文摘
背景。严重烧伤早期多器官损伤引起的预测死亡率很高。间充质干细胞(msc)能够修复和重建受伤的组织和器官引起的创伤和疾病。然而,潜在的保护作用和机制的msc multiorgan损伤引起的严重烧伤早期仍不明确。因此,本研究旨在探讨人类脐cord-derived msc的效果和机制(hUCMSCs)对严重burn-induced早期器官损伤的老鼠。方法。成年雄性Wistar鼠随机分为虚假的燃烧,燃烧+ hUCMSCsgroups。GFP-labeled hUCMSCs或PBS静脉注入各自的团体。的迁移和分布模式GFP-labeled hUCMSCs被倒置荧光显微镜观察。心脏的结构和细胞凋亡,肾脏,肝脏通过免疫组织化学方法测定。在血清生化参数标准Roche-Hitachi化验的方法。西方墨点法进行这些器官的三组大鼠探索底层机制。结果。hUCMSCs移植后24小时内,我们发现GFP-labeled hUCMSCs主要是局部血管的心脏,肾脏,肝脏和极少数细胞迁移到组织器官。与假组相比,这些器官的结构损伤和细胞凋亡被严重烧伤,诱导和系统的政府hUCMSCs大大改善了受损的结构,细胞凋亡率,这些器官的生化参数。此外,igf - 1(胰岛素样生长因子1)水平燃烧+ hUCMSCs组明显高于在虚假的和烧伤组。同时,严重烧伤诱导bcl - 2、BAX显著减少虚假组相比,明显增加了hUCMSCs政府。结论。hUCMSCs移植可以减弱严重burn-induced早期器官损伤和保护multiorgan函数通过鼓励移民hUCMSCs随着血液循环,增加保护性细胞因子igf - 1水平和调节bcl - 2、BAX通路的重要器官。此外,这些数据可能为进一步的临床应用提供理论基础的hUCMSCs燃烧区域。
1。介绍
Multiorgan损伤是一种严重的并发症严重烧伤后,进步倾向到多器官功能障碍综合征(插件),甚至多器官功能衰竭(MOF) (1]。multiorgan损伤的病理机制严重烧伤后是多因素疾病。首先,直接氧化应激,并迅速引起结构损伤和细胞凋亡的多个器官严重烧伤后(2,3]。在随后burn-induced休克期,再灌注损伤进一步导致继发损坏这些器官的4]。此外,内源性促炎细胞因子和凝固路径后严重烧伤极度活跃和不平衡的还严重器官损害(5- - - - - -7]。这些综合因素导致multiorgan损伤、功能障碍,甚至失败,循环系统崩溃,最终死亡8,9]。虽然有一些治疗诊所,积极有效的治疗预防器官损害仍然缺乏,在严重烧伤后早期急需。
大量研究表明,局部或全身性msc可以减少管理严重疾病或严重伤害引起器官损伤和死亡率相关动物模型(10,11]。这可能是由于改善病理改变和减少促炎细胞因子的生产在动物模型(12,13]。最近的临床试验初步表明,hUCMSCs治疗COVID-19, ARDS,肺纤维化是非常有效的和安全的14,15]。值得注意的是,MSCs-based疗法被认为是有前途的策略来治疗严重创伤患者及其主要并发症通过分泌可溶性分泌蛋白质因子和液(16- - - - - -18]。因此,本研究的目的是评估的潜在保护作用hUCMSCs在严重烧伤大鼠器官损伤及相关机制。
2。材料和方法
2.1。动物保健
所有研究坚持程序符合国际生物医学研究指导原则涉及动物发出的国际医学科学组织理事会(帮助),机构批准的动物保健和使用委员会第四医学中心隶属于解放军总医院。六个雄性Wistar鼠(重180 - 220克)是由腹腔内注射麻醉300毫克/公斤三溴乙醇(20毫克/毫升)(美国σ2,2,2-tribromoethanol) (19- - - - - -21]。
2.2。hUCMSCs隔离、表型鉴定和标记
伦理委员会批准的这项研究是第四医学中心隶属于解放军总医院。脐带组织(15 - 20厘米)从胎儿足月健康磷酸盐(PBS)切成1 - 3毫米的组织块切除后脐带血管和外部膜。组织块被放置在培养瓶0.5厘米的距离,增加了与间充质干细胞medium-serum免费(MSCM-sf) (ScienCell研究实验室,圣地亚哥,CA)为37.0°C在湿润的气氛中5%的有限公司2。中慢慢被取代,每3天,这是确保组织块是固定的。当这些组织块周围的细胞融合达到80%至85%,组织块被移除,这些细胞消化trypsin-EDTA和转移到t - 75文化传播和文化。hUCMSCs形态的主要通道(P0), P1,用倒置相差显微镜观察和P4(徕卡微系统公司,位于德国)。
在PBS的fourth-passage hUCMSCs收集,洗两次,并与trypsin-EDTA消化。在PBS最终清洗后,单个细胞悬液( 细胞每100μL)被添加到每个管。管1和2是消极的控制,使鼠标反人类的抗体(1:100),包括FITC-CD105 FITC-CD90, FITC-CD44, PE-CD29, FITC-HLA-I, FITC-CD45, FITC-CD34, FITC-CD11b, FITC-CD31, FITC-vWF, PE-CD19,剩下PE-HLA-DR被添加到管,分别。这些实验管在黑暗中孵化37°C 30分钟,离心机,与PBS洗两次,发现使用流式细胞分析仪(FCM) (Becton Dickinson,富兰克林湖,新泽西)。然后,hUCMSCs从段落4 - 8被用于实验。
移植前三天,hUCMSCs与绿色荧光蛋白(GFP)标记使用慢病毒策略22]。慢病毒载体系统构建、包装、和纯化GeneChem(上海,中国)。积极的GFP-labeled hUCMSCs化验了流式细胞分析仪(FCM)。
2.3。严重的烧伤动物模型和治疗
30只成年雄性Wistar鼠随机分为3组( ):虚假的、燃烧和burn-transplanted hUCMSCs。50%的回溯和全层燃烧模型。大鼠麻醉后三溴乙醇腹腔注射(300毫克/公斤),背部和腹部的头发是完全消除,首先与快船,然后通过应用Veet脱毛膏。整个臀部和腹部都分别放在热水(94°C) 12和6年代,造成50%回溯全层燃烧(23]。立即注入平衡盐溶液(40毫克/公斤)是用于防止冲击。伤口然后用1%碘酊治疗和保持干燥,防止感染。虚假的组的老鼠被放置在37°C 12 s水,和其他进程一样应用于烧伤大鼠。伤口是敞开的,动物是牺牲在定义的时间点严重烧伤后(21]。
老鼠在burn-transplanted hUCMSCs集团立即收到了尾静脉注射 严重烧伤后GFP-labeled hUCMSCs。其他组的老鼠收到尾静脉注射1毫升PBS在同一时间。
2.4。样本采集和检测
腹主动脉的血液样本在24小时后被严重烧伤。他们立即转移到coagulator-containing管,分析血清生化参数被离心收集。同时,样本的重要器官如心脏、肾脏和肝脏也收集。这些样品是仔细和冲洗在PBS。然后,每一个标本分为三块:一块是准备进入冰冻切片和观察的位置GFP-labeled hUCMSCs,另一块是储存在液氮为未来的分子检测,最后剩下的部分是固定在4%多聚甲醛为未来的免疫组织化学染色检测。
2.5。的迁移和分布GFP-Labeled hUCMSCs
GFP-labeled hUCMSCs被应用于严重烧伤大鼠检测hUCMSCs体内的迁移和分布模式。评估是否hUCMSCs迁移到受伤的器官,组织的心脏,肾脏,肝脏也准备为跟踪GFP-hUCMSCs冰冻切片用倒置荧光显微镜。
2.6。组织学染色
与4%的多聚甲醛固定后1周在室温下,标本是嵌入在一个平面垂直于石蜡和分组切口。Five-micrometer-thick部分准备,deparaffinized二甲苯,水化。制备部分是沾)按照标准程序。其他部分与原位染色检测细胞死亡工具包(罗氏应用科学,德国)方向的制造商。凋亡细胞核被证明是棕色的。细胞凋亡率的心脏,肾脏,肝脏组织被数在5每个幻灯片的随机选择字段由一个有经验的和独立的细胞科学家蒙蔽的方式。
2.7。西方墨点法
蛋白质的心脏,肾脏,肝脏的三组大鼠与停止立即提取使用缓冲区里帕补充蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Servicebio,武汉,中国)。受到蛋白质sds - page凝胶,anti-BCL-2 anti-BAX抗体(1:1000)和anti-IGF-1和反β肌动蛋白抗体(1:2000)(研发系统、明尼阿波利斯、MN)用于蛋白表达分析。
2.8。统计分析
所有数据都表示为 和使用SPSS 18.0进行分析(美国SPSS Inc .,芝加哥,IL)。统计各组之间差异被单向方差分析,评估和事后多重比较使用Student-Newman-Keuls进行测试。显著性水平是设定在 。
3所示。结果
3.1。hUCMSCs的隔离、标识和标签
在组织块附件8 - 10天,长梭形细胞中观察到的组织块之间的差距。组织块周围的细胞融合达到90%至95%,大约16天的培养。形态分离和培养的主要细胞(P0)与成纤维细胞相似。这些细胞主要是polygonous P1和逐渐改变成一个统一的主轴在第四段(图形状1(一))。
(一)
(b)
(c)
细胞免疫表型使用流式细胞分析仪测定。细胞阳性细胞表面标记CD105, CD90、CD29、CD44,和HLA-I但对细胞表面标记CD45不利,CD34, CD11b, CD31、vWF、CD19和HLA-DR(图1 (b))。这些结果符合immune-phenotypic msc的标志。
hUCMSCs从段落4 - 8有一个统一的纺锤形状,和稳定的生物学性质对数增殖周期。hUCMSCs是使用慢病毒载体用GFP标记的策略。我们的数据表明,这种策略是高效生产感染性病毒颗粒表达绿色荧光蛋白( )在接枝hUCMSCs(图1 (c))。
3.2。的迁移和分布GFP-Labeled hUCMSCs
评估是否GFP-labeled hUCMSCs迁移到受伤严重烧伤引起的器官,组织标本的心脏,肾脏,肝脏也准备为观察冷冻切片的迁移和分布格局GFP-labeled hUCMSCs用倒置荧光显微镜。在细胞移植后24小时内,我们发现GFP-labeled hUCMSCs主要集中在心脏的血管,肾脏,肝脏,极少数细胞迁移到组织器官。然而,我们没有发现的荧光信号hUCMSCs在老鼠身上的烧伤组(图2)。
3.3。hUCMSCs政府减轻结构损伤的重要器官
探讨hUCMSCs政府对心脏的受损结构的影响,肾脏,严重烧伤和肝脏在24 h后,我们使用圆)染色评估这些器官的结构变化。如图3虚假的集团,而严重的肌肉分解,空泡变性,肌浆凝集的心,扩张肾小球系膜区和毛细循环缺血的肾脏,肝脏和肝细胞肿胀和空泡的变化是引起严重的烧伤。然而,hUCMSCs政府可以显著提高结构破坏的重要器官。
3.4。hUCMSCs政府降低细胞凋亡率的重要器官
评估hUCMSCs政府对细胞凋亡率的影响心脏,肾脏,严重烧伤和肝脏在24 h后,我们检测细胞凋亡率的重要器官使用TUNEL染色3组。如图4(a),细胞凋亡率的心脏,肾脏,肝脏和烧伤组明显高于虚假的集团,他们燃烧+ hUCMSCs组明显低于烧伤组。定量分析的结果提出了相应的直方图(图4(b))。
(一)
(b)
3.5。hUCMSC政府提高血清生化参数
3组大鼠的血清样本在24 h后严重的燃烧进行了分析的关键和敏感的生物化学参数总结如表1。高敏感参数的心肌损伤,肌钙蛋白,CK,以及水平燃烧组显式地增加比虚假的集团,他们大大减少了hUCMSCs管理。此外,我们还发现,肝功能的水平参数ALT、AST、LDH和肾功能参数尿素和肌酐的水平在烧伤组明显高于那些虚假的集团和他们的水平燃烧+ hUCMSCs组明显低于烧伤组。
3.6。hUCMSCs政府增加保护性细胞因子
阐明潜在机制的影响hUCMSCs保护这些受伤的器官,我们下一个测试antiapoptosis细胞因子igf - 1的水平和apoptosis-related蛋白质,如bcl - 2、BAX的心脏,肾脏,肝脏在三组。如图5(一个),igf - 1水平燃烧+ hUCMSCs组的心脏,肾脏,肝脏组织明显高于骗局和烧伤组。此外,bcl - 2、BAX燃烧组织的心脏,肾脏,肝脏组织明显低于那些虚假的团体,而燃烧+ bcl - 2、BAX hUCMSCs组显著高于燃烧和虚假的团体。定量分析的结果提出了相应的直方图(图5 (b))。
(一)
(b)
(c)
4所示。讨论
烧伤是最常见的一种损伤在和平时期和战争。世界卫生组织估计,每年超过265000人死亡的结果从烧伤,95%以上发生在低收入和中等收入国家(24]。在中国,烧伤后第二大伤创伤造成的交通事故。和严重burn-induced组织和器官损伤可能导致多器官功能障碍综合征(插件)和多个器官损伤多器官功能衰竭(MOF),甚至死亡(9,25]。烧伤严重程度通常直接关联到全身燃烧表面积(回溯)和深受伤组织(26]。30%以上回溯的深度烧伤在成人和10%回溯深度烧伤的儿童,他们被认为是严重的烧伤,可以诱发多器官损伤和过度系统性炎症。严重的燃烧是一个复杂和严重外伤后急性期死亡率高,提示和适当治疗严重烧伤是必要的,尤其是在阶段。
间充质干细胞(msc)被认为是完美的候选细胞治疗和再生医学。msc的杰出代表,人脐带msc (hUCMSCs)有很多优势,如放大时间短、高增殖率、低免疫原性、高安全、丰富,方便与其他原始msc。在先前的研究中,我们发现hUCMSCs移植可以加速严重烧伤伤口愈合和减轻严重burn-induced在大鼠急性肺损伤20.,27]。蔡等人的研究也显示,联合疗法的msc和低流量体外生命支持(宴请非常有效的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和财政部由于吸入损伤和烧伤9]。此外,越来越多的证据表明,hUCMSCs可以保护严重烧伤和创伤性脑损伤(TBI)诱发多器官功能障碍主要是通过分泌生物活性因子,如凋亡因子,免疫调节因子,抗氧化因子,和液28- - - - - -30.]。在这项研究中,我们发现hUCMSCs政府保护重要器官的功能,如心脏,肾脏,肝脏,改善组织病理学改变引起严重的烧伤。hUCMSCs政府的作用可能的机制包括鼓励hUCMSCs迁移,增加保护性细胞因子igf - 1水平和bcl - 2 /比伯灵顿,然后在这些主要器官减少细胞凋亡率。
首先,我们获得hUCMSCs仍然使用组织块附件方法按照以前的程序(31日]。同样,细胞通过流式细胞分析仪,并贴上绿色荧光蛋白(GFP)使用慢病毒的策略。流式细胞分析仪的鉴定结果是符合immune-phenotypic msc的标志。此外,GFP-labeled hUCMSCs移植,我们进一步的影响特征hUCMSCs管理在严重烧伤后早期器官结构和功能,以及与疗效相关的潜在机制。
接下来,我们发现管理hUCMSCs主要迁移到血管受伤器官血流量在严重烧伤后24小时,和极少数细胞出现在这些器官组织。msc迁移到这些受损的器官,对于他们的交易可能参与的复杂过程,外渗,自导,和迁移细胞移植后,和一些趋化因子,如SDF-1 CCR1, CCL25, CX3CL1,可能扮演一个关键的招聘的作用关键阶段(32- - - - - -34]。
我们的研究结果还表明,hUCMSCs管理明显改善严重burn-induced结构破坏和减少细胞凋亡率心脏,肾脏和肝脏。此外,心肌损伤的生化参数,肝功能、肾功能和血清中显式地增加了严重烧伤后,他们也明显减少了hUCMSCs管理。因此,hUCMSCs可以更好地保护器官的结构和功能严重烧伤后早期。和其他临床研究也表明hMSCs治疗心肌梗死的研究价值,糖尿病、脓毒症、肝功能衰竭、急性肾功能衰竭、急性肺损伤(ALI) (35- - - - - -39]。但管理hUCMSCs不大规模集成到受伤的组织,所以我们推测合理hUCMSCs发挥作用的主要机制,通过旁分泌保护修复受损组织细胞因子。我们认识到,igf - 1是一个重要的保护性因素和bcl - 2是一个关键antiapoptosis蛋白质,可抑制凋亡进展和加速受伤器官再生(40,41]。因此,我们发现代表和保护细胞因子的水平,如igf - 1、bcl - 2,在这些重要器官和伯灵顿,包括心脏、肾脏和肝脏41]。我们的研究结果还表明,hUCMSCs管理显著提高igf - 1水平,调节bcl - 2、BAX的比率相比烧伤组。
总之,hUCMSCs移植减多器官损伤和保存这些器官功能严重烧伤后早期通过鼓励hUCMSCs的迁移,提高igf - 1水平防护细胞因子和bcl - 2 /比伯灵顿,随后减少细胞凋亡和伤害的严重烧伤大鼠的主要器官。
数据可用性
本文的所有原始数据可以通过联系相应的作者,Lingying刘博士。
附加分
语句。(1)所有的研究本文介绍之后遵守赫尔辛基宣言国会和伊斯坦布尔。(2)使用囚犯并没有参与这项研究,和所有的参与者收到付款或胁迫。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Te英航宏宇王、王琼和龙龙杨负责概念和设计,收集和汇编的数据,数据分析和解释,和手稿写;Lingying刘负责概念和设计,金融支持,数据解释和手稿的最终批准。Xingxia, Chenyi李,曰阴负责研究材料供应和数据收集。宏宇Wang Wang,龙龙的Te英航杨的贡献同样这项工作。
确认
这项工作得到了国家自然科学基金研究项目(81701900),主要项目的军事后勤支持部门(ALB19J001),托儿所解放军总医院(17 kmm28)基金,第一附属医院解放军总医院科学研究基金会(2017 fc - 304 m - cxyy - 01),转化医学的基础解放军总医院(2017 tm - 029),内蒙古自然科学基金项目(2020 ms08022和2020 ms08181),内蒙古自治区科技创新指导项目(CXYD2020BT03)和科技重大疾病的预防和治疗行动计划(2018 - zx - 01 - 001)。