文摘

背景。间充质干细胞/基质细胞(msc)已广泛用于治疗属性在许多临床应用包括骨关节炎。尽管有前途的临床结果显示MSC的能力减少骨关节炎(OA)的临床严重程度在实验动物模型中,MSC在关节内注射OA患者的利益仅限于短期内。在这方面,预计提高MSC的属性可能共同加强对OA长期有益的影响。方法和结果。最近,我们已经表明,PPARβ/δ使用商用拮抗剂抑制小鼠MSC增加他们的免疫调节潜力在体外以及他们的治疗潜力在实验小鼠关节炎模型。在这里,我们抑制PPAR依赖于一个创新的策略β/δ:NF -κB TF65亚基相互作用在人类MSC通过设计和合成一个干扰肽,修正。通过RT-qPCR实验中,我们证明,新修正的合成肽的表达水平降低PDK4,PPARβ/δ目标基因,但没有修改的表达水平ACOX1和CPT1A,PPARα目标基因,FABP4,PPARγ目标基因与治疗人类MSC。此外,我们表明,人类msc使用修正的能力表现出明显高于抑制激活PBMC的扩散和减少M1-like巨噬细胞的频率。结论。我们设计并合成了一个干扰肽,强有力地PPAR特别是块β/δ活动的同时增强MSC免疫调节特性。

1。介绍

策略来提高间充质干细胞/基质细胞(MSC)治疗骨关节炎(OA)的属性治疗通过提高特别是,免疫调节,cytoprotective属性是一种强烈的研究。这些策略包括,部分基因或药物预处理MSC进一步加强一个候选基因的表达或激活特定的通路。

最近,我们证明了PPARβ/δ,脂质ligand-inducible转录因子描述为其代谢功能,起着关键作用来自小鼠骨髓MSC (mMSC)通过调节他们的生产能力1]。这PPAR的抑制作用β/δ通过调节介导的NF -κB活动,MSC免疫抑制的主要球员属性(1,2]。小鼠从PPAR MSCβ/δ基因敲除小鼠表现出增加免疫抑制可能是有趣的和NF -增加有关κB活动无论在稳态和激活促炎细胞因子(1]。因此,PPARβ/δ抑制在MSC增加了免疫调节的潜力在体外、活化脾细胞或t细胞亚群和他们的治疗潜力在实验小鼠关节炎模型(3]。的确,PPARs在炎症反应的主要功能是促进NF -κ失活。可能的失活机制包括抑制通过直接绑定和NF -泛素化导致蛋白水解降解κ在NF - B TF65以及间接影响κB (4]。

此外,PPAR是否β/δ使用商用PPAR调制β/δ人类MSC拮抗剂可能影响其免疫调节潜力从未被调查。此外,当前可用的PPAR的非特异性β/δ拮抗剂可以调节PPAR家族的其他成员的活动是有据可查的5),以及MSC培养基血清包含PPAR的事实β/δ配体(6]。事实上,PPAR配体存在于血清的细胞培养细胞自身产生的媒体,可以(6]。因此,根据细胞类型用于研究人类与老鼠MSC)(例如,不同浓度的PPAR配体培养基中可以积累。

除了配体PPAR的构象的影响β/δ核受体的分子环境(辅活化因子/辅阻遏物的存在与否)也可能影响其活动(7,8]。此外,在这个时候,尽管PPAR的角色β/δ在许多细胞机制,PPAR的合成β/δ拮抗剂或逆转受体激动剂仅限于三个化合物(拮抗剂:GSK3787 SR13904或反向激动剂:GSK0660),和没有PPAR的合成配体β/δ已收到营销授权。

PPARβ/δ可以直接与其他转录因子相互作用,包括NF -κB,通过阻断他们的核易位和/或绑定到DNA。鉴于NF -κB信号通路是所需的初始启动人类MSC(免疫抑制功能2),在目前的研究中,我们抑制PPAR依赖于一个创新的策略β/δ:NF -κ通过设计一个干扰肽B TF65单元交互。然后,我们研究的特异性肽模仿NF -κB TF65亚基脂肪tissue-derived MSC (AD-MSC)通过评估(i) PPAR家庭成员目标基因的表达水平,(2)他们的免疫调节特性激活人类外周血单核细胞(PBMC)和MSC免疫调节介质的表达水平,和(3)他们的免疫调节巨噬细胞上的属性。

2。材料和方法

2.1。肽合成阵列

所有数组合成肽ResPep合成器(Intavis AG)使用标准的现货合成详细描述之前(9]。序列文件生成软件的帮助下丽莎1.78(内部软件)。0.4 Fmoc-protected Opfp-esters (Bachem) NMP(丙烯酰胺)耦合在beta-alanine-modified纤维素膜(Whatman-50)生成肽数组9]。使用下面的侧链保护团体:叔丁基酯(OtBu) E和D;叔丁基醚(tBu) S T、Y;三苯甲基(泰爱泰党)C, N, Q, H, 2, 2, 4, 6, 7-pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl R (Pbf);和tert-butoxycarbonyl(中行)K和w . Fmoc去执行使用哌啶20%解决方案(DMF) 15分钟。侧链保护组解理执行使用两个三氟乙酸(组织,Sigma-Aldrich)解决方案(90%的组织,2%的H₂0,3% triisobutylsilane(提波斯,Sigma-Aldrich),和10%二氯甲烷(DCM Sigma-Aldrich);和60组织,2% H₂0,3%提波斯,35% DCM) [10]。

以下库合成了两次:PepScan (15 - m抗议重叠肽3氨基酸)的转变;长度分析(18-mer肽卖空和N -糖基);置换分析(每一个氨基酸的肽被修正的20 l -氨基酸)。

2.2。肽数组绑定的研究

纤维素膜结合肽与乙醇(水洗一次 ),tris-buffered盐水(TBS), pH值8.0,( ),然后用阻断缓冲区阻塞3 h (Sigma-Aldrich) TBS pH值8.0,含5%蔗糖(Sigma-Aldrich)。膜与人类重组PPAR孵化β/δ蛋白质(亮氨酸- 260 glu426;PPARD-15H人类,Interchim)拥有一个氨基端他检测(5μg / ml阻断缓冲区一夜之间在4°C)。第二天,膜被TBS ( )和孵化主要anti-His抗体(H1029 Sigma-Aldrich;1:1000年阻止缓冲区)在室温下为2.5 h。TBS洗后( )删除主要抗体,细胞膜是孵化peroxidase-labeled anti-mouse-HRP(# 7076年代,细胞信号;1:2000年阻止缓冲区)在室温下为1.5 h。将抗体过剩,膜被TBS ( )然后孵化皮尔斯ECL +免疫印迹基质(热费希尔)。图像获得成像仪600 (Amersham)和现货强度测量使用的“蛋白质阵列分析仪”宏观ImageJ。任意一个阈值被设定为每个膜在100000来确定(见补充材料,表“绑定”S1,S2,S3)。

2.3。多肽合成

修正的肽(Ac-GRKKRRQRRR-RISLVTKDPPHR-CONH₂22-mer)在自由蓝色™微波合成多肽合成仪(CEM公司)与另一个模块的发现™(CEM公司)结合微波能量在2450 MHz fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) /叔丁基(tBu)策略(SynBio3平台)。肽身份和纯度(> 95%)被质检查(水域)。

2.4。人类脂肪基质细胞隔离和在中空纤维生物反应器的扩张

人类脂肪基质细胞(hAD-MSCs)从腹部脂肪组织分离获得6健康献血者( )接受美学手术和扩大在体外。总之,从每个捐赠者lipoaspirate与buffered-saline解决洗两次去除残留的血液。脂肪组织是由孵化与胶原酶消化NB4 (Nordmark)。胶原酶是细胞培养中和媒体(最低必不可少的媒介,αmem Gibco)含5%人类血小板溶解产物(hPL Stemulate Sexton生物技术),悬挂过滤、离心,resuspended完整的媒体。单核的细胞的数量(跨国公司)隔离间质血管分数(SVF)和细胞生存能力是决定使用一个自动细胞计数(NucleoCounter®nc - 200™, ChemoMetec)。SVF当时resuspended在细胞培养基所需的浓度和加载到intracapillary空间量子®的中空纤维细胞扩张系统(作秀的旅级战斗队)。骨髓MSC从脂肪组织分离的扩张或已经被其他人([前所述11,12),分别)。简而言之,24小时细胞加载之前,生物反应器是涂上从人血浆纤连蛋白(纽约康宁)支持附件和MSC的扩张。在细胞扩张(7 - 8天),饲料率调整根据制造商的指示。胰蛋白酶化和洗涤步骤buffered-saline解决方案后,hAD-MSC (P0)通过低温贮藏在低温贮藏媒体(Cryostor®CS10, BioLife解决方案)。hAD-MSCs用于本研究得到第二个扩张后一步量子®系统(通过P1 6天的培养)和低温贮藏在Cryostor®CS10 (BioLife解决方案)。注意,telomere-associated-protein Rap1 (Trf2IP)没有或弱表达hAD-MSC从6捐助者在这研究中使用。

2.5。人类脂肪基质细胞预处理

镀后解冻,hAD-MSCs 4500个细胞的密度/厘米²在5% hPL-supplementedα包含1%的mem penicillin-streptomycin (Gibco) 48小时。然后,hAD-MSCs PPAR服用β/δ拮抗剂(GSK3787)(σ)或修正的肽浓度的0.1μ米24 h。

2.6。定量实时聚合酶链反应(存在)

进行RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)根据制造商的指示。总数量500 ng的RNA用于retrotranscribe cDNA SensiFAST cDNA合成设备(经络)。实时rt-qPCR协议后完成SYBR SensiFAST No-ROX工具包(经络)和480年LightCycler检测系统(罗氏应用科学)。引物序列与Primer3软件设计。正常化进行与核糖体蛋白S9 (RPS9)作为看家基因和条件相比hAD-MSC没有治疗。结果表示为相对信使rna的基因表达水平和获得的公式。

2.7。免疫抑制试验

人类外周血单核细胞(PBMCs) 3种不同健康献血者(Etablissement法语杜唱)单独使用聚蔗糖过程和冷冻在DMSO补充10%胎牛血清。冷冻PBMCs解冻,统计,贴上CellTrace紫(CTV,热Fisher)来评估他们的扩散率。PBMCs激活了植物凝集素(PHA;5毫克/毫升)(热费希尔科学)。PHA-activated PBMCs被培养的存在与否hAD-MSC进行预处理或不是24小时拮抗剂(GSK3787, 0.1μ米)或干扰修正的肽(0.1μ米)的细胞比1:10 (hAD-MSC: PBMC)在混合淋巴细胞反应(高)中,含有10% FCS (Biosera、法国),1% penicillin-streptomycin (Gibco), 1%丙酮酸钠(热费希尔科学),不必要的氨基酸(热费希尔科学),1%和1%谷氨酰胺(热费希尔科学)Iscove修改杜尔贝科的媒体(IMDM-Thermo费舍尔科学)。coculture 96小时后,PHA-activated PBMC扩散被流式细胞术使用量化BD FACSCanto (MRI)的平台。确定的百分比hAD-MSC PBMC增殖,抑制PHA-activated PBMC被认为是100%的扩散;hAD-MSC减少的百分比PHA-activated PBMC扩散;区别两种情况下对应的抑制百分比。

2.8。巨噬细胞极化试验

人类单核细胞分离白细胞集中(血沉棕黄层)健康的捐赠者。人类PBMCs Ficoll-Paque获得的密度梯度离心法,CD14⁺人口使用CD14微磁排序(Miltenyi)制造商的迹象。细胞被镀在 细胞/厘米²和培养高钙中补充20 ng / ml的巨噬细胞集落刺激因子(csf) (Miltenyi)。经过7天的文化中,巨噬细胞被激活100 ng / ml的脂多糖(LPS)和单独培养,与天真hAD-MSC或hAD-MSC预处理的比率1:10 24 h。巨噬细胞极化,评估细胞收获使用Versene (Gibco)和与100年孵化μ米的Fc块(BD生物科学)制造商的迹象。然后,细胞染色(技术)和使用细胞生存能力的标记抗体CD86(2331年克隆Fun-1), CD163(克隆GHI / 61) (BD生物科学)、CD68(克隆Y1/82A) CD206(克隆一连)和HLA-DR(克隆L243) (BioLegend,圣地亚哥,加利福尼亚州,美国)。数据获取与使用FlowJo BD FACSCanto和分析软件(v.10) (TreeStar Inc .)。

2.9。吲哚胺2,3-Dioxygenase (IDO)活动

为了量化IDO活动,我们分析了tryptophan-to-kynurenine转换使用光度检测方法。60μl细胞上清液(条件培养液)是用移液器吸取96孔培养板,和30μl 30%三氯乙酸溶液(σ)增加了30分钟50°C。在75年一个离心步骤μl的样本添加到75年μl刚做好的埃利希的解决方案(σ,密苏里州,美国),和photoabsorbance读在450 nM Multiskan板读者(热费希尔)。

2.10。统计分析

GraphPad Prism 7.0 v软件(美国CA GraphPad)是用于演示的结果和统计分析。在手稿,结果被表示为 。使用非参数的统计分析进行了克鲁斯卡尔-沃利斯随后邓恩事后考验的多重比较。两组之间的比较,Mann-Whitney或Wilcoxon(被罩活动)测试使用。统计学意义是指出ns , 为 , 为 , 为 ,和为 。

3所示。结果

3.1。筛选PPARβ/δ开发一个干扰肽的相互作用

众所周知,PPARβ/δ可以绑定到蛋白质包括核因子NF -κB TF65亚基(也称为转录因子p65, TF65)和减弱NF -κB-dependent信号(13]。然而,我们最好的知识,没有结构信息显示界面的交互发表为止。筛选PPARβ/δ:NF -κB TF65交互,我们使用现场技术允许平行合成cellulose-bound肽库筛选(图蛋白质间交互作用1(一))。

首先,是由PepScan分析解剖的主要序列TF65重叠肽来确定NF -κB与PPAR TF65抗原决定基参与互动β/δ(图1 (b))。因为信号强度之间的直接相关性和亲和力不能使用这种技术的表现,我们设置一个任意的阈值(值> 100000)来确定(补充材料,表“绑定”S1)。PPAR后发现了许多有效的抗原表位β/δ蛋白质孵化。选择一个能够中断PPAR更有效β/δ:TF65交互,我们使用了两个晶体结构的NF -出版κB TF65 [14,15)来评估不同的抗原表位(图的位置2)。TF65循环的抗原决定基位于一个对应点n°24 - 25 (70 - gtvrislvtkdpphrphp - 87) PepScan选择基于其可访问性的蛋白质交互图(红色广场1 (b)两种结构的图,红色部分2)。

之后,一个长度分析18-mer肽为PPAR定义最优长度β/δ绑定通过削减先后和N - c端肽的地区。PPAR后β/δ孵化,现货的12-mer序列n 8°(73 - rislvtkdpphr - 84)被确定为肽有信号强度最高的国家之一(图1 (c)和补充材料,表S2)。最后,这12-mer肽被置换分析评估(SubAna,氨基酸突变在每个序列位置)来确定有效的PPAR的关键位置β/δ(图:TF65交互1 (d)和补充材料,表S3)。SubAna的第一列对应于野生型(wt)序列和第二列交换氨基酸。SubAna透露四肽的关键职位:异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、精氨酸(RISLVTKDPPHR),不能随意更换。在许多情况下,SubAnas清晰定义模式的关键职位将演示一个特定的蛋白质肽的相互作用[16- - - - - -18]。

确定12-mer肽将作为模仿的NF -κB TF65亚基,防止PPARβ/δ交互NF -κB TF65亚基。评价其细胞活性,发现假肽被耦合到常用cell-penetrating肽答(19),允许细胞内化。答PPAR共轭β/δ干扰肽后来被称为修正(图2 (c))。

3.2。修正的肽会使PPAR的表达水平β/δ在不影响PPAR的目标基因α或PPARγ

确定修正的特异性,我们评估的表达水平PDK4和ANGPTL4和PPARβ/δ目标基因,以及表达的水平ACOX1和CPT1A,PPARα目标基因,FABP4,PPARγ目标基因与人类相比,未经处理的hAD-MSC GSK3787 (PPAR hAD-MSC使用β/δ拮抗剂)或修正。使用RT-qPCR,我们观察到的24小时预处理hAD-MSC 0.1μM修正或GSK3787的表达水平显著降低PDK4(图3(一个))比未经处理的hAD-MSC(虚线)。相比之下,ANGPTL4表达水平的影响只有在预处理GSK3787但不修正,比未经处理的hAD-MSC(图3 (b))。然后,我们评估了PPAR的表达水平α目标基因,发现hAD-MSC 24小时预处理的0.1μM修正不修改两个PPAR的表达水平α目标基因测试,而0.1μM GSK3787显著增加ACOX1(图3 (c))和减少CPT1A(图3 (d))。同样,尽管预处理修正没有调整FABP4PPAR表达水平γ目标基因,GSK3787显著增加(图3 (e))。总之,这些结果表明新合成的特异性肽修正的专门的表达水平降低PDK4,PPARβ/δ目标基因,但不是PPAR的表达水平α或PPARγ目标基因。

3.3。人类AD-MSC使用修正的肽表现出增强的免疫调节特性

我们研究了PPAR的角色β/δ调制使用修正的肽或GSK3787 hAD-MSC免疫调节功能。为此,hAD-MSCs使用0.1μM修正或GSK3787 24 h cocultured之前与植物凝集素(PHA)激活PBMC的比率1:10 4天。首先,我们确认的免疫抑制特性hAD-MSC CellTrace紫——(CTV)标记PBMC与PHA激活(数字4(一)和4 (b))。尽管PPAR的抑制β/δ活动使用GSK3787拮抗剂倾向于增加的能力hAD-MSC抑制扩散PHA-activated PBMC,无显著变化hAD-MSC免疫调节比未经处理的hAD-MSC(数据潜在的观察4(一)和4 (c))。相比之下,hAD-MSC的预处理与修正的肽显著增强他们的免疫调节特性相比,未经处理的同行(数字4(一)和4 (d))。总之,这些结果表明,PPARβ/δ介导TF65压迫,解除/被修正的肽,关键是hAD-MSC免疫抑制功能。

然后,我们评估了PPAR的效果β/δ吲哚胺2活动调制,3-dioxygenase (IDO)活动,参与MSC免疫调节特性(20.),在hAD-MSC cocultured与PHA-activated PBMC。与未经处理的hAD-MSC相比,我们发现hAD-MSC GSK3787处理表现出一个显著的低水平的语言活动而hAD-MSC使用修正的肽有明显高于语言活动(图4 (e))。此外,我们评估了cyclooxygenase-2表达水平(COX2)基因,另一个MSC免疫调节中介(21在hAD-MSC用GSK3787预处理和修正。使用RT-qPCR,我们观察到的信使rna表达水平增加COX2为了应对两个预处理和未经处理的hAD-MSC相比,但显著增加了修正的肽(图4 (f))。

3.4。人类AD-MSC使用修正的肽展览一个增强巨噬细胞免疫调节特性

最后,我们评估了PPAR的调制效果β/δ活动MSC免疫调节功能专注于巨噬细胞,OA发病机理中发挥关键作用。MSC调节巨噬细胞反应诱导M1-like巨噬细胞极化COX2-dependent方式向M2-like表型(22- - - - - -24]。因此我们想知道PPAR的调制β/δ活动在人类hAD-MSC使用修正的肽可以修改他们的能力来控制巨噬细胞反应。解决这个假设,我们执行coculture实验M1-like巨噬细胞和hAD-MSC使用修正的肽(图5(一个))。首先,我们确认的coculture hAD-MSC M1-like巨噬细胞(Mϕ+ hAD-MSC)显著增加的百分比M2-like巨噬细胞阳性CD163和CD206(图5 (b))和减少的百分比M1-like巨噬细胞阳性CD86和HLA-DR相比M1-like巨噬细胞单独培养(Mϕ)(图5 (c))。当cocultured hAD-MSC使用修正的肽,CD163 M2-like巨噬细胞阳性的比例和CD206相比显著提高巨噬细胞单独培养,但没有观察到显著差异而与未经处理的hAD-MSC巨噬细胞培养(图5 (b))。相比之下,而未经处理的hAD-MSC和PP11-treated hAD-MSC显著减少的百分比M1-like巨噬细胞阳性CD86和HLA-DR PP11-treated hAD-MSC表现出更强大的免疫调节特性(图5 (c))。这一结果表明,PPAR的镇压β/δ与TF65互动,NF -亚基κB转录因子复杂,促进核易位NF -κB在hAD-MSC,提高免疫调节对促炎M1-like hAD-MSC巨噬细胞的潜力。

4所示。讨论

在目前的研究中,我们设计和合成特定的PPAR抑制剂β/δ:NF -κB TF65交互,修正,并展示在控制PPAR hAD-MSC其强有力的效果β/δ活动在不影响其他PPAR的目标基因表达水平的家庭成员。人类AD-MSC修正的处理表现出增强的抑制能力的扩散激活PBMC和调节巨噬细胞反应增加语言活动。

破译蛋白质交互(质子泵抑制剂)参与各种疾病是一个有趣的策略工程师干扰肽。事实上,一个复杂和动态网络的质子泵抑制剂调节大多数细胞功能和特定的信号级联导致细胞增殖或死亡。质子泵抑制剂的特定抑制剂因此成为一个新类的药物有许多潜在的应用在基础和临床研究。不幸的是,质子泵抑制剂往往被认为是nondruggable有几个原因。首先,PPI架构通常不是足够让抑制剂的合理设计。第二,更重要的是,质子泵抑制剂通过大型平面通常没有疏水口袋(与receptor-ligand或es复合物),使传统的小分子药物往往无效。相比之下,干扰肽(10至15 - m抗议)能与质子泵抑制剂治疗分子很有趣因为他们的潜在的灭活或激活信号级联。过去,开发不同的筛选策略来确定干扰肽如酵母2台混合动力、噬菌体展示、现场合成这里使用(25,26]。

由于其良好的溶解性,良好的药动学特征,低毒性/ mitogenicity,和无限的可能性提高绑定稳定/关联修改,肽是有趣的治疗性分子(27]。因此,制药行业认为,如今,多肽疗法就是明证60多个肽药物食品药品监督管理局批准的和不断增长的市场在过去二十年中28]。

开发一个PPAR之间形成复杂的干扰肽β/δ和核因子NF -κTF65 B亚基,合成和筛选不同的肽库的合成。这种方法允许我们阐明NF -绑定的地区κB对PPAR TF65单元重要β/δ互动(70 - gtvrislvtkdpphrphp - 87, 18-mer),减少抗原决定基12-mer肽和确定关键岗位(73 - rislvtkdpphr - 84)。通过耦合诱饵肽cell-penetrating肽答(十米级),细胞内化的共轭,名叫随后修正,确保(数据没有显示)。在细胞内,将修正的模仿NF -肽基拮抗剂的交互κB TF65亚基,PPAR进而产生影响β/δ下游通路。

丙酮酸脱氢酶激酶4 (PDK4)由脂肪细胞表达,并增加PDK4的表达与抑制葡萄糖的吸收(29日]。丙酮酸氧化的PDK4作为抑制剂,参与细胞代谢的变化(30.]。激活三个主要亚型的PPAR家庭包括PPARα,PPARβ/δ,PPARγ增加PDK4表达涉及协调从葡萄糖代谢转移到脂肪酸作为主要能源燃料30.]。在这里,我们表明,修正以及GSK3787 PPAR的强有力的对手β/δ明显降低的表达PDK4在人类AD-MSC没有改变PPAR的表达水平α和PPARγ目标基因。这一结果不仅表明,修正的GSK3787一样有效调节PPAR的表达β/δ目标基因但也更具体的比一个商用的对手。PDK4的表达水平下降引起的修正平行的增强的免疫调节特性,人类AD-MSC PHA-activated PBMC。基于我们以前的工作,这表明MSC的proglycolytic开关由寡霉素显著增强免疫调节特性在体外(31日];人们很容易推测AD-MSC预处理与修正的诱发代谢转移从脂肪酸作为主要能源燃料细胞的葡萄糖。当然,这个假设需要进一步的调查。

Angiopoietin-like 4蛋白(ANGPTL4)属于Angiopoietin-like家庭相关的蛋白质结构因素调节血管生成作为首次发现adipokine专门参与脂类代谢(32]。ANGPTL4已经被证明是参与细胞分化、肿瘤发生、能源和葡萄糖稳态、脂质代谢、伤口愈合、炎症调节(33),ANGPTL4转录调控可以通过营养和激素的监管条件以及一些转录因子,包括PPARα,PPARβ/δ,PPARγ(33],HIF1α(34]。出乎意料地,而治疗hAD-MSC PPARβ/δ拮抗剂,GSK3787,显著降低的表达ANGPTL4与修正,治疗的细胞没有。这可能是解释的转录调节的事实ANGPTL4是由不同的因素除了PPARβ/δ可以出现在hAD-MSCs或表达的细胞的培养基。还需要进一步的调查来澄清这一点,PPAR确认修正的特异性β/δ和它的目标。虽然莫名其妙,这个结果是非常有趣的和可以解释获得的免疫调节效应的增加hAD-MSC GSK3787相比修正处理在体外功能测试。事实上,我们表明,PPAR PP11-interfering肽块β/δ活动在不影响ANGPTL4在人类AD-MSC表达式。此外,治疗hAD-MSC修正的但不是GSK3787显著增加了语言活动比未经处理的细胞的表达水平和增加COX2调节前列腺素E2 (PGE2)的生产,著名的MSC免疫调节介质的属性。总之,这些影响由修正ANGPTL4和COX2表达和语言活动在人类AD-MSC可能解释他们增强免疫调节特性。而COX2的角色我刚才描述的MSC免疫抑制特性的作用ANGPTL4是最近的。事实上,MSC overexpressingCOX2更有效力地抑制PBMC的激活和增生21,35]。对于我,这是最关键的因素之一在人类MSC-directed免疫调节(35,36]。为ANGPTL4部分,这是最近表明,与巨噬细胞coculture条件,MSC明显表达ANGPTL4抑制巨噬细胞极化对炎性表型。msc缺乏ANGPTL4没有成功地抑制巨噬细胞的炎性表型(37]。总之,这些结果表明,增强人体的免疫调节特性AD-MSC处理或者GSK3787而天真的MSC GSK3787修正相关的高表达ANGPTL4和COX2和更高的语言活动。进一步的研究应该调查确认的关键作用ANGPTL4修正引起的MSC免疫抑制特性。

在这项研究中,我们已经开发出修正,PPAR之间形成的复杂的干扰肽β/δ和TF65亚基核因子NF -κB,在MSC免疫抑制中起着关键作用的属性。虽然我们表明,修正的增强MSC免疫抑制特性,NF -修正的影响κB的监管活动在人类AD-MSC和NF -κB目标基因还有待研究。阻塞PPAR之间的交互β/δ和NF -κNF - B TF65单元也可能影响κB TF65途径本身导致了(1)一个更快速的蛋白酶体降解,(2)一个有效的高交互与其他细胞质或核蛋白质,和(3)超过形成各种NF -κB亚基二聚体组合诱导异构调节NF -κ目标基因。然而,在NF -修正的影响κB TF65信号通路可能是另一个手稿的主题。

5。结论

总之,我们设计并合成一个特别块PPAR干扰肽β/δ活动和增强了MSC免疫调节特性在体外激活PBMC和炎性巨噬细胞。这些可喜的成果是一个重要的步骤来更好地理解MSC免疫调节特性,即使额外的生化实验将必要突出PPAR修正的影响β/δ:NF -κB TF65复杂。我们的研究提出了一种可能性,将是一个更具体的PPAR修正β/δ拮抗剂比商用药物。

数据可用性

数据请求通过作者(Gautier托莱多和Farida Djouad)。

伦理批准

进行的这项研究是符合赫尔辛基宣言和地区临床实验的审查委员会批准的“拉西德保护des人SUD-EST II,里昂,法国“(协议2019 - a01067 - 50 9月11日批准^th,2019)。

同意

知情同意是获得所有受试者参与这项研究。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

回堵,E.V., C.J., C.G., and F.D. were responsible for the conceptualization. G.T., P.B., and E.V. were responsible for the data curation. P.B., E.V., C.J., J.G., C.V., C.G., and F.D. were responsible for the methodology. G.T., P.B., E.V., C.J., C.G., and F.D. were responsible for the validation. G.T., P.B., and E.V. were responsible for the formal analysis. G.T., P.B., E.V., C.G., and F.D. were responsible for the visualization. P.B., C.G., and F.D. were responsible for the investigation. C.G. and F.D. were responsible for the resources. P.B., E.V., C.J., C.G., and F.D. were responsible for writing the original draft preparation. P.B, E.V, C.J., C.V., J.G., C.G., and F.D. were responsible for the writing, reviewing, and editing. C.G. and F.D. were responsible for the supervision and project administration. C.J. and F.D. were responsible for the funding acquisition. All authors have read and agreed to the published version of the manuscript.

确认

作者感谢帕斯卡Verdie博士的优秀技术支持在多肽合成Synbio3平台。这项研究是由MedXCell科学SAS、法国蒙彼利埃。

补充材料

表S1:序列的TF65 PepScan与相应的信号强度(SI)。表S2:肽的序列长度分析GTVRISLVTKDPPHRPHP(现货24 - 25日表S1)与相应的信号强度。表S3:序列的置换分析肽RISLVTKDPPHR(现货8表S2)与相应的信号强度。(补充材料)