低强度脉冲超声增强脂肪中提取干细胞细胞介导血管生成治疗糖尿病性勃起功能障碍的Piezo-ERK-VEGF轴

文摘

目标。勃起功能障碍是糖尿病的主要并发症。干细胞移植治疗糖尿病性勃起功能障碍是一种很有前途的方法。在这项研究中,我们评估是否低强度脉冲超声波(LIPUS)可以提高脂肪中提取干细胞的疗效(ADSCs)和研究潜在的分子机制。材料和方法。六十8-week-old男性Sprague-Dawley大鼠随机分为正常控制(数控)队列或streptozocin-induced糖尿病性ED组,进一步细分为DM, ADSC, LIPUS, ADSC + LIPUS组。老鼠的ADSC或ADSC + LIPUS组ADSC例。老鼠在LIPUS或ADSC + LIPUS组LIPUS对待。intracavernous压力(ICP)和平均动脉压(MAP)记录在注射后28天。阴茎海绵体组织被收获,进行组织学分析和ELISA。LIPUS细胞增殖和细胞因子分泌的影响能力ADSCs评估体外。核糖核酸测序和生物信息学分析应用于预测机制,免疫印迹和ELISA用于验证。结果。老鼠ADSC + LIPUS组取得了显著高于ICP和ICP /地图比率比DM, ADSC, LIPUS组。此外,大量的海绵内皮和cGMP水平也显著增加ADSC + LIPUS组。体外实验表明,在ADSCs LIPUS促进增殖和细胞周期的进展。分泌的细胞因子如CXCL12 FGF2, VEGF LIPUS也增强。基于RNA序列的生物信息学分析表明,LIPUS刺激可能激活MAPK通路。我们确认LIPUS增强通过Piezo-ERK ADSC VEGF分泌途径。结论。LIPUS增强ADSCs在糖尿病性勃起功能障碍的疗效Piezo-ERK-VEGF通路的激活。ADSC移植结合LIPUS可以应用协同治疗糖尿病性ED。

1。介绍

勃起功能障碍(ED)定义为持续未能达到和/或维持足够的安装达到满意的性交,是常见的男性患有糖尿病(DM) [1]。ED不仅对病人施加沉重的心理负担,但它也损害自己和伴侣的关系,从而大大降低他们的生活质量。目前,口腔5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE5i)是一线治疗ED。然而,由于病理的变化由糖尿病引起的,这些ED患者的反应率PDE5is远非令人满意,并呼吁更有效治疗(2]。

脂肪干细胞(ADSCs)间充质干细胞。越来越多的证据显示,ADSCs multilineage分化潜力,免疫调节效果,angiogenesis-promoting能力(3]。进一步的研究表明,ADSCs可以改善勃起功能在不同的ED大鼠模型4- - - - - -6]。同时,ADSCs丰富方便的皮下脂肪组织中使ADSCs医疗使用(一个有吸引力的解决方案7]。尽管如此,hypocellular活动后注入和海绵体的保留率低仍然抑制ADSC-based治疗的实际应用(6]。

低强度脉冲超声波(LIPUS)是一种特殊的超声波传输脉冲波和携带更少的能量(通常小于3 W /厘米²比传统的超声波)。通常在一个频率范围从1到3兆赫和脉冲1 kHz。到目前为止,LIPUS在ED的效率已经证明在临床前和临床研究(8- - - - - -10]。越来越多的证据表明,LIPUS-mediated干细胞激活在组织再生中起着举足轻重的作用11- - - - - -13]。因此,值得调查ADSC移植补充LIPUS治疗是否会导致一个更好的临床结果。

在目前的研究中,我们用链脲霉素建立糖尿病大鼠模型。勃起功能改进与ICP测量评估。组织学变化进行评估通过免疫荧光染色法和ELISA。基于体外实验,我们研究的影响LIPUS ADSCs的增殖和分泌能力。此外,背后的分子机制LIPUS-mediated ADSC激活也透露。

2。材料和方法

2.1。ADSC文化和识别

Sprague-Dawley大鼠脂肪干细胞(ADSCs)获得Cyagen(广州)。细胞培养的ADSC完全培养基(Cyagen,中国)。媒体是每2天更换一次,并在章节3 - 4,细胞用于实验。成骨诱导和脂肪形成的归纳分析被用于干细胞的鉴定。成骨分化,大约2×10⁴细胞每被播种到6-well板。ADSCs达到70%融合后,媒体被替换成成骨分化(Cyagen,中国)。媒体被每3天更换一次。osteoinduction 2周后,钙结节茜素红染色美国去化验,ADSCs被播种密度的2×10⁴细胞每口井6-well板。细胞被孵化21天在脂肪生成感应媒体(Cyagen,中国),每3天更换一次。脂滴是沾油红O解决方案(Cyagen,中国)。表面标记识别执行使用一只老鼠ADSC分析工具包(Cyagen,中国)根据制造商的推荐协议。

2.2。动物模型建立和ADSC移植

六十8-week-old男性Sprague-Dawley老鼠购自上海通用的动物中心医院。禁食12小时后,10个随机选择的老鼠腹腔内注射车辆(0.1 mol / L柠檬酸溶液,pH值4.5,君威,上海,中国),进入正常的控制(NC)组。其余的腹腔内注射是刚做好的50毫克/公斤链脲霉素(STZ)柠檬酸溶液(Sigma-Aldrich、圣路易斯、钼)。尾静脉血糖监测腹腔内注射后72小时。只有大鼠空腹血糖超过16.7 L更易被认为是糖尿病和筛选进行进一步研究。阿朴吗啡(100μ克/公斤,Macklin、上海、中国)被用于筛查糖尿病性ED老鼠根据一项研究[14]。四十成功建立糖尿病大鼠模型,随机分为糖尿病(DM)控制集团ADSC移植(ADSC)集团LIPUS (LIPUS)治疗组和ADSC移植+ LIPUS治疗(ADSC + LIPUS)组。

大鼠麻醉了Zoletil 50(50毫克/公斤,Virbac,法国)肌肉注射STZ诱导的4周后。老鼠在NC组,DM组和LIPUS组intracavernous注入200μl PBS。总共1×10⁶ADSCs悬浮在200μl PBS的海绵体注射到老鼠的ADSC组和ADSC + LIPUS组。CM-Dil (YEASEN、上海、中国)标记ADSC intracavernous移植实施追踪移植干细胞的命运。短暂,ADSCs孵化CM-Dil缓冲工作在室温下5分钟然后在4°C为15分钟。然后,细胞移植与PBS冲洗两次,收集。约1×10⁶CM-Dil-labeled ADSCs像之前描述的那样的道。1,3,5天后,老鼠都牺牲了,阴茎组织收割,细胞核与DAPI染色。与荧光显微镜图像被抓获。所有动物实验协议是医学伦理委员会批准的上海综合医院。

2.3。LIPUS治疗

后立即ADSC移植,老鼠LIPUS组和ADSC + LIPUS组治疗200 mW /厘米²超声波5分钟,每次由一个低强度脉冲超声治疗机器(WanBeiLi,北京)。超声波的频率设定在1.7 MHz,和脉冲间隔比被调整至1:4 (200μ年代:800μ。老鼠对待LIPUS每周3次共2周。

应用于体外培养ADSCs LIPUS治疗。手机媒体提前刷新超声波照射。一层薄薄的超声波凝胶应用于LIPUS传感器之前严格紧贴的培养板的底部。然后细胞暴露在下列条件下超声波刺激:频率为1.7 MHz,脉冲占空比为1:4 (200μ年代:800μ,不同的能源强度(100 mW /厘米²200兆瓦/厘米²300兆瓦/厘米²),5分钟的曝光时间。

2.4。勃起功能评价

最后LIPUS治疗两周后,intracavernous压力(ICP)和平均动脉血压(MAP)检测评估勃起功能如前所述[8]。的主要盆腔神经节(MPG)和海绵神经(CN)通过腹部中线剖腹手术。肝素化的海绵体是空心(250 U /毫升)23-gauge蝴蝶针连接到一个多通道生理信号记录仪(Goleta MP160 Biopac系统,CA)。一个不锈钢电极钩是用来刺激中枢神经系统。刺激参数5 V, 20 Hz, 5毫秒的脉冲宽度,50秒的时间。的最大ICP增加三刺激每个老鼠都记录了统计分析。地图记录使用23-gauge针插入正确的颈动脉。每个老鼠的ICP /地图比率计算消除个体差异,然后ICP /地图比是用于统计分析。

2.5。免疫组织学

老鼠牺牲之后勃起功能评估,和他们的阴茎是收获,固定,切成5 -μ米部分免疫荧光检测。immunofluorescent染色过程被描述在15]。主要抗体以挪士(Servicebio,武汉,中国)和血管性血友病因子(Servicebio,武汉,中国)。4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)应用于染色细胞核。

2.6。细胞生存能力分析

ADSCs被播种到96孔板的密度1×10⁴细胞每口井。所有贴壁细胞治疗与LIPUS前面所描述的一样。在37°C 24小时孵化后,ADSCs在每个孵化了10μl CCK8解决方案2小时。吸光度检测在使用标450海里。

2.7。集落形成实验

大约500 ADSC细胞被播种到每个6-well板块。每周进行3次LIPUS治疗。14天的孵化后,克隆被固定并与结晶紫染色。

2.8。EdU化验

ADSCs的扩散能力是衡量5-ethynyl-20-deoxyuridine (EdU)分析工具包(Beyotime、上海、中国)。总之,ADSCs被播种到共焦板的密度5×10⁵细胞每口井。然后,10μM EdU缓冲区被添加到培养基中。LIPUS组的细胞治疗与LIPUS前面所描述的一样。孵化后37°C在黑暗中了4小时,ADSCs与PBS冲洗两次,与4%多聚甲醛固定15分钟,和permeabilized 0.3% Triton x - 100 10分钟。细胞核是沾染了赫斯特。图像是用徕卡TCS SP8共焦显微镜捕获。

2.9。细胞周期分析

24小时后LIPUS刺激,ADSCs收获和固定在预冻70%乙醇。细胞周期分析工具包(Beyotime、上海、中国)是用来分析细胞周期ADSCs LIPUS组在对照组或根据制造商的指示。细胞被沾染了π解决方案和检测与FL2通道BD Accuri C6流式细胞术的机器。

2.10。实时定量PCR(存在)

试剂盒试剂(美国生命科技,CA)是用于提取总RNA从ADSCs LIPUS刺激后2小时。PrimeScript RT试剂盒(豆类,大津,日本)是用于生成的互补。定量实时PCR使用结核病绿色预混料交货Taq II工具包(豆类,大津,日本)进行一个QuantStudio™6 Flex实时PCR系统。2 -ΔΔCt法计算比GAPDH基因表达的内部控制。在这项研究中使用的引物补充表中列出1。

2.11。酶联免疫吸附试验(ELISA)

大约50毫克的海绵组织在组织均质裂解缓冲专用一氧化氮测定(Beyotime、上海、中国)和12000×g离心5分钟。BCA的上层清液收集试验(Beyotime、上海、中国)来测量每个样品的蛋白浓度。海绵cGMP水平决定使用一个商业酶联免疫试剂盒(江苏Meibiao生物科技、江苏、中国)。

两小时LIPUS治疗后,对elisa ADSCs上层清液的收集。样品进行了分析使用CXCL12 FGF2, VEGF,神经生长因子,HGF, IGF1商业ELISA试剂盒获得江苏Meibiao生物技术(江苏、中国)根据制造商的协议。吸光度测量使用微型板块读者。

2.12。核糖核酸测序和生物信息学分析

起始LIPUS治疗,两个小时后的总RNA ADSCs对照组或LIPUS组用于RNA序列,由Genergy生物技术有限公司(上海,中国)。差异表达基因(度)与DESeq2 R包标准的基础上| log2FC |≥1和值< 0.05 (16]。前30名度提出了使用pheatmap R包(17]。基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)分析使用在线web工具大卫[18,19]。数据库的字符串(版本:11.5)是用于生成(PPI)网络[蛋白质间交互作用20.]。Cytoscape插件cytoHubba用于识别顶部12基因中心。

2.13。西方墨点法

ADSCs使用PD98059 (hy - 12028, 80μ米,MedChemExpress)、GsMTx4 (HY-P1410A 5μ米,MedChemExpress)和Yoda1 (hy - 18723, 30μM, MedChemExpress)要求1小时,细胞收获2小时后LIPUS刺激不规范。ADSCs细胞溶解在冰里帕缓冲区(Beyotime、上海、中国)含有蛋白酶抑制剂PMSF (Beyotime、上海、中国)和磷酸酶抑制剂鸡尾酒(YEASEN、上海、中国)。细胞溶解产物的蛋白质浓度测定用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime、上海、中国)。蛋白质样品(15μg) 10% SDS-polyacrylamide凝胶分离和转移到聚偏二氟乙烯膜。膜被屏蔽10%牛血清白蛋白(BSA) 1小时在室温下和孵化主要抗体在一夜之间在4°C。本研究中使用的主要抗体ERK (Abcam ab184699, 1: 10000年,美国),p-ERK (Abcam ab76299, 1: 5000年,美国),VEGFA (Abcam ab214424, 1: 1000年,美国),和GAPDH (Abcam ab181602, 1: 10000年,美国)。与TBST冲洗后,膜与二次抗体和杂化反应与发射极耦合逻辑解决方案(不合格品生物科技有限公司、苏州、中国)。化学发光图像拍摄,每个蛋白质带的密度是决定使用ImageJ软件。

2.14。统计分析

结果分析了使用GraphPad Prism 7.00 (GraphPad软件公司,拉霍亚、钙、美国),给出了均值±标准差。双尾学生的两组之间的测试进行了统计分析。单向方差分析之后,图基的多重比较检验是用于比较组间。一个值< 0.05被认为是具有统计学意义。所有的实验都是独立实现至少三次。

3所示。结果

3.1。识别ADSCs LIPUS和生物安全评估

流式细胞术实施调查ADSCs的细胞膜抗原。结果表明ADSCs MSC)阳性标记(CD29、CD44和CD90)但消极CD11b / c、CD34、CD45(图1(一))。ADSCs multilineage分化的潜力也被检查。脂滴的积累脂肪形成的ADSC细胞质被油红O染色(图所示1 (b))。茜素红染色检测到矿化成骨ADSCs中的节点(图1 (c))。LIPUS不同强度的应用于ADSCs评估其生物安全。CCK8结果表明100 mW /厘米²LIPUS ADSCs扩散的影响很小,而LIPUS强度300 mW /厘米²显著抑制细胞增殖。然而,LIPUS刺激在200 mW /厘米²提升在ADSC扩散显著增加(图1 (d))。因此,LIPUS在200 mW /厘米²刺激ADSCs是安全的和有效的。

3.2。ADSC疗法结合LIPUS改善勃起功能在糖尿病大鼠模型

成立于大鼠糖尿病ED体外实验模型。注射STZ后,大鼠血糖水平≥16.7更易与L筛选出来进行进一步的研究。相比NC组(0.89±0.03,0.81±0.02),最大ICP /地图比率和总ICP /地图比率显著降低DM组(0.19±0.02,0.12±0.01),这表明成功建立糖尿病性ED模型(数据2(一个)和2 (b))。Intracavernous注入ADSCs (0.32±0.03, 0.23±0.01), LIPUS治疗(0.46±0.01,0.32±0.02),和Intracavernous注入ADSCs结合LIPUS治疗(0.61±0.02,0.46±0.03)不同程度改善勃起功能,显著升高反映的最大比率和总ICP / ICP /地图地图比例(数字2 (c)- - - - - -2 (e))。显著增加最大ICP /地图比率和总ICP /地图比例ADSC + LIPUS组相比ADSC或LIPUS集团建议协同治疗达到最好的复苏在糖尿病大鼠勃起功能(数据2 (f)和2 (g))。此外,我们使用的监测移植干细胞的命运CM-Dil-labeled ADSCs。ADSC和ADSC + LIPUS组的海绵样品含有相当数量的干细胞移植后一天。三天后,更多的干细胞仍ADSC + LIPUS组。在移植后的第五天,发现了更多的干细胞的ADSC + LIPUS集团在一些细胞中ADSC组。这些发现表明,LIPUS刺激可能延长保留ADSCs阴茎海绵体(补充图1)。

3.3。ADSC疗法结合LIPUS提高海绵内皮在糖尿病大鼠模型

由于海绵内皮是基本正常的勃起,我们分析了内皮细胞的表达通过免疫荧光标记以挪士和vWF评估海绵状血管密度的变化。结果表明,以挪士——和vWF-positive地区降低DM组相比数控组。ADSC移植,LIPUS治疗和协同治疗显著增加的比例以挪士,vWF-positive区域(图3(一个))。此外,以挪士和vWF-positive区域协同组明显高于ADSC或LIPUS集团(数字3 (b)和3 (c))。ADSC疗法结合LIPUS有有利影响内皮内容海绵体。的海绵内皮产生生理功能通过eNOS-NO-cGMP通路调节血管舒张,促进勃起,我们发现阴茎海绵体的cGMP水平对其功能进行评估。图3 (d)表明cGMP水平增加ADSC, LIPUS和ADSC + LIPUS组,而ADSC疗法结合LIPUS提升更为显著增加。最后,这些结果表明,协同治疗导致海绵状血管改善优于单一药物疗法。

3.4。LIPUS疗法提高ADSC扩散

虽然在活体内研究的结果令人鼓舞,LIPUS之间的交互和ADSCs仍然尚未讨论。因此,我们进行了体外实验来进一步研究ADSCs LIPUS的影响。形成集落形成试验结果表明,LIPUS-treated ADSCs殖民地明显多于对照组,表明LIPUS可以促进细胞增殖(数字4(一)和4 (b))。此外,细胞周期分析表明LIPUS治疗的比例降低细胞G0 / G1和年代阶段但G2期细胞的数量增加(数据4 (c)和4 (d))。EdU化验的结果还表明,细胞染色比蓝色和红色,代表增殖细胞,也显著大于LIPUS刺激组(补充图2)。这些结果表明LIPUS增强ADSCs扩散通过促进S-to-G2阶段过渡。

3.5。由ADSCs LIPUS疗法促进细胞因子分泌

鉴于组织再生关键作用的细胞因子,我们进一步评估的影响LIPUS ADSCs的旁分泌功能。存在阐明LIPUS刺激的信使rna表达水平显著调节细胞因子如CXCL12 FGF2, VEGF,神经生长因子,HGF和IGF1(数字5(一个)- - - - - -5 (f))。此外,CXCL12的浓度、FGF2和VEGF在上层清液增广LIPUS治疗后,观察而没有显著变化神经生长因子的水平,HGF, IGF1。这些数据表明,LIPUS提升ADSCs分泌细胞因子,如CXCL12 FGF2和VEGF。

3.6。生物信息学分析LIPUS-Mediated ADSC激活

探索机制LIPUS-mediated ADSC激活,RNA-seq进行进行基因表达分析分析。174年在354个差异表达基因,LIPUS治疗调节基因和表达下调180个基因。热图情节提出了最大的前30名的基因表达(图的变化6(一))。大卫是利用生物信息学资源分析基因本体论(图6 (c))。结果表明,LIPUS监管生物过程参与免疫反应,炎症反应,积极调节血管生成。细胞因子的分子功能,活动,MAP激酶酪氨酸、丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活动,和interleukin-1受体结合被发现被激活。KEGG通路分析确定了LIPUS-mediated肿瘤坏死因子信号通路的激活,nod样受体信号通路,MAPK信号通路,cytokine-cytokine受体相互作用。然而,消化吸收的蛋白质和赖氨酸退化预测抑制。之后,蛋白质相互作用网络使用字符串构造数据库(补充图3)。CytoHubba进一步用于分析前12个中心基因,包括Csf3,处于受控,Cxcl2, Fosb, Hmox1, IL15, IL1a, IL1b、Mpo、Nfkbia Nos3, Nr4a1(图6 (b))。生物信息学分析表明LIPUS可能引发MAPK通路的激活和血管生成。

3.7。影响的LIPUS ADSC ERK-VEGF途径

西方墨点法被用来检测相关蛋白的表达水平来验证生物信息学的结果。LIPUS几乎没有变化的表达总ERK在ADSCs(图7(一))。然而,p-ERK显著增加后立即LIPUS刺激但减少在治疗后2小时(图7 (b))。此外,VEGF的表达也是LIPUS启动后升高,这与ELISA结果(数据是相一致的4 (c)和7 (c))。进一步发现ERK通路之间的关系和VEGF表达,PD98059, ERK1/2通路抑制剂,应用(图7 (d))。p-ERK和VEGF的upregulation LIPUS PD98059管理局(数据后被撤销7 (e)和7 (f))。此外,PD98059废除了LIPUS-induced增强VEGF ADSCs分泌物(图7 (g))。这些结果表明,在ADSCs LIPUS激活ERK通路,进而引发了VEGF表达和分泌。

3.8。压电效应频道LIPUS-Mediated ERK-VEGF途径激活

压电的角色在细胞离子通道mechanosensation已经在其他研究报告(21,22]。GsMTx4,选择性压电通道抑制剂,用于测试压电通道是否主导ERK-VEGF通路的激活在ADSCs(图8(一个))。GsMTx4治疗后,没有显著差异的比值之间总ERK p-ERK GsMTx4-treated组和LIPUS + GsMTx4-treated组(图8 (b))。此外,VEGF蛋白水平的变化不是LIPUS-treated组中观察到的GsMTx4(图8 (c))。ELISA结果还证实,GsMTx4禁止ADSCs分泌VEGF(图8 (d))。相比之下,Yoda1的应用后,压电通道的兴奋剂,在ADSCs p-ERK和VEGF的表达明显增加(数据8 (e)- - - - - -8 (g))。VEGF的分泌也提升了Yoda1(图8 (h))。这些结果表明,压电通道作为上游ERK-VEGF通路的激活LIPUS-mediated ADSC激活。

4所示。讨论

糖尿病是一个常见的勃起功能障碍的危险因素,以及故障的海绵内皮是糖尿病性ED的确定致病因素之一(2]。由于内皮功能恶化,cGMP的原位生产下降和PDE5i很难,其主要药理作用是防止cGMP退化,起到治疗作用[23,24]。ADSC移植已经被各种研究报告来改善勃起功能和组织病理学变化在糖尿病性ED鼠模型(5,6,25- - - - - -27]。然而,ADSC注射疗法的治疗效果远不能令人满意。高葡萄糖和夸张的氧化应激微环境内的海绵体严重减少的可行性道ADSCs,从而削弱他们的功效28- - - - - -30.]。

我们的体内研究的结果表明,ICP /地图比ADSC + LIPUS组高于DM, ADSC,或LIPUS组,表明ADSC的组合移植与LIPUS刺激比单一疗法更有效。此外,以挪士的浓度、vWF、cGMP ADSC + LIPUS组显著增加。这一发现表明,协同治疗促进了海绵内皮的修复,从而改善糖尿病性ED大鼠勃起功能的。

类似于以前的研究(31日- - - - - -34),我们发现LIPUS治疗可以促进ADSCs扩散。进一步的细胞周期分析表明,G2 / M期细胞的比例显著增加LIPUS暴露组但在G0 / G1和年代下降阶段。因此,增强细胞活力LIPUS治疗后保证ADSCs产生治疗效果,有助于改善勃起功能的ADSC + LIPUS组。

由神经干细胞分泌的细胞因子被证明能对感冒起着关键作用在组织修复和再生35,36]。然而,角色检查参与组成分泌腺的LIPUS ADSCs仍不清楚。我们筛选和确定CXCL12的过度表达,FGF2, VEGF LIPUS治疗组。CXCL12(也称为基质细胞衍生因子1 (SDF-1))是一种趋化因子的招聘是众所周知的内源性或移植干细胞(37,38]。最近,山口等人报道,当地注入SDF-1增加新血管形成通过招募内皮祖细胞(39]。哈代等人建立了一个CXCL12-mutated小鼠模型,发现CXCL12是血管和肌肉再生的关键(40]。此外,大量研究表明,FGF2(纤维母细胞生长因子2)和VEGF(血管内皮生长因子)是两个主要的细胞因子在血管生成41- - - - - -43]。因此,它是安全的推测LIPUS-mediated ADSC proangiogenic分泌的因素是另一个原因修改后的海绵内皮微环境和改善勃起功能。

尽管有这些令人鼓舞的结果,详细机制LIPUS调节ADSCs仍然知之甚少。借助生物信息学分析,我们发现,LIPUS-provoked ADSCs介导的血管生成,这是符合体内和体外实验的结果。此外,MAPK通路的激活是预测的差异表达基因,这是符合研究其他类型的干细胞(21,44]。因此,我们调查LIPUS能否促进ADSC-induced血管生成通过激活MAPK通路。ERK磷酸化LIPUS后立即开始治疗,达到10分钟,2小时内保持在高水平。张等人也证明LIPUS治疗可能引发瞬态细胞内钙离子的流入在牙髓干细胞,从而激活ERK信号通路和保持活跃的至少30分钟21]。增加VEGF表达和其在上层清液的浓度升高与PD90859预处理后,废除了一个特定的MEK抑制剂,进一步证实ERK通路的贡献从ADSCs VEGF的分泌。

由于LIPUS是侵入机械疗法,它是有趣的干细胞如何感知和传输机械刺激激活ERK信号通路,一个生物过程。最近,研究人员发现一个家庭的蛋白质称为压电和mechanobiological耦合已经证明他们的不可忽视的作用45- - - - - -47]。Yoda1,因此,压电离子通道激活剂和抑制剂,GsMTX4,实施调查的影响压电ADSCs ERK-VEGF轴上。我们发现GsMTX4抑制磷酸化ERK LIPUS,这引发了ADSCs降低VEGF的分泌。相比之下,Yoda1施加类似的效果随着LIPUS ADSCs通过促进ERK激活和VEGF的分泌。这些结果表明,LIPUS-dependent Piezo-ERK-VEGF轴可能ADSCs被激活的机制之一。

然而,一些问题仍然未得到解决在这个研究。道保留率低干细胞海绵体是另一个因素阻碍他们的力量。尽管我们观察到一个高水平的CXCL12 LIPUS曝光后,角色的LIPUS ADSCs不是招聘的调查研究中但将完全解决在未来的研究中,将移植后细胞的生存。灵感来自LIPUS治疗ED患者的成功(9,10夏),推测mechanobiological转导介导激活组织内源性干细胞可能在这个过程中扮演着一个关键的角色(48,49]。的存在和激活tissue-resident干细胞没有验证本研究但在未来将进一步研究。鉴于我们利用rat-derived干细胞进行实验,我们的结果应该首先在细胞系来源于多方面求证智人临床应用前LIPUS结合ADSC移植。然而,承诺的方法来达到类似的结果从分析基于人性化的细胞系,由于压电,ERK和VEGF进化保守蛋白(45,50- - - - - -52]。最后但并非最不重要,我们想确认我们的发现在未来以人群为基础的研究。

5。结论

LIPUS增强ADSCs在糖尿病性勃起功能障碍的疗效Piezo-ERK-VEGF通路的激活。ADSC移植结合LIPUS可以应用协同治疗糖尿病性ED。

缩写

糖尿病:	糖尿病
艾德:	勃起功能障碍
LIPUS:	低强度脉冲超声波
ADSC:	脂肪干细胞
PDE5i:	5型磷酸二酯酶抑制剂
STZ:	链脲菌素
ICP:	Intracavernous压力
英里/加仑:	大骨盆神经节
CN:	海绵神经
以挪士:	内皮细胞一氧化氮合酶
vWF:	血管性血友病因子
走:	基因本体论
KEGG:	京都基因和基因组的百科全书
PPI:	蛋白质相互作用网络
CXCL12:	C-X-C主题趋化因子配体12
SDF-1:	基质细胞衍生因子1
FGF2:	纤维母细胞生长因子2
VEGF:	血管内皮生长因子。

数据可用性

本研究中所有的数据生成包含在这篇文章中,或者如果没有请联系相应的作者。

伦理批准

所有动物实验协议是医学伦理委员会批准的上海综合医院。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

Shiyun刘设计和实施实验,分析数据,并写了手稿。江Chenyi设计一些实验。王健林,碧惠行陈艘执行的一些实验。Bangmin汉和夏Shujie提供金融支持和监督手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Shiyun刘和江Chenyi贡献同样这项工作。

确认

我们感谢你们刘她在动物实验技术援助。我们也感谢国家自然科学基金会的资金支持。这项研究是支持由中国国家自然科学基金(批准号81930018)。

补充材料

表1:引物用于存在。图1移植ADSCs的命运。居民的数量没有显著差异干细胞移植后观察一天。3和5天后,更多ADSCs保留在海绵体LIPUS治疗组。数据平均值±标准偏差。ns 当比较ADSC组第一天。 当比较ADSC集团第三和第五天。图2 ADSCs的EdU染色。EdU-positive LIPUS治疗组细胞的百分比显著高于数控组。数据平均值±标准偏差。 当比较数控组。图3度的蛋白质相互作用网络ADSCs没有和LIPUS刺激。(补充材料)

引用

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