文摘

成骨与血管生成过程中紧密相关的骨骼发育、再生和重构。除了提供营养和氧气为骨组织,血管周围骨组织还会分泌一些因素来调节骨形成。H型船只是由血小板源生长factor-BB (PDGF-BB)被证实血管新生和骨生成。最近,preosteoclasts PDGF-BB的被确认为最重要的来源。因此,抑制破骨细胞的成熟,提高PDGF-BB分泌,刺激H型血管生成,随后加速骨再生可能有效的治疗骨质疏松疾病。在目前的研究中,aucubin,环烯醚萜苷提取Aucuba粳稻和杜仲,发现抑制骨质流失在切除卵巢的老鼠。我们进一步证实aucubin可以抑制tartrate-resistant融合酸性磷酸酶(陷阱)+preosteoclasts为成熟破骨细胞,间接增加血管生成H型船。底层机制是aucubin-induced抑制MAPK / NF -κB信号,这就增加了preosteoclast数量和随后通过PDGF-BB促进血管生成。这些结果提示,aucubin antiosteoporosis药物的候选人,这需要进一步的研究。

1。介绍

成骨细胞和破骨细胞的功能变化导致骨骼系统的动态变化。破骨细胞和成骨细胞之间不协调的行动可能导致许多骨质流失的疾病,如骨质疏松症。最近,我们对骨病的理解已经超出了骨头本身,和骨和骨微环境之间的关系,特别是血管,已经逐渐认可。H型船只,一个特定的毛细管亚型CD31、endomucin (CD31嗨Emcn嗨)标记,可以为骨组织(提供营养和氧气1,2]。重要的是,H型血管进一步确定osteoprogenitors和互连骨形成和骨吸收的过程在骨再生(3,4]。angiocrine因素的组合得到了H型船只,成骨细胞和破骨细胞可能两骨微环境的相互作用以及血管新生和骨生成的协调5- - - - - -9]。然而,H型船只的相对丰度较低的增加和减少衰老和疾病的进展2]。

先前的研究表明,PDGF-BB由preosteoclasts有能力推动H型血管血管生成和随后增加骨(10]。然而,与破骨细胞的成熟,PDGF-BB由破骨细胞分泌逐渐减少。因此,抑制preosteoclasts的成熟可以抑制骨吸收,重要的是通过促进血管生成促进骨形成H型容器和可能对骨质疏松症有前景的治疗策略。

Aucubin是一个环烯醚萜苷的提取Aucuba粳稻和杜仲叶子。它有多种功能,如抗炎、抗氧化,心血管,神经保护作用[11- - - - - -16]。近年来,研究发现,aucubin也通过增加骨形成与骨代谢相关(17,18]。此外,aucubin报道促进血管生成在小鼠后肢缺血模型(19]。Aucubin可以发挥抗氧化作用,抑制NF -κB信号通路(11,20.),这也是osteoclastogenesis过程中一个非常重要的信号。然而,aucubin对破骨细胞的影响和H型血管血管生成仍然未知。在这个研究中,我们探索aucubin能否抑制preosteoclasts和增强血管生成的成熟上调PDGF-BB的分泌。

2。材料和方法

2.1。动物和治疗

所有的动物实验研究的伦理委员会的监督下河北医科大学第三医院。的雌性BALB / c小鼠购买河北医科大学动物实验中心和维护之前使用。所有的老鼠都养在标准环境下房间随意访问水和食物。所有的动物被随机分配到以下三组:(1)虚假的集团(sham-operated组+ PBS),(2)卵巢切除术(OVX + PBS),和(3)aucubin组(OVX + aucubin)。卵巢切除卵巢切除术是由两国的12周大。一周后OVX操作,aucubin组5毫克/公斤aucubin腹腔内注射每两天。相应地,OVX组注射等量的PBS在同一频率。所有的老鼠都牺牲了一个月后;血液和股骨进行进一步的实验。

2.2。ct机分析

微ct扫描在孤立的骨骼进行使用SkyScan1176(力量、比利时)μCT扫描仪。9μ米/像素的分辨率设置在书房里。扫描电压65 kV,目前是153μ分析了a股的小梁参数干骨后端数据分析软件(CTAn、v1.9 SkyScan)和3 d模型可视化软件(v2.0, CTVol SkyScan)。骨小梁的3 d分析是由创建股骨的横断面图像。小梁参数测量骨小梁体积/总量(BV /电视,%),小梁数目(结核病。N,毫米−1),小梁分离(Tb.Spμ米),小梁厚度(结核病。Th、毫米)和组之间的差异比较。

2.3。苏木精和伊红(他)染色和Tartrate-Resistant酸性磷酸酶染色(陷阱)

他在4染色进行染色和陷阱μm 3周后的股骨骨脱钙作用在10% EDTA溶液。因为他染色,4μ米厚的部分样本处理染色后固定,石蜡包埋和脱钙作用。获得的图像是由一个光学显微镜、及相关骨组织学参数计算。陷阱染色,染色的陷阱工具包(Sigma-Aldrich)组织固定后使用和嵌入式根据指令。陷阱染色后,样品被光学显微镜分析。TRAP-positive与三个多核细胞被定义为破骨细胞,和TRAP-positive细胞preosteoclasts不到三核。

2.4。Immunofluorescent样本的分析部分

immunofluorescent(如果)染色,股骨样本切成16μ米厚的部分固定24小时,后3周脱钙,嵌入在8%的明胶。简单地说,16μ第一次洗米厚的部分有1% PBST (1% Triton x - 100溶于PBS) 30分钟前三次片孵化与5% BSA在37°C 1 h。然后,样本孵化与主要抗体CD31(美国马Abcam) EMCN(美国马Abcam)和骨钙素(美国马Abcam)一夜之间在4°C。最后,相应的fluorescence-conjugated二级抗体染色在37°C 1 h。

2.5。细胞培养

RAW264.7细胞,巨噬细胞细胞系,购自中国科学院细胞银行(上海,中国)。αmem补充heat-inactivated 10%胎牛血清(的边后卫)和1% penicillin-streptomycin用于文化RAW264.7细胞。诱导破骨细胞分化、细胞治疗与50 ng / mL受体激活核因子κB配体(RANKL)与不同浓度的aucubin(0、1或5μ米)为6天。微血管内皮细胞的老鼠(MMECs)从Procell购买(武汉,中国)和培养内皮细胞培养基(ECM)。所有细胞培养在37°C公司为5%2。

2.6。细胞生存能力分析

细胞生存能力是由一个细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验(Zomanbio,北京)根据制造商的指示。首先,RAW264.7细胞被播种到96孔板的密度 细胞每口井。治疗后与aucubin(0、1或5μ米)24、48和72小时,10μL CCK-8解决办法是补充道。最后,在450海里是由一个微型板块分光光度计测量吸光度(美国加利福尼亚州圣何塞BioTek仪器,)孵化后在37°C为另一个4 h。

2.7。陷阱染色的细胞

巨噬细胞细胞系和4%多聚甲醛固定后几天的osteoclastogenesis感应。然后,使用陷阱陷阱染色进行染色工具包(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)根据制造商的指示。陷阱染色后,样品被光学显微镜分析。一样的组织样本,陷阱+单核细胞和多核细胞有超过三个核确认为preosteoclasts和破骨细胞,分别。

2.8。Immunofluorescent分析细胞的

immunofluorescent染色,细胞首先对待Triton x - 100年阻止10% BSA之前半个小时。然后,细胞被染色的主要抗体NFATc1(美国圣克鲁斯,CA)或p65(美国马CST)一夜之间在4°C。最后,样品在室温下与二次抗体染色1 h。

2.9。肌动蛋白成环作用分析

简单地说,第一次刺激巨噬细胞行细胞Rankl和不同剂量的aucubin 6天。然后,培养破骨细胞与0.5% Triton x - 100透化作用后用4%多聚甲醛固定。随后,FITC-conjugated phalloidin用于f -肌动蛋白染色戒指,和核沾染了4 ,6-diamidino-2-phenylindole DAPI染色。最后,一个扫描共焦显微镜(尼康、东京、日本)被用来把荧光图像。ImageJ软件被用来分析f -肌动蛋白的数量和大小环。

2.10。迁移分析

在迁移试验,MMECs播种6-well文化板块和培养,直到单细胞层汇合的。然后,细胞培养在不同的治疗方法。MMECs被用于两个平行实验。在第一个实验中,MMECs培养的内皮细胞培养基有或没有aucubin。在第二个实验中,MMECs在不同的培养条件培养液(CM)。根据治疗组分为以下组:车辆从RAW264.7细胞(CM) +免疫球蛋白(Abcam、剑桥郡swavesey村庄、英国)集团的Rankl (CM是来自RAW264.7细胞刺激Rankl) +免疫球蛋白组,Rankl + Aucubin (CM是来自RAW264.7细胞Rankl和Aucubin刺激在同一时间)+免疫球蛋白组和Rankl + Aucubin (CM收集RAW264.7细胞刺激和Rankl Aucubin) + PDGF-BB抗体(研发、明尼阿波利斯、美国)组。细胞单层挠着吸管枪的洗涤与PBS紧随其后。0后,24日,48小时内,伤口被ImageJ通过显微镜和测量软件。

2.11。管形成分析

执行管形成化验,50μ信用证的基底膜基质(美国BD)文化传播在96孔板细胞孵化器和孵化出了半个小时。然后,MMECs被播种在96孔板和固化凝胶培养密度在不同的治疗方法 细胞/。MMECs被用于两个平行实验类似划痕试验。首先,MMECs培养的内皮细胞培养基有或没有aucubin。随后,MMEC组分为以下组:车辆从RAW264.7细胞(CM) +免疫球蛋白g组的Rankl (CM是来自RAW264.7细胞刺激Rankl) +免疫球蛋白组,Rankl + Aucubin (CM是来自RAW264.7细胞Rankl和Aucubin刺激在同一时间)+免疫球蛋白组和Rankl + Aucubin (CM收集RAW264.7细胞刺激和Rankl Aucubin) + PDGF-BB抗体组。6小时后,管形成收购显微镜和衡量Image-Pro + 6软件。

2.12。酶联免疫吸附试验(ELISA)

CTX-1的浓度、OCN PDGF-BB,血清VEGF,骨组织或条件培养基测定使用商业ELISA包根据制造商的指示。每组的内容是由一个微型板块检测读者。从Cusabio PDGF-BB酶联免疫试剂盒获得(武汉,中国)。VEGF、CTX-1 OCN酶联免疫试剂盒买来多科学有限公司(杭州)。

2.13。实时rt - pcr

试剂盒试剂(Tiangen,北京),RevertAid™合成第一链cDNA工具包(美国沃尔瑟姆热),和SuperReal预混料+ (Tiangen,北京)PCR设备被用来执行实时rt - PCR分析。首先,总RNA提取试剂盒试剂在reverse-transcribed之前cDNA根据协议。然后,实时rt - pcr进行以下说明。在这个过程中,GAPDH被选为内部控制,2−ΔΔCt方法被用来评估相对基因表达。实验使用的特定的引物序列如下:GAPDH: 5 - - - - - -AGTTCAACGGCACAGTCAAGG-3 ,5 - - - - - -AGCACCAGCATCACCCCAT-3 ;Atp6v0d2: 3 - - - - - -AGCAAAGAAGACAGGGAG-5 ,5 - - - - - -CAGCGTCAAACAAAGG-3 ;NFATc1: 3 - - - - - -CAACGCCCTGACCACCGATAG-5 ,5 - - - - - -GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3 ;组织蛋白酶K: 3 - - - - - -CAGCAGAACGGAGGCATTGA-5 ,5 - - - - - -CTTTGCCGTGGCGTTATACATACA-3 ;PDGF-BB: 3 - - - - - -CCTCGGCCTGTGACTAGAAG-5 ,5 - - - - - -CCTTGTCATGGGTGTGCTTA-3 ;DC-STAMP: 3 - - - - - -GATCACCTGTGTTTTCCTATGC-5 ,5 - - - - - -CAATCAAAGCGTTCCTACCTTC-3 ;C-fos: 3 - - - - - -CGGGTTTCAACGCCGACTA-5 ,5 - - - - - -TTGGCACTAGAGACGGACAGA-3 ;MMP-9: 3 - - - - - -GCGTCGTGATCCCCACTTAC-5 ,5 - - - - - -CAGGCCGAATAGGAGCGTC-3 ;VEGF: 3 - - - - - -GAGGTCAAGGCTTTTGAAGGC-5 ,5 - - - - - -CTGTCCTGGTATTGAGGGTGG-3 ;MMP-2: 3 - - - - - -TCAAGTTCCCCGGCGATG-5 ,5 - - - - - -AGTTGGCCACATCTGGGTTG-3 。

2.14。免疫印迹分析

里帕裂解缓冲(Beyotime、上海、中国),12% SDS-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(美国Billerica的微孔,MA)被用来执行免疫印迹分析。简而言之,里帕裂解缓冲被用来获得总蛋白质。然后,25μg解决了蛋白质sds - page,随后转移到PVDF膜。百分之十BSA Tris-buffered盐水混合渐变20 (TBST)被用来阻止PVDF膜。膜是沾主要抗体GAPDH (1: 10000), PDGF-BB(1: 1000),组织蛋白酶K (1: 1000), c-fos (1: 1000), NFATc1 (1: 1000), p-JNK(1: 500),物(1:1000),p-p38 (1: 1000), p38 (1: 1000), p-p65 (1: 1000), p65 (1: 1000), p-IKBα(1:1000),或德国产业投资银行α(1:1000)在4°C 8 h。最后,膜与二次孵化抗体(罗克兰1:20000年,美国)在室温下1小时。奥德赛红外成像系统是用来检测每个小组的整体强度。抗体的NFATc1 PDGF-BB, Emcn购自圣克鲁斯生物技术(圣克鲁斯、钙、美国)。物,p-JNK p-p38, p38 p-IKBα,德国产业投资银行α、p-p65 p65抗体得到从细胞信号技术(丹弗斯、马、美国)。c-Fos、CD31 OCN, GAPDH抗体购自Abcam(美国Cambridge, MA)。

2.15。统计分析

在目前的研究结果表示为 。结果来自至少3独立复制。Kolmogorov-Smirnov测试用于测试实验数据的正常的假设。一个独立的样品 - - - - - -测试是用于比较两组,和单向方差分析(方差分析),其次是学生纽曼Keuls (S-N-K)事后分析用于分析在多个组。对于非参数数据,克鲁斯卡尔-沃利斯检验。分析所有数据使用SPSS 20.0软件,测量和统计意义 。

3所示。结果

3.1。Aucubin抑制OVX-Induced骨质流失和增加H型血管形成

为了评估aucubin对骨质疏松的影响和H型形成,一个OVX小鼠模型是本研究中生成。OVX明显受损骨骼结构与虚假的组相比,而腹腔内注射aucubin OVX小鼠部分减毒这骨质流失的ct机扫描(图所示1(一))。相应地,结核病的定量分析。N, BV / BT %和结核病。Th OVX手术后明显减少;然而,这些削减被aucubin减轻治疗(数字1 (b)- - - - - -1 (d))。Aucubin也减少了骨小梁体积分数增加(Tb.Sp) OVX所致(图1 (e))。他还染色证实aucubin可以挽救OVX-induced骨质流失(数字1 (f)和1 (g))。符合这一发现,ELISA结果表明aucubin显著废除OCN的血清水平下降以及CTX-1含量的增加引起的血清OVX(数字1 (h)和1(我))。

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图1
OVX Aucubin改善骨质疏松引起的。(一)微ct图像和定量分析。(中)的小鼠股骨不同组。BV /电视:骨体积/总量;结核病。N:小梁数;结核病。Sp:小梁分离;结核病。Th:小梁厚度。 (f) Representative haematoxylin and eosin (HE) staining of femurs; scale bar: 100 μm。(g)量化BV /电视%他染色。(h i)的浓度OCN和CTX-1血清ELISA检测。 每组。 而虚假的集团。# 相比OVX组。

陷阱染色是用来证实在体内osteoclastogenesis aucubin的抑制功能。一致的变化在血清骨吸收指标,OVX小鼠大量多核破骨细胞。然而,aucubin政府显著降低成熟破骨细胞的数量以及增加preosteoclasts(数据的数量2(一)和2(b))。结果证实,在破骨细胞成熟aucubin有抑制作用。破骨细胞的数量在每组不同,组间PDGF-BB在骨髓改变的内容。PDGF-BB OVX操作后下降。然而,PDGF-BB aucubin干预后内容增加(图2(c))。Emcn和CD31双染色法被用来确认aucubin对血管生成的影响H型血管。H型船只的数量是减少了OVX,和aucubin治疗导致显著upregulation船在这个特定类型(数据2(d)和2(e))。此外,aucubin对骨形成的影响也被检测到。Aucubin部分缓解减少OCN在骨表面造成OVX(数字2(f)和2(g))。体内实验表明,aucubin治疗减少破骨细胞的数量,促进H型血管的血管生成,增加骨形成。所有的动物实验表明,preosteoclast-induced血管生成促进可能是一个潜在的机制aucubin保护骨骼。


图2
Aucubin抑制破骨细胞的形成,促进PDGF-BB分泌,促进OVX小鼠H型血管形成。(一)陷阱染色的腿节计算数量的破骨细胞和骨preosteoclasts表面。酒吧规模:200μm。(b)量化的口服避孕药poc /骨表面的不同群体。BS:骨表面。(c)量化PDGF-BB水平的骨髓被ELISA检测和分析。(d) H型血管被CD31检测嗨Emcn嗨如果两倍。酒吧规模:100μm。(e) H型船只在每组定量分析。BM:骨髓;医生:生长板。 每组。(f)代表的图像如果染色OCN,酒吧规模:50μm。(g)的量化OCN +细胞表面/骨表面。结核病:小梁骨;BM:骨髓。 相比虚假的组;# 相比OVX组。
3.2。Aucubin Preosteoclast数量增加,抑制破骨细胞成熟

CCK-8试验进行检测aucubin对细胞活力的影响。结果发现1、2和3天后aucubin管理工作。没有明显的影响aucubin RAW264.7细胞生存能力在低浓度(1μ米)或高浓度(5μ米)(图3(一个))。为了检测的影响aucubin osteoclastogenesis,陷阱进行染色后6天RAW264.7细胞Rankl和管理或没有aucubin刺激。结果表明,成熟破骨细胞的数量在RAW264.7细胞Rankl感应而融合下陷阱增加+ preosteoclasts aucubin治疗,抑制了与高剂量的抑制作用更明显aucubin(数字3 (f)和3 (g))。这些发现表明,aucubin有能力防止preosteoclasts到多核破骨细胞的成熟过程。rt - pcr分析被用来评估osteoclast-related mRNA的表达和聚变相关的信使rna,包括NFATc1、组织蛋白酶K (CTSK) ATP6V0D2, DC-STAMP。如数据所示3 (b)- - - - - -3 (e),aucubin显著抑制osteoclast-related mRNA (NFATc1和CTSK)以及破骨细胞融合mRNA刺激巨噬细胞RANKL的细胞。并行测试,免疫印迹结果表明c-Fos NFATc1蛋白表达下调的aucubin(数字3 (h)- - - - - -3 (j))。接下来,如果染色进行评估的影响aucubin NFATc1,破骨细胞分化的关键因素。结果显示NFATc1的增加引起的RANKL 12小时后部分抵消aucubin(数字3 (k)和3(左))。这些部分的结果表明,aucubin压低了融合preosteoclasts通过抑制osteoclast-related因素。

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图3
Aucubin preosteoclasts体外的数量增加。(a)细胞的可行性RAW264.7细胞培养与不同浓度的aucubin (0, 1μ5米,μ通过CCK-8测定M)进行了分析。(中)相对NFATc1 mRNA表达水平,c-FOS, DC-STAMP, ATP6V0D2进行了分析。(f)代表陷阱染色在6天的图像。酒吧规模:200μm。(g)量化的破骨细胞(OCs)和preosteoclasts (poc) 6天。(h-j)蛋白质含量c-Fos WBs NFATc1进行了分析。(k)如果染色进行观察NFATc1的位置。酒吧规模:50μm。(l)的量化相对NFATc1荧光强度在不同的组。 相对于对照组;# 相比Rankl组。
3.3。通过增加Aucubin促进血管生成PDGF-BB体外的生产

如果、ELISA和免疫印迹进行确定aucubin干预的影响在监测生产PDGF-BB分化(数字4(一)- - - - - -4 (e))。PDGF-BB增加Rankl刺激的内容。同时,PDGF-BB进一步增强的抑制破骨细胞前体细胞融合aucubin治疗(数字4(一)和4 (b))。经ELISA, Rankl的内容增加PDGF-BB上层清液和aucubin强Rankl-induced PDGF-BB剂量依赖性的方式(图4 (c))。也与ELISA结果一致,aucubin调节PDGF-BB的蛋白质和mRNA的表达水平(数字4 (d)- - - - - -4 (f))。因此,我们建议aucubin提拔的分泌PDGF-BB通过提高preosteoclasts的数量。

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Aucubin增强PDGF-BB体外的生产。(一)如果染色进行观察PDGF-BB的生产。酒吧规模:50μm。(b)量化的相对PDGF-BB荧光强度。(c)的浓度PDGF-BB在CM中被ELISA分析。(d)蛋白水平分析了PDGF-BB WBs。(e)的量化PDGF-BB蛋白表达与不同的治疗方法。(f)量化PDGF-BB mRNA的表达有不同的治疗方法。 相对于对照组;# 相比Rankl组。

评估是否aucubin直接影响血管生成,刮伤分析(数据5(一个)和5 (b))和管形成分析(数据5 (c)和5 (d))进行。定量测量显示aucubin没有显著影响MMECs的迁移能力和管形成能力。为了证实aucubin preosteoclast-stimulated血管生成和迁移的影响,MMECs被培养在不同的组:车辆+免疫球蛋白组,Rankl +免疫球蛋白组,Rankl + aucubin +免疫球蛋白g grpup, Rankl + aucubin + PDGF-BB抗体组。划痕试验所示,迁移能力MMECs Rankl +免疫球蛋白组显著提高车辆+免疫球蛋白组相比,和aucubin + Rankl的上层清液组增强的效果当结合Rankl集团(数字5 (g)和5 (h))。进一步验证更改由PDGF-BB, PDGF-BB-neutralizing抗体进一步添加到RANKL + aucubin集团和抑制细胞迁移。管形成实验的结果类似于划痕试验。CM的Aucubin进一步扩大管总长度相比Rankl +免疫球蛋白组。然而,这种增加是由PDGF-BB-neutralizing减毒抗体(数字5(我)和5 (j))。就是明证PCR、表达MMP-9 MMP-2,和VEGF mRNA aucubin + Rankl +免疫球蛋白组相比增加的Rankl +免疫球蛋白组和PDGF-BB-neutralizing抗体消除MMP-9的增加,MMP-2, VEGF mRNA aucubin厘米(图引起的5 (e))。与PCR结果一致,VEGF浓度的增加在aucubin + Rankl +免疫球蛋白组被中和抗体PDGF-BB(图5 (f))。总之,aucubin通过增加生产PDGF-BB preosteoclasts促进血管生成。

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Aucubin促进MMECs proangiogenic preosteoclasts的影响。(一)代表图像迁移MMECs面积在不同的治疗方法。酒吧规模:200μm。(b)的量化迁移MMECs面积在不同的治疗方法。酒吧规模:200μm。(c)代表的图片管形成MMECs刺激不同的治疗方法。酒吧规模:200μm。(d)的量化管形成MMECs刺激不同的治疗方法。(e)相对mRNA表达的VEGF水平,MMP-9, MMP-2 MMECs不同的CMs。(f) VEGF浓度在CM中被ELISA分析。(g)的代表图像迁移MMECs面积在不同的治疗方法。酒吧规模:200μm。(h)的量化迁移MMECs面积在不同的治疗方法。 相比汽车+免疫球蛋白组;& 相比Rankl +免疫球蛋白组;# 相比Rankl + Aucubin +免疫球蛋白组。管形成的图像(i)代表MMECs刺激不同的治疗方法。酒吧规模:200μm。(h)的量化管形成MMECs刺激不同的治疗方法。 相比汽车+免疫球蛋白组;& 相比Rankl +免疫球蛋白组;# 相比Rankl + Aucubin +免疫球蛋白组。
3.4。Aucubin抑制RANKL-Induced MAPK和NF -κB信号

为了阐明aucubin机制对破骨细胞形成和PDGF-BB生产、MAPK和NF -κB信号通路,在osteoclastogenesis扮演重要角色,被检测到。西方印迹证实aucubin显著抑制MAPK信号通路。活动形式的兵,p38和物在20和30分钟被aucubin抑制治疗的价格相比Rankl集团(数字6(一)- - - - - -6 (d))。为了进一步澄清是否NF -κB信号参与机制aucubin的影响,德国产业投资银行α和p65蛋白检查(数字6 (e)和6 (f))。结果显示,aucubin抑制IKB的激活α(数据6 (e)和6 (f))。德国产业投资银行α调节的活动中p65 NF -κB信号通路。此外,p65也被aucubin磷酸化(数字6 (e)和6 (f))。如果染色和存在的结果进一步表明,NF -κB易位细胞核被Rankl激活和抑制aucubin(数字6 (g)和6(我))。上述结果表明,aucubin抑制Rankl-induced osteoclastogenesis通过MAPK和NF -κB信号通路。

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图6
Aucubin抑制MAPK和NF -κB信号通路。(a)由WBs MAPK家族的蛋白质含量进行了分析。(罪犯)量化MAPK家族蛋白表达。 相比Rankl组在20分钟;# 相比Rankl组30分钟。(e)蛋白质含量的NF -κ分析了B家族WBs。(f)量化的NF -κB家族蛋白质水平。 相比Rankl组在20分钟;# 相比Rankl组30分钟。(g)的位置通过如果p65荧光观察。酒吧规模:50μm。(h)相对p65荧光强度进行了分析。 相对于对照组;# 相比Rankl组。(我)相对p65信使rna进行了分析。 相对于对照组; 相比Rankl组。

4所示。讨论

骨质疏松,骨,以定量和定性恶化已经成为最严重的慢性疾病(21]。骨形成和骨吸收的不平衡是骨质疏松症的最直接原因。最近的研究证实,骨微环境,特别是血管系统,扮演了一个至关重要的部分在维护正常的骨代谢的过程(22]。H型血管大多是由PDGF-BB骨重塑(至关重要4]。此外,先前的研究已经证实,抑制破骨细胞分化的前驱阶段可以促进生产PDGF-BB [23- - - - - -25]。因此,阻断骨吸收和增强促进骨生成的H型血管可能代表一个新的方向bone-lost疾病的治疗。在这项研究中,证明aucubin抑制preosteoclast融合到多核破骨细胞,促进PDGF-BB的内容,增加了H型船只的数量,最终需要预防体内OVX-induced骨质流失。

Aucubin来源于杜仲传统中药,有骨保护作用。作为一个环烯醚萜苷化合物,aucubin显示抗炎和抗氧化作用26]。最近的一项研究也表明,aucubin调节新血管形成在下肢动脉缺血19]。然而,对骨的影响并不清楚。在目前的实验中,我们构建了一个OVX模型检测aucubin对骨代谢的影响。aucubin腹腔注射可显著提高OVX造成的骨量,而李同意报告的结果et al。17,18]。的内容与此同时,在骨髓增加PDGF-BB aucubin干预,表明aucubin可能增加骨量通过加强PDGF-BB引起的血管生成。进一步免疫荧光结果与这些研究结果一致,表明aucubin可以移植量H型血管CD31和endomucin的特征。尽管低量,H型血管进行骨形成的过程紧密osteoprogenitors包围。除了提供血液供应、H型血管可以分泌多种因素刺激osteoprogenitors的扩散和骨生成。与老龄化有关的骨质流失和骨骼疾病至少部分的数量和类型的函数H血管的变化。符合之前的研究,目前的研究还表明,H型船只的内容是有关OVX-induced骨质流失。研究表明,H型血管起到至关重要的作用在治疗骨质疏松症,骨折,和其他骨质疏松疾病模型27,28]。在目前的研究中,aucubin衰减造成的降低血清和骨组织OCN OVX和扩大H型船只的数量。这个结果表明,aucubin可能是一个候选人对骨质疏松性治疗。

在目前的研究中,独自aucubin没有增加体外血管生成表明aucubin引起的增强血管生成可能由于一个间接影响。此外,我们发现一个upregulation PDGF-BB在CM aucubin的管理。和显著增强血管生成活动MMECs伴随着PDGF-BB水平的提高,在培养厘米。同时,VEGF,血管生成的重要标志,是调节后的管理aucubin + Rankl厘米。以往的研究表明PDGF-BB的水平和VEGF有紧密的关联29日]。PDGF上游是一个重要的中介在低氧诱导VEGF老年病30.]。和PDGF-BB报道诱导VEGF的分泌的方式依赖于一种蛋白激酶和激活MAPK在卵巢癌31日]。增强血管生成活动引起aucubin + Rankl厘米被废除的干预PDGF-BB-neutralizing抗体,确认的upregulation被PDGF-BB诱导血管生成活动。先前的研究已经证实,PDGF-BB可以提高H型血管血管生成和随后的骨在骨重塑(32]。PDGF-BB是PDGF家族的重要一员重要的扩散过程中,移民和内皮祖细胞的分化。发挥其功能通过绑定到特定的受体PDGF受体β(PDGFRβ)增殖激酶和诱导信号级联(33]。最近,preosteoclasts PDGF-BB的被证实是最重要的来源。在目前的实验中,aucubin政府导致的积累在CM PDGF-BB preosteoclasts的数量增加。进一步机制的实验显示aucubin preosteoclasts的数量增加了NFATc1的表达减少,DC-STAMP, Rankl ATPV0D2信使rna诱导。NFATc1监管者osteoclastogenesis过程中是至关重要的。除了控制破骨细胞分化相关基因陷阱的表达和组织蛋白酶K, NFATc1还参与破骨细胞通过细胞融合的multinucleation分子(34,35]。DC-STAMP和ATPV0D2参与和信息融合的过程36,37]。巨噬细胞细胞的融合进异物巨细胞完全废除DC-STAMP-deficient老鼠(38]。此外,击倒CTSK报道抑制破骨细胞的成熟(10]。相对的减少破骨细胞标记基因的表达,包括CTSK DC-STAMP, ATP6V0D2, c-Fos, NFATc1,演示了一个抑制作用的aucubin preosteoclasts为破骨细胞的分化。上述结果表明,aucubin促进H型血管血管生成通过抑制破骨细胞融合产生更多PDGF-BB。

后确认aucubin抑制破骨细胞融合促进H型血管血管生成,然后探讨了机制aucubin抑制preosteoclast融合。在这个研究中,我们发现aucubin抑制MAPK信号通路的激活。MAPK和NF -κ在Rankl-induced破骨细胞分化[B信号通路是至关重要的39]。Rankl政府后,激活MAPK的家庭,即p38,物,和兵,增加。ERK信号参与生存、增殖,破骨细胞的分化40]。来源于巨噬细胞的骨孤立,缺乏JNK1显示减少破骨细胞分化活动(41]。激活p38直接刺激NFATc1提高破骨细胞的分化42]。同时,aucubin发现抑制IKB的磷酸化和退化α在目前的研究中,NF -的一个重要组成部分κB信号通路和抑制p65核易位p65绑定。如果染色结果也表明aucubin抑制Rankl-induced p65信号通路的活性。最近,PDGF-B启动子区域被确认含有NF -κB绑定域(43]。因此,减少p65 PDGF-BB直接抑制核转录的激活。综上所述,我们得出这样的结论:aucubin可能增强preosteoclast PDGF-BB-induced血管生成抑制MAPK / NF -κB信号并最终促进骨生成,防止OVX引起的骨质疏松。

5。结论

总之,我们的研究表明,aucubin能够抑制多核破骨细胞的成熟,促进OVX小鼠H型血管的形成。底层机制可能是aucubin增加preosteoclast和随后PDGF-BB-induced血管生成抑制MAPK / NF -κB信号。所有的发现表明aucubin可能anti-bone-loss的候选药物,需要进一步的研究。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

彭雪和刘该矿设计研究;刘章子怡李、刘Chang和小李进行大部分的实验中,生成的数据,和起草的手稿;Na王,刘高,自汉代包帮助收集样品;彭雪和该矿刘指导实验和校对的手稿。章子怡李、刘Chang和小李刘贡献同样这项工作。

确认

这项工作是由政府支持的基金会杰出的医务人员河北(361005号),河北省的主要研发项目(22377761 d),河北省的返回海外人员程序(没有。C20220509),河北省的医学科学研究项目(20221156)。