文摘

之前的研究表明,间充质干细胞(MSC)移植的组合和电针刺激(EA)刺激是治疗脑出血的神经保护策略(我)。然而,联合治疗促进神经保护的潜在机制仍不清楚。本研究旨在探讨综合治疗在突触可塑性的影响,阐明他们的潜在机制。因此,老鼠我注射胶原酶和肝素,建立的模型和动物随机分为模型控制(MC),电子艺界(EA)刺激,MSC-derived neuron-like细胞移植(MSC-dNLCs)和MSC-dNLC移植结合EA刺激(MSC-dNLCs + EA)组。我们观察到大脑的超微结构,并测量了大脑含水量(公约)和水平microtubule-associated蛋白2 (MAP2) galactocerebrosidase (GALC)和胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)的蛋白质。我们也测量了水平的磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)和70 kDa核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)蛋白,以及synapse-related蛋白质的表达。公约增加在我老鼠在我和显著降低大鼠治疗MSC-dNLC移植,EA刺激,或联合治疗。同时,我后,血管数量的增加更明显,但只有结合治疗血管减少老鼠中接收三个治疗。GALC,此外,水平MAP2突触后密度95 (PSD95)和synaptophysin (SYP)蛋白质磷酸化mTOR的水平以及p70S6k蛋白质,增加MSC-dNLCs + EA组相比那些MSC-dNLCs和EA组。与MC组相比,MSC-dNLCs GFAP表达显著降低,EA和MSC-dNLCs + EA组,但三个治疗组之间的差异并不显著。 In addition, the number of synapses increased only in the MSC-dNLCs+EA group compared to the MC group. Based on these data, the combination of MSC-dNLC transplantation and EA stimulation exerts a synergistic effect on improving the consequences of ICH by relieving cerebral edema and glial scarring, promoting the survival of neurons and oligodendrocytes, and activating mTOR/p70S6K signaling to enhance synaptic plasticity.

1。介绍

脑出血(我)是神经系统的一个关键原因全球发病率和死亡率(1- - - - - -3),估计全球每年导致超过100万人(4]。我后,血肿和水肿引起氧化应激和炎症反应,会引起,和活性氧(ROS)生成,这可能会引起大量的神经细胞的死亡。超过30%的我的幸存者生活在严重的运动障碍,和超过70%的患者认知障碍(5,6),但一些行之有效的治疗方法在临床实践中使用(2,7- - - - - -9]。

间充质干细胞(msc)被认为是有前途的种子细胞神经系统疾病,因为他们的性质弱免疫原性,安全性好,容易培养(10- - - - - -12]。许多研究已经证实,msc改善神经功能恢复后我(13- - - - - -17]。然而,移植msc显示有限的能力,修复受损组织,因为他们不大幅提高synapse-related在大脑受损的蛋白表达(18,19]。电针刺激(EA)是中药领域的一部分。一些研究表明,EA改善神经功能在大脑中与我的主题20.- - - - - -23]。EA的移植msc结合疗法对治疗效果好吗?先前的研究已经表明,移植msc结合EA刺激促进轴突再生和功能恢复的脊髓受伤24,25),导致一个更好的治疗效果增加神经营养因子的表达,调节神经发生,增加移植的神经分化细胞缺血性中风与单一疗法(26,27]。我们也证实,联合治疗改善神经功能的老鼠与我之前的研究(28]。然而,msc的确切机制结合EA改善神经系统功能还有待进一步探讨。

我后,摧毁了大脑结构诱发突触结构的破坏。增加突触可塑性和重建神经功能恢复神经功能的基础网络。突触可塑性是神经细胞的能力修改他们的连接和参与脑损伤后大脑网络改造(29日]。尽管突触可塑性被广泛澄清在许多其他疾病,包括阿尔茨海默病(30.和情绪障碍31日],很少有人研究出血性脑损伤。哺乳动物雷帕霉素靶(mTOR)信号通路的感官和集成了各种环境信号调节有机体的生长和体内平衡和调节重要的细胞过程,包括细胞增殖、生长、生存、和流动性32]。此外,激活mTOR增加突触信号蛋白的水平和增加新的棘突触的数量和功能在抑郁大鼠(33]。通过磷酸化的两个关键mTOR促进蛋白质合成效果器,其中一个是70 kDa核糖体蛋白S6激酶(p70S6K) [34]。到目前为止,研究很少关注mTOR / p70S6K信号相关的变化我后突触可塑性。

在这个实验中,我们审查的影响结合治疗MSC-derived neuron-like细胞(MSC-dNLCs)和EA对大脑含水量(公约),血管和神经突触的数量,标记蛋白质的表达的神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,synapse-associated蛋白质,和水平的磷酸化mTOR p70S6K蛋白质有我的老鼠。我们也调查了联合治疗对突触可塑性的影响和可能的机制。

2。材料和方法

2.1。动物

健康的成年Sprague-Dawley老鼠体重介于200和250 g的SPF实验动物中心提供的西南医科大学(中国四川泸州)。他们被安置在同一种动物保健设施标准温度( °C)、照明(12/12 h光/暗周期),和相对湿度( )和免费的食物和水。动物实验的程序依法进行指导和建议实验室动物保健和使用的科学技术部规定的中国。动物是动物伦理委员会批准的协议西南医科大学动物中心(中国四川泸州)和实验过程进行了优化,以减少动物的数量和减轻实验动物的痛苦经历。老鼠被随机分成5组:虚假的操作()组、模型控制(MC)集团MSC-dNLC移植(MSC-dNLCs)组,EA刺激(EA)集团和联合治疗MSC-dNLC移植和艺电刺激(MSC-dNLCs + EA)组,分配给以下5个实验程序,分别为(图1(一))。

2.2。脑出血大鼠模型

老鼠被腹腔注射麻醉剂量的40毫克/公斤的1%戊巴比妥钠和固定在一个立体定位器(在卧姿),同时保持前和后囟门勒在同一水平上。头皮是雕刻的矢状约10毫米;然后,前囟门被暴露在治疗后30%的H₂O₂。钻(1毫米)是一个磨孔右侧侧颅顶的骨点3毫米和0.2毫米前前囟门。混合物含有肝素(1μ2.0 l, U /μ我(左)和胶原酶2μ0.125 l, U /μl)卷入了一场5μl微量调节注射器。针固定在立体定位器和插入尾状核(地点:6毫米深度的孔);注射点的位置原理图(图所示1 (b))。然后,慢慢注入混合。注射后,毛刺孔是用骨蜡封起来的,和皮肤缝合。虚假的组接受相同的程序如上所述,除了混合物没有注射。

2.3。艺电刺激

艺电刺激进行如我们之前所述研究[20.]。老鼠MSC-dNLCs + EA和EA组与EA建模成功后48小时刺激。两个无菌针灸针的直径0.25毫米插入Baihui (GV20)和Dazhui (CV14)穴位和连接到g - 6805型EA刺激器(HM6805,中国)。老鼠与连续波的电流刺激1马,3赫兹的频率,刺激持续时间10分钟一天一次。EA进行连续14天,直到老鼠牺牲。

2.4。msc的复苏和文化

大鼠msc与绿色荧光蛋白(GFP)标记(Cyagen生物科学,中国)28]从液氮取出,在37°C水浴解冻,然后离心机。离心后,msc在alpha-minimum resuspended必不可少的媒介(αmem) (HyClone)补充10%胎牛血清(的边后卫,HyClone), 100毫克/毫升链霉素和100 U /毫升青霉素和孵化在湿润的气氛中有5%的公司₂在37°C。msc上升到80%融合时,细胞使胰蛋白酶化使用0.25%胰蛋白酶和1毫米EDTA和通道。msc在章节3 - 6被用于后续的实验。

2.5。MSC移植

在移植之前,msc诱导如我们之前所述研究[35]。总之,msc治疗入伍前的介质组成的αmem补充1 10%的边后卫,更易与lβ巯基乙醇(β加)24小时,然后用神经感应介质组成的αmem补充1更易/ lβ加,2%二甲亚砜(DMSO)和1μmol / l all-trans维甲酸(RA)(σ)6小时。随后,MSC-dNLCs收集,细胞密度调整 细胞每毫升。然后,一个MSC-dNLC悬架(20μl)提取微量调节注射器和注射到大脑(位置:前囟门的权利:3毫米;前的前囟门:0.2毫米;深度:6毫米)的老鼠MSC-dNLCs + EA和MSC-dNLCs组2的注射速度μl / min后48小时内,当老鼠成功建模。然后,用骨蜡封闭针洞,和皮肤缝合和消毒。

2.6。脑水肿的考试

公约是衡量使用之前报道的方法(36]。简单地说,动物被麻醉,然后斩首。大脑很快被删除,和基底神经节分离,重精密电子天平上立即确定湿重。在烤箱烘干后24 h在100°C,合适的基底神经节再次称重测量干重。公约是计算 。

2.7。免疫组织化学

老鼠被管理麻醉过量的腹腔内注射戊巴比妥钠和先后与0.9%生理盐水和4%多聚甲醛灌注transcardially 0.01磷酸盐(PBS, pH值7.4)。随后,大脑被移除,前后缀,脱水冷冻切片厚度10被削减μm与冷冻切片机(CM1950、徕卡、德国)。

透化作用后特里同x - 100 0.3% 0.01 PBS 30分钟在室温下(RT)和阻塞山羊血清为10%,部分应用了以下主要抗体:兔子anti-laminin(博士德、中国、稀释1:100),鼠标anti-MAP2(美国圣克鲁斯,稀释1:200),兔子anti-GALC(美国表达载体稀释1:200),鼠标anti-GFAP(美国圣克鲁斯,稀释1:200),兔子anti-mTOR(美国CST,稀释1:200),鼠标anti-p70S6K(美国圣克鲁斯,稀释1:200),鼠标anti-PSD95(美国圣克鲁斯,稀释1:200),和鼠标anti-synaptophysin (SYP)(美国圣克鲁斯,稀释1:200),被稀释1% BSA / PBS ( )。的部分主要抗体孵育过夜在4°C,然后孵化与辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit或anti-mouse二级抗体(美国英杰公司)为1.5 h RT。部分顺序diaminobenzidine和苏木精染色。最后,切片成像使用显微镜(日本奥林巴斯)。

2.8。免疫荧光染色

冻结部分是用0.01 PBS 10分钟,然后洗净处理0.3% Triton x - 100 RT 20分钟。与10%阻塞后正常山羊血清在37°C 30分钟,样本与孵化主要抗体(MAP2, GALC, GFAP、PSD95 SYP)一夜之间在4°C在湿润条件下,然后用Alexa萤石孵化594 -共轭山羊anti-mouse /兔免疫球蛋白g(1: 500年,英杰公司)在RT 60分钟。最后,部分被沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)和荧光覆盖安装介质(Dako)。

2.9。西方墨点法

麻醉后,动物被斩首,脑组织从老鼠收集在不同的团体在冰冷的均质蛋白提取试剂。然后,每个样本的总蛋白浓度不同群体使用BCA蛋白质分析量化。等量的蛋白质(50μg)是由钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳分离和转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。然后,膜与初级孵化抗体MAP2(稀释1:1000),GALC(稀释1:1000),GFAP(稀释1:1000),mTOR, p-mTOR(美国CST,稀释1:1000),p70S6K, p-p70S6K(美国圣克鲁斯,稀释1:1000),PSD95(稀释1:1000),SYP(1: 1000),和GAPDH(英国Abcam稀释1:10000)在一夜之间在4°C。孵化后HRP-conjugated山羊anti-mouse /兔免疫球蛋白(美国Bio-Rad稀释1:2000)在为2 h RT,膜的沉浸在一种增强化学发光(ECL)解决方案(美国微孔)和暴露使用Image-Quant ECL成像仪。蛋白质含量归一化到相应数量的GAPDH和分析一个软件使用数量。

2.10。超微结构的观察

老鼠麻醉,他们的大脑被删除,和caudoputamen样本(外围血肿区)被切割成1毫米³件在4°C和3%戊二醛固定。与1%的四氧化锇固定后2 h,作品通过一系列分级的丙酮脱水的解决方案,与丙烯环氧渗透,嵌入在环氧树脂618树脂。部分在40纳米的厚度,减少安装到200 -铜网格,网格和观察jem - 1400系列透射电子显微镜(TEM)(日本电子光学实验室,日本)。数字图像的标本获得使用一个集成的高灵敏度互补金属氧化物半导体(CMOS)相机和分析由经验丰富的电子显微镜化验员。

2.11。统计分析

参数数据分析软件和显示使用GraphPad棱镜8 的方法(SEM)。多个组之间的显著差异进行了分析使用单向方差分析,和 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。感应和msc移植

msc用GFP标记增长集群中的形状和荧光显微镜下呈现绿色荧光(图2(一个))。与神经诱导培养基诱导后,MSC-dNLCs显示变化类似neuron-like细胞(图2 (b))。出血性地区仍在基底神经节地区看到冠状切口(图2 (c))。移植MSC-dNLCs观察大鼠从MSC-dNLCs MSC-dNLCs + EA组(图2 (d))。

3.2。结合治疗降低了血管和减毒脑水肿的数量

层粘连蛋白免疫组织化学染色法是用来观察血管。血管的数量明显增加大鼠在我( ),和联合治疗显著降低血管的数量( )与MC集团( ),但三个治疗组血管的数量没有显著差异( )(数据3(一个)和3 (c))。TEM显示,尽管血管周围的组织结构是在我老鼠,每组的血管结构完整(图3 (b))。老鼠在我的公约显著增加( )但减少EA, MSC-dNLCs MSC-dNLCs + EA组与MC组( )(图3 (d))。此外,EA刺激和联合治疗减少了公约在更大程度上比我MSC-dNLC移植大鼠(图3 (d))。

3.3。联合治疗增加MAP2和GALC蛋白质的水平和减少GFAP蛋白的水平

MAP2的表达式(神经元标记),GALC(少突细胞标记),和GFAP(星形胶质细胞标记)蛋白质检测使用免疫组织化学染色和免疫印迹。数据4(一)-4(c)的分布MAP2, GALC和GFAP-positive细胞。免疫荧光染色显示的移植细胞(GFP-positive细胞)coexpressed MAP2, GALC, GFAP MSC-dNLCs和MSC-dNLCs + EA组(数字4(d) -4(f))。免疫印迹结果表明MAP2和GALC蛋白质的水平下降,但GFAP蛋白水平增加老鼠在我( ,数据4(g) -4(j))。与MC组相比,MAP2蛋白质的表达水平增加和MSC-dNLCs + EA组,和GALC蛋白水平增加MSC-dNLCs和MSC-dNLCs + EA组,但GFAP蛋白水平的下降在EA, MSC-dNLCs, MSC-dNLCs + EA组( ,数据4(g) -4(j))。此外,MAP2和GALC蛋白质水平显著增加MSC-dNLCs + EA组相比EA和MSC-dNLCs组( ,数据4(g) -4(我))。

3.4。联合治疗增加Synapse-Related蛋白质的水平

数据5(一)和5(b)显示PSD95和SYP immunopositive产品的分布。此外,组织学评估移植MSC-dNLCs证实了coexpression GFP和PSD95或SYP MSC-dNLCs和MSC-dNLCs + EA组(数字5(c)和5(d))。免疫印迹分析显示下降水平PSD95和SYP蛋白质的老鼠在我( ,数据5(e) -5(g))。PSD95表达增加EA, MSC-dNLCs MSC-dNLCs + EA组,和SYP表达增加MSC-dNLCs MSC-dNLCs + EA组与MC组( ,数据5(e) -5(g))。此外,结合治疗明显增加PSD95和SYP蛋白质的水平较单一治疗( ,数据5(e) -5(g))。

3.5。联合治疗增加突触的数量

定量研究突触的突触密度计算退化,结果显示减少了突触的数量(每100人μ米²我(后)的老鼠 )。然而,没有发现显著差异在突触的数量在EA, MSC-dNLCs, MSC-dNLCs + EA组(图6)。此外,突触数量的增加在只有MSC-dNLCs + EA组的价格相比MC集团( ,图6)。

3.6。激活mTOR和p70S6K联合治疗

免疫组织化学染色显示mTOR和p70S6K蛋白表达在所有组(数字7(一)和7 (b))。免疫印迹结果显示明显的磷酸化水平降低mTOR和p70S6K蛋白质的老鼠在我( ,数据7 (c)- - - - - -7 (f))。EA刺激增加蛋白质磷酸化mTOR的水平,和MSC-dNLC移植增加磷酸化mTOR的水平和p70S6K蛋白( ,数据7 (c)- - - - - -7 (f))。此外,与MSC-dNLCs和EA组相比,蛋白质磷酸化mTOR的水平和p70S6K MSC-dNLCs + EA组明显增加( ,数据7 (c)- - - - - -7 (f))。

4所示。讨论

本研究调查的影响结合MSC-dNLC移植和艺电刺激对突触可塑性及其分子机制在我的老鼠。为此,我们评估细胞生存,突触的数量,synapse-associated蛋白质的水平,和水平的磷酸化mTOR p70S6K蛋白质。结果表明,联合治疗产生协同效应提高突触可塑性通过mTOR / p70S6K信号。

我后,脑水肿发生早期,大约75%的最大体积的大幅增加在第一个24小时,然后继续发展在一段天近2周(2,37,38]。脑水肿是放射性标记,导致贫困的结果我由于我后继发损伤患者38- - - - - -40]。在这项研究中,我们的研究结果表明,三种不同治疗减少了公约在我老鼠,而公约降低了更重要的是比MSC-dNLCs MSC-dNLCs + EA组。因此,EA MSC-dNLC移植后刺激进一步减轻脑水肿。层粘连蛋白的主要功能组件的血管基底膜在大多数组织(41- - - - - -43),已被用于可视化血管通过免疫组织化学染色。层粘连蛋白超表达,这是一个的后果的血管性水肿及可以促进新生成的血管的移植修复血脑屏障(BBB)中断44]。层粘连蛋白损失加剧BBB破坏大脑通过调节水在我老鼠体内平衡45]。数量的增加在这个实验中,我们观察到血管的MC, EA MSC-dNLCs,和MSC-dNLCs + EA组相比,所以集团和血管结构完好无损。有趣的是,联合治疗的血管数量减少我的老鼠。结合治疗抑制血管增生,数量适当的血管可能会降低我的老鼠的公约。

我可能会导致大量细胞死亡,包括胶质细胞和神经元46,47),通过许多机制在大脑中,如炎症(48),氧化应激(49),和细胞毒性50]。少突细胞和神经元死亡与髓鞘脱失和神经功能障碍(51,52]。活性astrogliosis,病变与中枢神经系统损伤,可能促进大脑修复,减少神经损伤(53]。反应性星形胶质细胞通过分泌神经营养物质起到有益的作用,保护神经元在早期阶段54]。然而,反应性星形胶质细胞的过度增殖导致胶质疤痕形成,这肯定会损害轴突生长和神经网络重建后时期(53,54]。之前的研究在中风暗示MSC改善MSC移植神经恢复,减少细胞凋亡,抑制疤痕形成,提高反应性星形胶质细胞和oligodendrocyte-related轴突重建(55,56]。msc和EA的治疗可以改善营养等因素的表达水平脑源性神经营养因子(BDNF), neurotrophin-4 (NT4)和血管内皮生长因子(VEGF)在缺血性中风,这都是非常有利于大脑组织再生(26]。MSC移植结合EA治疗神经丝- 200阳性纤维的数量增加和BDA-labeled下行皮质脊髓束(CST)的轴突损伤的脊髓受伤而MSC移植或EA治疗仅下调GFAP的表达和硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)蛋白质与操作控制相比,抑制轴突退化以及促进轴突再生(24]。在目前的研究中,EA刺激增加神经元的生存,和MSC-dNLC移植增加少突胶质细胞的生存,和组合的两个也抑制星形胶质细胞的增殖。此外,一些移植细胞表达标记的神经元和神经胶质细胞。值得注意的是,合并后的治疗产生了协同效应促进神经元和少突胶质细胞的生存,这有助于改善脑组织的结构。

联合治疗的影响突触可塑性的焦点区域表明了增加突触结构分子的水平。psd - 95, glutamatergic兴奋性突触的重要组成部分,是一个支架蛋白,调节突触本地化的粘附分子,通道、受体、信号蛋白(57,58]。先前的研究已经记录了重要角色PSD95在突触的形成和维护,和当前的报道关注PSD95突触发育和可塑性及其分子机制58,59]。SYP被认证为第一个神经终端蛋白(60在突触可塑性[]并执行必要的功能61年]。一些研究表明,与msc coculture增加突触密度的表达式标记(如PSD95和SYP)β42-treated主要海马神经元,EA SYP的水平增加,psd - 95和GAP-43蛋白质,增强突触结构可塑性以及改善大鼠暴露于慢性不可预知的行为表现轻微的压力(62年,63年]。根据我们的数据,MSC-dNLC移植PSD95和SYP蛋白的表达增加,一些移植细胞也表达了PSD95 SYP蛋白质,和EA进一步增加我的两种蛋白质的表达与MSC-dNLCs鼠移植。有趣的是,联合治疗增加突触的数量。因此,我们的研究结果表明,联合治疗可能有助于改善大鼠突触可塑性与我。

mTOR / p70S6K通路参与中风(32,64年]。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,mTOR中央监管机构的蛋白质,脂类,和核苷酸合成、自噬,细胞存活和增殖32,34,65年]。p70S6K mTOR的下游目标之一(66年,67年]。p-mTOR和p-p70S6k蛋白被认为是mTOR活动的标记(68年]。然而,关于是否存在争议mTOR受损的大脑活动是有益还是有害。其活动增加一些neuroprotectants保护受伤的大脑时,包括α硫辛酸,褪黑素,和silibinin [64年,69年,70年),这表明激活mTOR有利于脑损伤。相比之下,研究也报道,mTOR活动是认知功能损害和二甲胺四环素防止认知赤字通过抑制mTOR信号,增加了自噬过程,并增加预处理和突触后蛋白质的表达(SYP和PSD95)在大鼠急性缺血性中风(71年]。我们的结果表明,MSC-dNLC移植增加磷酸化mTOR的水平和p70S6k蛋白质和EA进一步增加mTOR活动我MSC-dNLC移植后大鼠。一些研究人员报道,EA改善学习和记忆功能的移植mTOR的表达与血管性痴呆大鼠或脑缺血/再灌注(72年,73年),和msc影响mTOR信号通过旁分泌作用或液(74年- - - - - -76年]。

最近的研究提供了证据表明中风mTOR的神经保护作用可能是由于它能够增加PSD95和GAP-43蛋白质含量或peri-infarct地区促进神经元结构稳定77年,78年]。李等人报道,mTOR通路激活氯胺酮增加突触信号蛋白的水平(synapsin我PSD95和GluR1)并增加新的突触的数量和功能的前额叶皮层抑郁大鼠模型(33]。正如上面提到的,联合治疗增加synapse-associated蛋白质的表达(SYP和PSD95),结果表明,综合治疗mTOR的保护作用可能与增加突触可塑性的能力在出血性中风。

本研究有一定的局限性。首先,观察mTOR / p70S6K信号及其监管仅限于我大鼠模型。这个信息应该仔细考虑当使用结果,讨论mTOR的作用途径在神经系统疾病。第二,我们没有构建mTOR p70S6K病毒得到进一步证明。mTOR / p70S6K信号是一个有趣的目标在出血性中风,需要在后续研究中进一步的调查。

总之,尽管这项研究的缺点,我们提供的第一个证据组成的联合治疗的协同效应MSC-dNLC移植和EA刺激提高突触可塑性,这可能与激活mTOR / p70S6K信号有我的老鼠。这些发现不仅提供新的神经保护作用的数据组成的联合治疗MSC-dNLC移植和EA刺激但是也提供积极的见解,将提高我们对潜在的分子机制的理解,有助于开发更精确的治疗药物和治疗方法减轻我的结果。

数据可用性

的数据支持本研究的发现可以从相应的作者在合理的请求。

的利益冲突

作者没有利益冲突的声明。

作者的贡献

提供关于杨朱加益,《詹贡献同样这项工作。

确认

这项工作是支持的研究项目的科学基金会中国四川省教育委员会(12 za077),中国四川省应用基础研究项目(2013 jy0075),四川省中医药管理局项目中国(2021 ms499)。