文摘

椎间盘变性(IDD)是一种退行性疾病,特点是降低矩阵合成和额外的退化,髓核细胞凋亡(npc),以及炎症因素的渗透。芦荟素,芦荟植物的有色化合物,已被证明是有效的对骨骼退化性疾病,但目前尚不清楚这是预防IDD。在此,我们研究了在npc芦荟素的作用。在我们的研究中,促炎因子的upregulation,细胞凋亡,新陈代谢不平衡矩阵被观察到在退行性NP组织。我们发现,芦荟素对细胞外基质代谢和细胞凋亡有疗效TNF - (TNF -α-)npc治疗通过抑制氧化应激和促炎因子表达式。进一步的调查显示,芦荟素治疗抑制TAK1 / NF -κB通路。此外,的表达水平NLPR3 inflammasome在TNF -芦荟素治疗后表达下调α对待npc。总之,我们的结果表明,芦荟素治疗可以逆转肿瘤坏死因子-α全身的新陈代谢不平衡矩阵,通过TAK1 npc / NF -神经细胞凋亡κB / NLRP3轴。这项研究支持,芦荟素可能是一个有前途的治疗代理国际直拨电话。

1。介绍

下腰痛(LBP)是一个普遍的症状发生率高。几乎80%的人都患有LBP一生中,和数量继续上升全球人口老龄化的(1,2]。枸杞多糖对人类健康是一个严重的问题,降低了生活质量,尤其是对年轻患者(3,4]。据报道,残疾人的数量造成的枸杞多糖增加了在过去的三十年,特别是在发展中国家(5,6]。

椎间盘变性(IDD)考虑腰痛的主要原因。椎间盘的纤维环、髓核和终板(7]。各种病理变化有关IDD的病因和进展,包括在细胞外基质(ECM)代谢紊乱,细胞凋亡的npc,和过度的炎症因素,包括β及肿瘤坏死因子-α(8,9]。ECM分泌基本上由npc,其破坏特点是过度分解代谢和合成代谢不足,胶原蛋白II和aggrecan差别伴随着对这些矩阵的upregulation metallopeptidases(基质金属蛋白酶)10,11]。细胞凋亡的npc也被认为是IDD的重要病理变化。研究基于IDD的髓核组织患者显示细胞凋亡率增加,诱发细胞凋亡的因素npc的过度表达,包括炎性因子和氧化应激水平(12- - - - - -14]。

作为配体的肿瘤坏死因子超家族的重要成员,TNF -α据报道面积参与IDD的发展(15,16]。它已经表明,肿瘤坏死因子-的浓度α增加IDD的加重(17]。肿瘤坏死因子的水平α的增加,可以显著提高基质金属蛋白酶的表达和ADAMTSs,和减少aggrecan和胶原蛋白的表达水平II,导致ECM的降解(18,19]。此外,肿瘤坏死因子-α一直认为NPC细胞凋亡中发挥重要作用,能提高多种促炎细胞因子的表达水平,如细胞色素C氧化酶亚基2 (cox - 2)和诱导一氧化氮合酶(间接宾语),放大炎症反应和加剧IDD [20.- - - - - -22]。因此,肿瘤坏死因子-α被用来诱导变性的npc在我们的研究中。

核因子(NF -κBκB)通路被发现与碘缺乏症的发生和发展有关,尤其是炎症微环境刺激(23,24]。肿瘤坏死因子-α刺激,蛋白质上游的途径,如Ikk-alpha /β和转化生长因子-β活化激酶1 (TAK1),刺激使磷酸化κBα。Phophorylated我κBα然后产生核本地化信号激活,使磷酸化p65κB亚基核因素,最终目标基因转录启动(25,26]。此外,NF -κB通路被发现参与细胞外基质的代谢,以及细胞凋亡和自噬的npc (27- - - - - -29日]。

NLR家族pyrin域包含3 (NLRP3) inflammasome被报道参与各种疾病的进展30.]。作为目标基因的磷酸化p65 NLRP3 inflammasome被报道与IDD在先前的研究31日- - - - - -33]。此外,NLRP3 inflammasome可能调解在npc炎症因素的诱导,加速IDD的进展。

从芦荟中提取的芦荟素,植物物种用于传统药用药,已被证明是有效的在体外和体内对炎症、骨骼退行性疾病,癌症,心血管疾病(34,35]。太阳等人发现,芦荟素可以降低氧化应激水平,减少心肌细胞的活性氧浓度(36]。另一项研究发现,芦荟素治疗可以抑制NF -的激活κB / NLRP3信号通路(37]。此外,据报道,芦荟素改善骨关节炎的发展,显示了一个保护作用ECM的合成代谢和分解代谢通过PI3K / AKT / NF -软骨细胞κB通路(38]。然而,芦荟素和底层机制对npc的影响仍然未知。因此,基于抗炎和预防骨质疏松的影响,我们假设芦荟素可以调节基质代谢和细胞凋亡通过TAK1 / NF - npcκB / NLRP3轴。我们的研究旨在提供额外的证据,芦荟素IDD的疗法。

2。材料和方法

2.1。抗体和试剂

抗体GAPDH COL2A1,能,ADAMTS4 ADAMTS5, MMP9, MMP13, TNF -αNOX1 NOX2,进气阀打开,COX2和NLRP3买来Abcam Inc .过氧化氢酶,SOD1,伯灵顿,BCL2, Caspase3, Cleaved-caspase3 TAK1 / NF -κB信号蛋白(TAK1 phosphor-TAK1、P65 phosphor-P65,我κBα,phosphor-IκBα),抗体和免疫球蛋白辅助从细胞信号技术有限公司购买抗体GAPDH是Proteintech Group Inc .芦荟素试剂来自MedChemExpress,和人类肿瘤坏死因子-α从研发系统。缩写和描述是补充表所示1。

2.2。组织样本的控制和病人

退变髓核(NP)组织获得的病人由于椎间盘突出椎间盘摘除手术,而正常的NP组织获得那些收到一个没有椎间盘变性手术由于创伤。组织固定、脱钙、嵌入式和切成部分免疫组织化学(包含IHC)分析。同时,额外的组织存储在-80°C的RNA和蛋白质提取利用高通量组织磨床。

2.3。人类髓核细胞采集和文化

在这项研究中,人类髓核细胞(npc)从ScienCell获得。大约70% - -90%的融合,使胰蛋白酶化并再次镀。npc在6-well培养板的密度大约 细胞/毫升约8毫升人类人大介质(ScienCell) 3 - 6的段落,他们考虑到显示治疗后12 h电镀为后续实验。

2.4。免疫组织化学

多聚甲醛被用来修复组织,然后,他们脱钙,脱水和嵌入。处理后15分钟的0.1% Triton x - 100解决方案,组织部分孵化与3%过氧化物酶与PBS 20分钟,洗3次。阻断剂,牛血清白蛋白(5%,Sigma-Aldrich)可以在37°C 30分钟。如下,Histostain +工具包用于包含IHC分析。最后,一个奥林巴斯BX63显微镜(奥林巴斯、东京、日本)被用于拍摄在200年和400年的放大。

2.5。实时qPCR

从组织和细胞总RNA提取利用RNA-iso +试剂。执行转换后cDNA、qPCR, mrna的表达水平不同的群体进行了计算和分析指的表达水平GAPDH基因。引物的序列用于我们的研究包括补充表2。

2.6。免疫印迹

首先,我们从细胞和组织中提取总蛋白。随后,样品受到等量的sds - page和转移到数控转移膜。接下来,膜被封锁和孵化指定抗体在一夜之间在4°C。与PBS洗3次后,他们二次抗体孵育1小时然后被可视化。乐队是确定和量化使用ImageJ软件。

2.7。细胞生存能力分析

npc被消化,使离心,镀在96孔板的密度 细胞/毫升。在培养12 h,芦荟素在不同浓度增加了24和48 h,分别。npc时用PBS表示时间,和10% CCK-8试剂添加在每个。最后,我们使用标仪测量吸光度在450海里。

2.8。免疫荧光

npc被播种在24-well覆盖眼镜板24 h,然后是在不同治疗48 h。npc被洗,固定,permeabilized和阻塞。接下来,封面眼镜孵化了抗体在一夜之间在4°C。之后,二次抗体(1:100)是用于孵化,然后,他们与DAPI标记5分钟。最后,一个奥林巴斯BX63显微镜用于拍摄。

2.9。Tunel细胞凋亡检测

npc被播种在24-well覆盖眼镜板24 h,然后在不同的治疗48 h。在目标融合,npc洗和固定。其次,他们清洗和治疗0.1% Triton x - 100的解决方案。Tunel工作方案(Beyotime,中国)补充说,使用一个奥林巴斯BX63显微镜和图像拍摄。

2.10。流式细胞分析仪

npc在6-well培养板后,收集不同的治疗方法。膜联蛋白V /π凋亡检测设备(Elabscience,中国)是用于检测凋亡率。添加绑定缓冲,立即和流式细胞术系统被用于分析。

2.11。统计分析

- - - - - -测试了两个比较或单向方差分析为多个比较使用。所有这样的定量数据 。所有的分析都由使用GraphPad软件8.0(美国圣地亚哥,CA)。被认为是在统计学上意义 。

2.12。道德声明

我们的研究机构研究伦理委员会批准的中山大学(广州)和书面知情同意获得受试者参与研究。

3所示。结果

3.1。特异表达ECM代谢,增加细胞凋亡和炎症浸润在退化NP组织

确定IDD的发病机理,免疫组织化学是用来评估ECM代谢标记和炎症因子的表达在不同的人类NP组织。我们发现的表达显著降低,能和ADAMTS4和肿瘤坏死因子的表达式α调节在病人组(图1(一))。蛋白质和mRNA然后从正常和退化的人类NP组织和评估。如数据所示1 (b)- - - - - -1 (d),的表达COL2A1被镇压,基质降解酶吗ADAMTS4增加在病人组。此外,的表达水平TNF-α,凋亡基因伯灵顿和促炎因子伊诺和COX2调节与正常组织相比,退行性组织(数据吗1 (b)- - - - - -1 (d))。

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图1
特异表达ECM代谢,增加细胞凋亡和炎症浸润在退化NP组织。(一)免疫组织化学染色分析,能ADAMTS4, TNF -α在正常和退化的人类NP组织。(b)的mRNA表达水平COL2A1,ADAMTS4,伯灵顿,TNF-α,伊诺,COX2qPCR探测到在正常和退化的人类NP组织。(c, d)蛋白表达水平的COL2A1, ADAMTS4,伯灵顿,TNF -α,进气阀打开,COX2被免疫印迹检测在正常和退化的人类NP组织。蛋白质的密度乐队进行评估和量化使用ImageJ软件。左边的图像(比例尺放大:×200:100μ米)和正确的图像(比例尺放大:×400:50μ米)。 , 。
3.2。芦荟素治疗提高了合成代谢和分解代谢的抑制肿瘤坏死因子-α对待npc

芦荟素的化学结构如图2(一个)(引用http://www.medchemexpress.cn/)。首先,不同浓度的芦荟素被添加到介质(0,100,200,400,和800年μ米),我们使用CCK-8测试来评估是否施加npc芦荟素的细胞毒性效应。如图2 (b),我们发现芦荟素没有明显细胞毒性的npc浓度高达200μM;然而,芦荟素细胞生存能力降低浓度的400μ米( )在48 h。接下来,我们评估COL2A1的表达水平,基质金属蛋白酶,通过使用qPCR ADAMTSs和免疫印迹,结果表明,芦荟素治疗促进ECM合成和显著地抑制TNF - ECM降解α对待npc(图2 (c)和2 (d))。正如预期的那样,免疫荧光分析还表明,芦荟素治疗逆转ADAMTS4和COL2A1改变诱导肿瘤坏死因子-α(图2 (e))。

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图2
芦荟素治疗提高了合成代谢和分解代谢的抑制肿瘤坏死因子-α对待npc。(一个)显示了芦荟素的化学结构(引用http://www.medchemexpress.cn/)(b)检测对npc芦荟素细胞毒性的影响在不同浓度在24和48 h后治疗使用CCK-8试验(0,100,200,400,和800年μ米)。(c)的mRNA表达水平COL2A1,ADAMTS5,MMP9,MMP13在不同的群体被qPCR检测。(d)蛋白的表达COL2A1 ADAMTS5, MMP9, MMP13免疫印迹检测的不同群体。(e)和ADAMTS4 COL2A1被免疫荧光染色检测。DAPI用于核染色。图像(比例尺放大:×400:50μ米)。在这个(汉英),芦荟素200浓度μ米,TNF -α在10 ng / ml的浓度。 , 。
3.3。芦荟素治疗的细胞凋亡率降低TNF -α对待npc

随后,在npc细胞凋亡检测。qPCR结果表明,芦荟素治疗(200μ肿瘤坏死因子- M)α对待npc调节BCL2和表达下调伯灵顿(图3(一个))。免疫印迹结果还表明,凋亡标记伯灵顿和Cleaved-caspase3表达下调,与芦荟素和凋亡标记BCL2调节治疗(图3 (b))。接下来,评估细胞凋亡率,TUNEL免疫荧光染色和流式细胞术。如数据所示3 (c)和3 (d),我们发现TNF -细胞凋亡率显著更高α对待npc,而与芦荟素抑制治疗浓度的200μ(数据3 (c)和3 (d))。我们的研究结果表明,芦荟素治疗可以减少细胞凋亡率在TNF -α全身的npc。

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图3
芦荟素治疗的细胞凋亡率降低TNF -α对待npc。(a)的mRNA表达水平BCL2和伯灵顿被qPCR发现在不同的组。(b)蛋白表达水平的BCL2,伯灵顿,Caspase3, Cleaved-caspase3被免疫印迹检测在不同的组。(c) TUNEL免疫荧光染色法在不同的组。(d)流式细胞术和细胞凋亡率分析在不同的组( )。图像(比例尺放大:×200:100μ米)。在这个图中,芦荟素200浓度μ米,TNF -α在10 ng / ml的浓度。 , 。
3.4。芦荟素的治疗改善氧化应激的水平和促炎的因素

然后,我们发现芦荟素的影响治疗促炎因子和氧化应激水平。结果表明,氧化指数标记(NOX1和NOX2)表达下调和抗氧化酶(SOD1和过氧化氢酶(200)与芦荟素调节治疗μ米)(图4(一)和4 (b))。此外,抑制促炎的因素(伊诺,COX2,IL-1β,il - 6)观察芦荟素治疗用qPCR(图4 (c))。伊诺的蛋白质含量和COX2 aloin-treated组中表达下调,用免疫印迹分析(图如图所示4 (d))。这些数据表明,芦荟素可以抑制氧化应激的水平和促炎因子TNF -的生产α全身的npc。

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图4
芦荟素的治疗改善氧化应激的水平和促炎的因素。(a)的mRNA表达水平NOX1,NOX2,SOD1,过氧化氢酶被qPCR检测。(b)蛋白表达水平的NOX1, NOX2, SOD1,过氧化氢酶被免疫印迹检测。(c)的mRNA表达水平伊诺,COX2,IL-β,il - 6被qPCR检测。(d)蛋白表达水平的伊诺和COX2蛋白免疫印迹检测出来。在这个图中,芦荟素200浓度μ米,TNF -α在10 ng / ml的浓度。 , 。
3.5。芦荟素抑制TAK1 / NF -的激活κB通路

随后探索潜在的机制,我们评估TAK1 / NF -的激活κ在TNF - B轴α治疗。如数据所示5(一个)- - - - - -5 (c)更高比例的p-TAK1 / TAK1》κBα/我κBα和p-P65 / P65观察TNF -α对待npc,但是芦荟素(200μ米)治疗显著逆转这些比率的变化p-TAK1 / TAK1》κBα/我κBα和p-P65 / P65(数字5(一个)- - - - - -5 (c))。我们进一步评估的本地化P65通过免疫荧光和发现的比例P65转移从细胞质到细胞核是调节下TNF -α治疗,而芦荟素治疗减毒的易位P65(图5 (d))。这些结果表明,芦荟素治疗可以抑制TAK1 / NF -的激活κB通路。

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图5
芦荟素抑制TAK1 / NF -的激活κB通路。(一)TAK1 / NF -蛋白质表达水平κB信号通路(TAK1 p-TAK1,我κBα导出,κBα、P65 p-P65)被免疫印迹检测在不同的组。(b)的蛋白质乐队使用ImageJ量化软件。(c)的表达率p-TAK1 / TAK1》κBα/我κBα和p-P65 / P65在不同的组。通过免疫荧光(d)的本地化P65评估。图像(比例尺放大:×200:100μ米)。在这个图中,芦荟素200浓度μ米,TNF -α在10 ng / ml的浓度。 , 。
3.6。芦荟素的治疗可以抑制表达NLRP3 Inflammasome

此前报道,NLRP3 inflammasome参与炎症相关的npc和IDD的进展32]。进一步调查是否芦荟素调节NLRP3 inflammasome活动在npc炎症微环境,我们评估的水平NLRP3 inflammasome,发现它是在退化椎间盘组织中高于正常组织信使rna和蛋白质含量(数字6(一)和6 (b))。然后我们观察到的表达NLRP3 inflammasome被qPCR抑制在芦荟素治疗和免疫印迹TNF -α对待npc(图6 (c)和6 (d))。此外,免疫荧光显示,芦荟素治疗表达下调的表达NLRP3肿瘤坏死因子-α对待npc。这些结果表明,芦荟素治疗减少的表达NLRP3。

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图6
芦荟素的治疗可以抑制表达NLRP3 inflammasome。(a)的表达水平NLRP3被免疫印迹检测在正常和退化的人类NP组织。蛋白质乐队使用ImageJ量化软件。(b)的mRNA水平NLRP3被qPCR检测在正常和退化的人类NP组织。(c)的mRNA表达NLRP3qPCR探测到在不同的基团。(d) NLRP3当时检测蛋白的表达水平,免疫印迹(左面板)。乐队的蛋白质被ImageJ量化软件(右面板)。(e) NLRP3利用免疫荧光检测。图像(比例尺放大:×400:50μ米)。在这个图中,芦荟素200浓度μ米,TNF -α在10 ng / ml的浓度。 , 。

4所示。讨论

国际直拨电话,一种常见的退行性疾病,也被认为是枸杞多糖的高发病率的主要原因,导致疼痛,甚至残疾(3,4,39]。然而,寻找有效的治疗药物IDD仍然是一个巨大的挑战。从芦荟中提取的植物,芦荟素已被证明有抗炎,抗氧化剂,和骨保护活动,但对IDD的影响还没有被确认37,38,40]。在我们的研究中,我们表明,芦荟素治疗可以逆转肿瘤坏死因子-α全身的细胞外基质代谢紊乱,细胞凋亡,氧化应激,促炎因子的生产在npc TAK1 / NF -κB / NLRP3通路。这些结果表明,芦荟素IDD的可能是一个有前途的治疗方法。

芦荟素已被证明有重要的保护作用在骨骼系统,包括改善骨关节炎的进展,促进成骨细胞分化的基因表达水平(BMP2和RUNX2剂量依赖性的方式),压制osteoclastogenesis和骨吸收在先前的研究38,41- - - - - -43]。在npc评估潜在的保护作用,我们首先确定无毒npc的芦荟素的浓度。我们进一步证明芦荟素能扭转细胞外基质代谢紊乱,细胞凋亡,氧化应激,促炎因子TNF -的生产α对待npc体外。同样,先前的研究表明,芦荟素治疗显著地抑制过度分解代谢和合成代谢不足软骨细胞的细胞外基质(38),而另一项研究发现,芦荟素有效地增加抗氧化酶的活性,抑制活性氧的水平(44]。

以前的研究已经表明TNF -α起着决定性的作用,IDD的发生和发展;因此,有效地抑制炎症可以改善IDD的发展(15- - - - - -17,45- - - - - -47]。它已经表明,芦荟素是有效的减少炎症和促炎因子的生产37,38]。一项研究报道,芦荟素治疗显著降低伊诺和TNF的表达α(48),而其他的研究发现,芦荟素发挥抗炎活性和降低炎性细胞因子的释放49,50]。相应地,我们演示了TNF -芦荟素的保护作用α对待npc。

在我们的研究中,我们表明,芦荟素治疗抑制TAK1 / NF -的激活κB通路和抑制水平NLRP3 inflammasome。先前的研究已经报道,TAK1 / NF -κB / NLRP3通路在肿瘤坏死因子,发挥了重要作用α全身的炎症在npc (51,52]。我们的研究证实,这种炎症相关的信号通路的重要性在IDD的进展。同样,据报道,芦荟素治疗抑制NF -的激活κB信号lipopolysaccharide-induced急性肺损伤,il - 1 beta-stimulated软骨细胞,和D-galactose-induced认知损伤和炎症37,38,44]。我们的研究结果提供了更多的证据在npc芦荟素的强大的抗炎活性。

枸杞多糖与IDD,非常普遍,有很高的发病率。然而,现有的治疗方法不消除IDD的过程。在我们的研究中,提出了一种新的潜在治疗。芦荟素具有明显的效果,包括调节ECM代谢,抑制细胞凋亡,抗炎和抗氧化活性在npc,可能是一个治疗IDD的代理。然而,进一步的研究是必要的阐明IDD体内芦荟素的影响。

5。结论

我们评估了芦荟素的保护作用在npc和演示的底层机制。在我们的研究中,我们发现,芦荟素促进细胞外基质体内平衡,抑制细胞凋亡,减少了生产的促炎因子和肿瘤坏死因子-的氧化应激水平α全身的npc。在力学上,我们发现,芦荟素治疗抑制TAK1 / NF -的激活κB / NLRP3通路。我们的研究表明,芦荟素可能是一个治疗代理IDD在未来。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

我们声明,没有利益冲突有关的出版。

作者的贡献

WJG, AJL实验设计。全面质量管理、PFL JCQ WJH,西格里碳素集团,美国卫生和公众服务部,XJQ,近年来进行了实验。全面质量管理、PFL JCQ获得数据。全面质量管理、PFL JCQ、WJG AJL分析数据。全面质量管理、WJG AJL写的手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Pengfei Taiqiu Chen Li和金城秋同样这项工作,应该视为co-first作者。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金的赠款中国(81572134),广东基础研究和应用基础研究基金会(a1515110122 2019号和2021号a1515012619),基础研究基金为中央大学(排名20 ykpy94),中山奖学金对年轻科学家Wenjie高,和广州的科技项目,中国(202102010159)。我们感谢LetPub (http://www.letpub.com/)的语言帮助在准备这个手稿。

补充材料

表1:补充缩写和描述。RT-qPCR补充表2:引物的序列。(补充材料)