CD44, CD73, CD90、和CD105但没有表达造血干细胞标记物如CD14、CD19、CD34、CD45。传统上,二维培养条件已经被用来作为标准技术体外msc的扩张。与2 d细胞培养相比,3 d文化被认为是更好的保留更多的生理特征(20.]。在我们的研究中,我们首先观察到三维培养条件下业务的增长。他们自发地聚合成球状体条件下的超低附件。此外,增殖率越低表明3 d文化影响业务的发展特点。接下来,基因的RNA序列分析表明,很多参与骨化,细胞因子,间充质细胞分化和趋化性不同的监管3 d-gmscs d-gmscs相比,2。一些先前的研究UC-MSCs和人类骨髓和脂肪tissue-derived msc透露,3 d文化造成很大upregulation angiogenetic基因和促进促炎和抗炎基因在转录水平的表达(21]。

RNA序列分析后,我们专注于3 d的影响文化的immunophenotype 3 d-gmscs通过流式细胞术。类似的观察MSC标记表达式3 d-gmscs和2 d-gmscs,而有趣的是,CD44的表达,CD90 3 d-gmscs表达下调。CD73 (Ecto-5 - - - - - -核苷酸酶,e-5NT)病原细胞外ATP代谢酶,可以转化为ATP免疫抑制腺苷;因此,它被认为是免疫的一个重要中介(22]。一些研究表明,CD73表达减少3 d spheroid-derived msc相比二维培养的msc (23,24]。一致,我们的结果也显示CD73表达式是在蛋白质水平表达下调3 d spheroid-derived msc。CD90 (Thy1)是一个glycophosphatidylinositol-anchored膜蛋白高表达的msc (25]。据报道,体内和体外,periosteum-derived细胞成骨潜力排序与CD90高于未排序的细胞(26]。最近,一项研究表明,与msc与野生型小鼠相比,msc的成骨分化能力Thy1基因敲除小鼠(减少27]。在一起,这些发现表明,CD90与成骨分化有关。最近的研究表明,三维球状体从超导公司和WJ-MSCs显示成骨的标记Runx2的高表达,骨桥蛋白,高山在mRNA水平比二维培养细胞(28,29日]。我们目前的研究显示,3 d-gmscs施加CD90 mRNA和蛋白的低表达水平比2 d-gmscs。

牛皮癣是一种慢性,Th1 / Th17-mediated炎性疾病,这是相关的异常角化细胞的过度增殖和分化,导致红斑、厚度、和鳞状斑30.]。它影响了全世界估计有1.25亿人(31日]。最初,Th1细胞,这些细胞产生的细胞因子,如肿瘤坏死因子-α和干扰素-γ,与牛皮癣有关32]。大量研究表明,Th17细胞和炎症介质起着重要的作用在银屑病的发病机制33]。Th17细胞因子,如白介素、IL-17A IL-17F, IL-21, IL22,作用于角质细胞,导致他们的激活和overproliferation34,35]。角化细胞激活反过来促进炎症细胞(招聘34,35]。目前的临床治疗牛皮癣完全包括局部药物,包括维生素D3类似物,局部皮质类固醇,钙调磷酸酶抑制剂,角质层分离的生物制剂,抑制肿瘤坏死因子-α白介素、IL-13 IL-17, IL-23 [31日]。

IMQ toll样受体的激动剂(TLR) 7和8,用于治疗疣,并已广泛用于诱导psoriasis-like皮肤炎症(36]。多项研究表明,msc及液源自msc可以有效改善psoriasis-like皮肤损伤小鼠模型(37- - - - - -39]。,这是第一个研究调查2 d的治疗潜力养殖业务和spheroid-derived业务IMQ政府psoriasis-like损伤诱导的小鼠模型。我们的研究结果表明,业务减少了红斑,皮肤厚度,扩展对psoriasis-like施加保护效应引起的皮肤炎症IMQ 2 d和3 d的文化条件下。此外,他染色证实2 d-gmscs和3 d-gmscs可以防止角质细胞的增殖和分化异常。脾脏是一个主要器官的免疫系统,分泌多种immune-active细胞因子;因此,免疫活动中发挥着重要作用。在这项研究中,我们发现2 d-gmscs和3 d-gmscs显著地抑制脾脏对体重的比例,表明业务在2 d和3 d的文化条件下可以调节脾脏的炎症免疫细胞产生炎症免疫反应与系统性antipsoriatic效果。业务在3 d和2 d的培养也有类似的效果。我们发现2 d-gmscs和3 d-gmscs可以抑制IMQ-induced炎症psoriasis-like小鼠模型。2 d-gmscs和3 d-gmscs显著降低血清水平的Th1细胞因子(TNF -α和il - 6), Th17细胞因子(IL-17A和il - 22生成)和il - 10,这意味着静脉注射2 d-gmscs和3 d-gmscs抑制IMQ-induced炎症。一致,这些结果中观察到的皮肤;相反,il - 10的水平提高。这些结果表明,2 d-gmscs和3 d-gmscs抑制IMQ-induced Th1 / Th17细胞因子和牛皮癣的皮肤变化。但是,还需要进一步的研究来确定业务的确切分子机制的抗炎作用有关。最后,我们测量的百分比Treg和Th17老鼠脾脏。我们发现Treg细胞增加的比率与2 d-gmscs和3 d-gmscs治疗后,虽然Th17细胞的比率下降,表明2 d-gmscs和3 d-gmscs发挥免疫调节和抗炎作用。总之,我们显示,移植2 d-gmscs和3 d-gmscs的治疗潜力psoriasis-like皮肤损伤的治疗。

数据可用性

所有的数据用于支持本研究的结果中包括这篇文章。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

梁Ziyu你们和李执行数据收集和数据分析和写的手稿。Bihua林和李Yanyun执行数据收集和数据分析,本文回顾和检查。果河柴和Jiachun连执行数据的收集。Xueying张和Zhengping切进行了数据分析。金城曾庆红进行构思和设计、金融支持、数据分析和解释,手稿写作。作者已阅读并认可最后的手稿。林Ziyu你们,李赛梁和Bihua应当被视为共同第一作者。

确认

本研究支持由广东基础研究和应用基础研究基金会(2019 a1515110042和2019 a1515011713),普通大学的特色创新实验项目在广东省(2020 ktscx044),广东医科大学的学科建设项目(4 sg21266p),广东医科大学学生创新实验项目(GDMU2019012、GDMU2020012 GDMU2020058, GDMU2020212, ZZDM004,和ZDG006),广东省和医学科学基金会(A2020211)。