文摘gydF4y2Ba

自体脂肪移植近年来已广泛应用于整形手术,但不稳定保留脂肪移植一直是一个重要的临床问题。脂肪组织缺血可怜的宽容,所以移植脂肪组织需要重建血液供应在早期为了生存稳定。我们之前的研究发现,人类包皮成纤维细胞比较外来体(HFF-Exo),人类脂肪干细胞外来体(hADSC-Exo)可以显著提高血管内皮细胞的增殖和人工真皮preconstructed皮瓣的血管生成的影响。因此,hADSC-Exo的能力来保持脂肪移植及其潜在再生机制引起了我们的强烈兴趣。在这项研究中,我们应用hADSC-Exo HFF-Exo脂肪移植和探索潜在的再生机制,通过各种方式如生物信息学、免疫荧光、免疫组织化学和脂肪形成的分化。结果表明,hADSC-Exo可以显著促进移植血管生成和脂肪形成的差异化的ADSC提高保留脂肪移植,可能下调Wnt /gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白信号通路促进脂肪形成的分化。总之,我们的研究结果提供了一个理论依据hADSC-Exo脂肪移植的临床翻译。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

自体脂肪移植在整形手术被广泛用于各种治疗方法,如抑郁的疤痕,半面萎缩,和面部复兴,由于其良好的生物相容性,组织排斥率低,过敏反应率(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。然而,不稳定的保持脂肪移植一直是一个关键的临床问题需要克服。脂肪组织缺血可怜的宽容,抽脂的破坏将导致原始的血液供应,和移植脂肪组织需要重建血液供应在早期为了生存稳定(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba]。Yoshimura et al。gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]发现,移植脂肪大多只在外围区域显示血液重建,而中部地区显示脂肪坏死和吸收由于血液供应不足和嫁接组织体积减少。因此,加强血液脂肪移植的早期重建对促进移植物生存的关键因素之一。gydF4y2Ba

脂肪干细胞(ADSC)是一种干细胞来源于脂肪组织与多向分化潜能,在再生医学领域的广泛应用,近年来由于其容易提取和扩张和强烈的组织修复活动(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。大量研究[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)表明,cotransplantation ADSC的自体脂肪组织,有能力的旁分泌各种细胞因子的分泌促进早期血管化,极大地提高了脂肪移植的存活率。有趣的是,我们之前的研究(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba发现ADSC可以分化成血管内皮细胞,增强血管内皮细胞的增殖和迁移,促进慢性伤口的愈合。然而,ADSC的致瘤性和细胞产品的储存和运输仍然是有争议的,有一个缺乏统一标准的应用ADSC产品(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。因此,ADSC没有临床大规模应用的条件。gydF4y2Ba

液类由细胞分泌到细胞外基质,可以携带各种各样的生物成分如蛋白质、脂质、非编码rna可以运送到特定靶细胞或绑定到细胞表面调解细胞间通信(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。ADSC-derived外来体(ADSC-Exo)已经被用于缺血性损伤疾病和显示类似于ADSC的血管再生效果较好,并没有肿瘤形成的风险的优势,高稳定性,方便储存和运输,使其更有前途比ADSC-based细胞疗法临床应用(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在我们之前的研究gydF4y2Ba14gydF4y2Ba),hADSC-Exo显著促进血管内皮细胞的增殖和血管生成的影响人工真皮preconstructed襟翼人包皮成纤维细胞相比,外来体(HFF-Exo)。因此,hADSC-Exo的能力来保持脂肪移植及其潜在再生机制引起了我们的强烈兴趣。gydF4y2Ba

所以我们应用hADSC-Exo和HFF-Exo脂肪移植在这项研究中,发现hADSC-Exo能够显著的移植血管再生和脂肪形成的差异化ADSC改善脂肪移植的保留。与此同时,生物信息学技术被用来探索hADSC-Exo的潜在机制,促进干细胞的分化脂肪形成的。gydF4y2Ba

2。材料和方法gydF4y2Ba

2.1。识别hADSCgydF4y2Ba

第四段hADSC被选为流式细胞术分析表型hADSC表面标记的识别。CD90和CD34(美国BD生物科学,圣何塞,CA)被用于流式细胞术分析。我们先前报道的染色步骤(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

2.2。隔离外来体gydF4y2Ba

人类脂肪干细胞(hADSC)通道3 - 6和人类包皮成纤维细胞(高频电炉)与3 - 6通道培养获取hADSC-Exo HFF-Exo。hADSC和高频电炉是培养在低糖和high-glucose DMEM(美国犹他州HyClone),分别补充exosome-free 10%胎牛血清(的边后卫)(美国大岛屿Gibco)和孵化公司为5%gydF4y2Ba_2gydF4y2Ba在37°C。液分离得到hADSC微分超速离心法和高频电炉培养基(如前所述)(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba]。总之,微分超速离心法在300×gydF4y2BaggydF4y2Ba和2000×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,其次是10000×gydF4y2BaggydF4y2Ba30分钟,其次是100000×g 70分钟两次都在4°C。100年外来体丸终于resuspendedgydF4y2BaμgydF4y2BaL(磷酸盐(PBS)和过滤0.22无菌过滤器在使用前。gydF4y2Ba

2.3。验证的外来体gydF4y2Ba

2.3.1。透射电子显微镜(TEM)gydF4y2Ba

液是由透射电镜成像识别他们的形态。20卷的外来体样本gydF4y2BaμgydF4y2BaL制备铜网和下降10 min,沾染了20gydF4y2BaμgydF4y2BaL 3%的磷钨酸钠溶液为5分钟。然后,铜网是在室温下干燥30分钟。最后,样品由TEM检测。gydF4y2Ba

2.3.2。纳米粒子跟踪分析(NTA)gydF4y2Ba

粒度分布的液被NTA (ZetaView、粒子矩阵、德国)。的外来体样品稀释到适当的浓度用PBS和NTA检测。gydF4y2Ba

2.3.3。西方墨点法gydF4y2Ba

西方墨点法指令是前面描述的gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。总之,从每个样本的蛋白质提取和转移到PVDF膜(细胞信号技术、马、美国)。膜最初阻塞在5%的牛血清白蛋白2 h,然后孵化主要CD63 (Abcam 1: 2000年,马剑桥,英国),研究(细胞信号技术1:1000年,美国),gydF4y2BaαgydF4y2Ba微管蛋白(1:1000,细胞信号技术,妈,美国),VEGF-A抗体(Abcam 1: 1000年,剑桥,英国),和gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白(细胞信号技术1:1000年,美国)在4°C一夜之间,然后孵化与适当的辣根peroxidase-conjugated二级抗体(Beyotime 1: 3000年,中国)。阿尔法成像仪扫描(美国热费希尔科学Tecan)被用来可视化化学发光的蛋白表达。gydF4y2Ba

2.4。脂肪移植体内gydF4y2Ba

总共9个裸体小鼠(6周大,男)购买的海军军医大学实验动物中心(上海,中国)。所有实验都通过动物健康科学的指导方针政策和福利委员会海军军医大学。gydF4y2Ba

从人体皮下脂肪组织移植脂肪样本从腹部抽脂术获得健康女性的长海医院隶属于美国海军军医大学和获得病人的知情同意。脂肪组织(0.5毫升)添加hADSC-Exo或HFF-Exo (100gydF4y2BaμgydF4y2Bag)皮下注射是在两个收件人网站背表面。观察移植脂肪在1、2、和术后3个月。生存脂肪的重量和体积进行了评估。gydF4y2Ba

2.5。免疫组织化学和免疫荧光gydF4y2Ba

脂肪组织切除在1、2和3个月后注入和组织学染色分析。移植的脂肪组织与4%聚亚甲基甲醛固定石蜡和嵌入。苏木精和伊红用于组织学观察的内在结构移植脂肪(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。移植脂肪血管生成和增殖细胞CD31观察到gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba(1:50,Abcam,英国)和Ki67 (Abcam 1: 500年,英国)免疫组织化学染色,分别。脂肪细胞分化被PPAR观察gydF4y2BaγgydF4y2BaAbcam(1: 250年,英国)免疫荧光染色。免疫组织化学和免疫荧光检测进行报道之前(gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。免疫组织化学显微照片下得到Pannoramic桌子(3 d HISTECH、匈牙利)和可视化Pannoramic扫描仪,和免疫荧光显微照片了蔡司荧光显微镜(HLA100、上海、中国)。gydF4y2Ba

2.6。细胞增殖实验gydF4y2Ba

细胞增殖率进行了测试使用细胞计数Kit-8 (CCK-8)试验(Beyotime、江苏、中国)和5-ethynyl-2脱氧尿苷(EdU)试验设备(RiboBio,广州,中国)。HUVECs(2000细胞/)被播种在96孔板和孵化与不同浓度的hADSC-Exo(50, 100年或200年gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL)或同等数量的PBS。分析了细胞增殖在24 h,治疗后48小时,72 h。一个10gydF4y2BaμgydF4y2BaL CCK8试剂添加到每个好,这些细胞被孵化2 h在每个时间点。然后,OD值验证了一个微型板块阅读器(美国热科学Tecan)在450海里。三个独立的实验。根据CCK8数据,我们确定一个合适的hADSC-Exo后续实验浓度。gydF4y2Ba

一个EdU分析工具进行比较对HUVEC增殖效果hADSC-Exo和HFF-Exo。HUVECs (gydF4y2Ba 细胞/)被播种在96孔板培养confluency -80%达到70%。然后,HUVECs与合适的hADSC-Exo cocultured浓度和相同浓度的HFF-Exo 72 h,和一个EdU试验根据制造商的指示执行gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。增殖HUVECs沾着绿色荧光,细胞核都沾着蓝色荧光,与蔡司荧光显微镜观察。gydF4y2Ba

2.7。细胞迁移试验gydF4y2Ba

Transwell化验进行比较hADSC-Exo迁移效应和对HUVEC HFF-Exo。HUVECs (gydF4y2Ba 细胞,200gydF4y2BaμgydF4y2BaL) resuspended FBS-free中、添加到Transwell插入、和添加exosome-free中含有5%的边后卫和hADSC-Exo / HFF-Exo (800gydF4y2BaμgydF4y2BaL)。文化18 h后,HUVECs固定和沾0.1%结晶紫,和没有穿过膜的细胞被仔细擦拭去除和成像。迁移细胞测量利用ImageJ软件(美国马里兰州贝塞斯达)。gydF4y2Ba

2.8。脂肪形成的差异化分析gydF4y2Ba

hADSCs (gydF4y2Ba 细胞)被播种12-well板块和培养介质中含5% exosome-free的边后卫添加hADSC-Exo或HFF-Exo直到他们confluency 70 - 80%。然后,细胞与脂肪形成的分化培养基培养(Cyagen、广州、中国)为4周(制造商的指示gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。然后,细胞被固定和沾油红o染色细胞与PBS洗掉多余的染料和成像。gydF4y2Ba

2.9。微分分析关于脂肪形成的分化的基因表达gydF4y2Ba

的基因表达微阵列数据集hADSC在体外脂肪形成的分化(GSE61302),由hADSC样本7天去(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba21天去(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba和未分化(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba从基因表达综合下载(GEO)数据库(gydF4y2Bahttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/geogydF4y2Ba)。数据集是基于GPL570平台(人类基因组U133 Affymetrix + 2.0数组),21天的mRNA表达数据脂肪形成的差异化hADSC和未分化的控制已经下载并用于这项研究。基因表达的差别分析晚期adipogenic-differentiated hADSCs相比,使用GEO2R分析工具执行的未分化细胞。一个信使核糖核酸gydF4y2Ba值< 0.05和日志FC值大于±1被定义为一个度,列表的调节和表达下调度是为随后的分析整理。gydF4y2Ba

2.10。集成分析液导致脂肪形成的分化gydF4y2Ba

潜在的调节和表达下调目标选择度,和蛋白质相互作用与字符串(PPI)分析了网络数据库(gydF4y2Bahttps://stringgydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Bahttp://db.org/gydF4y2Ba)。中心基因在PPI网络使用程度分析方法计算的CytoHubba插件,和可视化Cytoscape(3.9.0版)软件(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。大卫数据库(gydF4y2Bahttps://david.ncifcrf.gov/home.jspgydF4y2Ba)被用来理解基因的生物学功能,包括基因本体论(去)和《京都议定书》百科全书的基因和基因组(KEGG)通路富集gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。去注释分析组成的分子功能(MF)、生物过程(BP)和电池组件(CC)。gydF4y2Ba

2.11。统计分析gydF4y2Ba

使用SPSS 26.0统计分析和描述gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba学生的gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba测试是用来检查统计学意义,gydF4y2Ba值< 0.05被认为是显著的。gydF4y2Ba

3所示。结果gydF4y2Ba

3.1。描述hADSC和液gydF4y2Ba

评估的表面标记表型hADSC,流式细胞术分析用来确定纯化hADSC。大约有99%的hADSCs CD90阳性,但不利于CD34(图gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba),这表明ADSC培养细胞。外来体是一种膜性囊泡直径约30 - 150海里提取通过各种方法包括超速离心法、排除超滤,密度梯度离心法,粒度分离,聚合物沉淀,immunoaffinity [gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。在这项研究中,确定液是由TEM, NTA和免疫印迹。TEM的典型形态液(图确认gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba),NTA表明hADSC-Exo的平均直径gydF4y2Ba 纳米和HFF-ExogydF4y2Ba 纳米(图gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)。此外,特定的膜蛋白标记CD63和研究也两液(图中高度表达gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba)。这些结果都与液的特点一致。gydF4y2Ba

3.2。通过Proangiogenic hADSC-Exo和Prolipogenetic效果提高体内脂肪移植物的生存gydF4y2Ba

评估hADSC-Exo保留有益的脂肪移植,裸体小鼠作为脂肪移植模型(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba)。移植收获1,2,3个月后脂肪移植。脂肪的一般观察标本在三个时间点显示hADSC-Exo最好保留效率比HFF-Exo(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。然后,移植的重量和体积测量,发现移植的大小与移植时间减少,但比HFF-Exo hADSC-Exo最好量化结果(数据gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba2 (h)gydF4y2Ba),表示一个优秀的hADSC-Exo对移植脂肪生存的影响。gydF4y2Ba

hADSC-Exo微观评估效果的促进脂肪移植,保留他染色结果(数据gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)表明,移植的脂肪从hADSC-Exo组有更高的脂肪数量和更完整的脂肪形态结构相比HFF-Exo组。血管再生的程度和增殖细胞的数量也很重要指标来评估脂肪移植的保留。CD31gydF4y2Ba^+gydF4y2Ba和Ki67进行免疫组织化学染色,观察到的数量CD31-positive血管和Ki67-positive hADSC-Exo增殖细胞组明显高于HFF-Exo集团(数据gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。Proangiogenic hADSC-Exo体外的效果gydF4y2Ba

检查proangiogenic hADSC-Exo容量和HFF-Exo HUVEC增殖和迁移进行了分析。我们首先研究了使用CCK8 hADSC-Exo对HUVEC增殖的影响细胞增殖试验来确定液的最佳浓度为后续实验。结果表明,100年gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/毫升hADSC-Exo对HUVEC增殖的影响最重要的推广,这促进效果坚持增加文化时间(图gydF4y2Ba4(一)gydF4y2Ba)。因此,我们使用100年gydF4y2BaμgydF4y2Bag / mL hADSC-Exo浓度和HFF-Exo后续实验。EdU扩散分析和Transwell被用来分析评估两种液对HUVEC增殖和迁移的影响,分别。值得注意的是,hADSC-Exo能够更有效地促进HUVEC增殖和迁移比HFF-Exo(数字gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4 (g)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

VEGFA最初是一个内皮生长因子和血管通透性的监管机构gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),并在各种条件下与血管生成密切相关,包括肿瘤和创伤gydF4y2Ba21gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]。因此,VEGFA蛋白表达的评估,发现hADSC-Exo组表现出更高程度的表达式(数据gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba)。我们的发现表明,hADSC-Exo显著促进血管生成脂肪移植。gydF4y2Ba

3.4。识别关键目标基因hADSC-Exo脂肪生成gydF4y2Ba

在观察hADSC-Exo集团高级脂肪数量和结构完整性,hADSC-Exo能否促进脂肪组织的脂肪形成的分化的原始ADSC已经引起了我们的强烈兴趣。因此,我们执行PPAR的免疫荧光染色gydF4y2BaγgydF4y2Ba脂肪移植观察脂肪形成的分化的状态。结果表明,PPAR hADSC-Exo组明显重要gydF4y2BaγgydF4y2Ba表达式相比HFF-Exo组(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba5(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

探索ADSC的脂肪生成的分化的潜在机制,GSE61302表达式分析数据从GEO数据库下载,和1970度是由未分化的人类之间的微分分析确定主要ADSCs和成熟脂肪细胞(数字gydF4y2Ba5 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。排名前十的调节和表达下调度选择和列在表gydF4y2Ba1gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,分别。结合我们之前microrna的测序数据hADSC-Exo HFF-Exo,总共有605度可能的目标hADSC-Exo ADSC的脂肪形成的分化过程中(图gydF4y2Ba5 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.5。全面的关键基因的功能分析hADSC-Exo的目标gydF4y2Ba

PPI网络是重要的理解biosignal的机制和功能在特定生理条件下蛋白质之间的联系。在这项研究中,PPI网络分析是通过字符串数据库上执行605年的关键基因。随后,最高的中心基因获得的第一个20节点度算法(表程度gydF4y2Ba3gydF4y2Ba(图)和Cytoscape可视化软件gydF4y2Ba5 (e)gydF4y2Ba)。关于这些中心基因,CTNNB1 AURKA,安全系数,MKI67和VWF五大中心的基因。gydF4y2Ba

此外,注释和KEGG途径进行了分析,进一步揭示了浓缩状态度的BP, MF, CC,和KEGG通路通过大卫数据库。关于“生物过程”类别(图gydF4y2Ba5 (f)gydF4y2Ba),它是证明大部分度主要是参与组织细胞外基质,细胞粘附,I型干扰素信号通路。CC(图gydF4y2Ba5 (g)gydF4y2Ba),大多数的度是质膜的主要成分,蛋白质的细胞外基质,质膜的有机组成部分,costamere。MF(图gydF4y2Ba5 (h)gydF4y2Ba),度主要是参与氨基酸的跨膜转运活动,细胞外基质的结构组成部分,L-amino酸跨膜转运活动,和蛋白质绑定。然后,KEGG通路分析有助于研究途径和关键基因(图的函数gydF4y2Ba6(一)gydF4y2Ba),这主要是大大丰富ECM-receptor相互作用的信号通路,粘着斑和Rap1信号通路。gydF4y2Ba

进一步增加我们理解下的通路相互作用研究中,我们发现有趣和突出社区的途径之间的直接连接(集群)的基于图论的路径通过生物信息学方法和边介数聚类算法gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。Wnt信号通路被确认根据KEGG库高度连接通路相关信息附着力(adherens结),cell-ECM附着力(粘着斑),和Rap1 prosurvival通路,MAPK和PI3K-AKT。(图gydF4y2Ba6 (b)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.6。hADSC-Exo促进脂肪形成的ADSC的分化脂肪移植gydF4y2Ba

细胞分化分析被用来进一步验证的具体影响hADSC-Exo导致脂肪形成的分化和保存显示ADSCs的脂肪形成的分化能力和更好的推广hADSCs-Exo组相比HFF-Exo组(图gydF4y2Ba6 (c)gydF4y2Ba)。结果表明,hADSCs-Exo可以维护和提升ADSCs的脂肪形成的分化能力。gydF4y2Ba

Wnt /gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白通路,主要监管途径脂肪形成的差异化,也发现脂肪移植。表达水平的gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白显著降低在hADSCs-Exo相比HFF-Exo集团(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(数据gydF4y2Ba6 (d)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba6 (e)gydF4y2Ba)。结果表明,hADSC-Exo可能调节Wnt /gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白脂肪移植途径改善脂肪形成。gydF4y2Ba

4所示。讨论gydF4y2Ba

脂肪组织缺血性环境特别敏感,容易坏死和凋亡的地方(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。脂肪移植后移植物生存必须重建其血液供应。不幸的是,大多数脂肪移植坏死、液化和再吸收由于重建血液供应的困难gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。因此,早期血管再生的脂肪移植是提升为一个重要的策略来改善脂肪移植物的生存。gydF4y2Ba

干细胞治疗在促进血管化具有较高的应用价值,但促进肿瘤形成的风险,并转换技术的难度大大限制其临床应用(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。因此,寻找关键活性成分,可以直接使用替代干细胞和血管生成的影响可以减少上述潜在的问题。积累的证据表明,液来自干细胞的治疗潜力巨大组织损伤,感染,和缺血性疾病(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。与此同时,干细胞的应用外来体是免费的副作用,如恶性肿瘤,血管阻塞的风险,和免疫原性,表明干细胞exosome-based再生疗法是安全的,有应用前景gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。以前的研究已经表明hADSC-Exo通过原形成层的再生修复组织缺血性疾病,和我们以前的工作也发现hADSC-Exo可以显著促进人工预制真皮皮瓣的血管生成(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。然而,hADSC-Exo能否提高脂肪移植物存活率通过促进脂肪移植血管生成和其潜在的机制还不清楚。gydF4y2Ba

澄清的效果hADSC-Exo脂肪移植保留,hADSC-Exo和HFF-Exo cotransplanted与脂肪移植皮肤下裸体小鼠的研究和观察,hADSC-Exo保留率比HFF-Exo(图gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。有趣的是,我们观察到脂肪移植的重量和体积逐渐减少在两组随着时间的推移,这可能归因于脂肪移植的发展,主要包括囊肿、钙化,结节,脂肪坏死、纤维化和生存,最终稳定(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。此外,脂肪脂肪移植的数量和完整性hADSC-Exo组明显高于HFF-Exo组(数字gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba)。然后,CD31 +和Ki67免疫组织化学被用来观察移植物血管化程度和增殖细胞的数量和显示hADSC-Exo集团最好的血管化和增殖细胞数相比HFF-Exo组。值得注意的是,hADSC-Exo也能够促进HUVEC体外的增殖和迁移,以及蛋白表达程度VEGFA也更重要的脂肪移植hADSC-Exo组,这表明hADSC-Exo可以促进脂肪移植的新血管形成,表明hADSC-Exo可以提高保留通过促进移植物血管化。gydF4y2Ba

脂肪组织富含ADSC,抗缺血和缺氧早期脂肪移植相比,成熟的脂肪细胞,血管内皮细胞,以及其他和血液细胞(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba],能够再生脂肪组织通过脂肪形成,血管生成,和旁分泌作用[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba]。在这项研究中,我们观察到更好的脂肪保留和脂肪hADSC-Exo组的完整性,hADSC-Exo的能力促进ADSC的脂肪形成的差异化,从而补充脂肪移植,引起了我们的兴趣。过氧物酶体proliferator-activated受体(PPARγgydF4y2BaγgydF4y2Ba),脂肪形成的主要监管机构,在脂肪细胞分化中起着主导作用,作为一个在成熟的脂肪细胞中表达的转录因子gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]。众多研究表明,脂肪细胞没有PPAR显然不能形成gydF4y2BaγgydF4y2Ba(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba41gydF4y2Ba]。因此,我们观察到的PPAR的免疫荧光染色结果gydF4y2BaγgydF4y2Ba两组脂肪移植,并暗示hADSC-Exo可以显著促进脂肪移植的脂肪细胞的形成。事实上,脂肪干细胞的活化再生地区促进脂肪细胞的生存(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。然而,hADSC-Exo的潜在机制促进脂肪形成的差异化的ADSC尚未明确。gydF4y2Ba

我们假设hADSC-Exo目标关键基因调节pro-ADSC脂肪生成的分化通过其丰富microrna。澄清的潜在机制、基因表达微阵列数据集的hADSC体外脂肪形成的分化(GSE61302)从GEO数据库下载在我们的研究中,和1970度是由未分化的人类之间的微分分析确定主要ADSCs和成熟的脂肪细胞。与此同时,我们先前的研究发现共有43 DE-miRNAs hADSC-Exo和HFF-Exo之间。随后,我们做了一个十字路口DE-miRNAs预测的目标基因和度之间基本上确定关键度,可能会影响到hADSC-Exo ADSC的脂肪形成的分化过程。然后,我们在去探索这些基因的生物功能通过注释和KEGG通路富集分析。有趣的是,这些关键基因与细胞外基质的生物过程直接相关的组织和主要参与的信号通路ECM-receptor交互,粘着斑和Rap1信号通路。ECM是一个多功能网络,包括各种蛋白,蛋白聚糖、葡糖氨基葡聚糖,通过相互之间的交互调节干细胞分化细胞和ECM组件(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba44gydF4y2Ba]。preadipocytes成熟脂肪细胞的发展是伴随着ECM的重塑和具体变化过程中去(gydF4y2Ba45gydF4y2Ba]。Yeung et al。gydF4y2Ba46gydF4y2Ba]发现Rap1信号通路的失活可以促进脂肪细胞的分化。gydF4y2Ba

中心基因高PPI网络中节点度的基因也可能扮演重要的角色在脂肪形成的差异化的发展。通过分析节点的度算法在PPI网络几个基因中心高度。值得注意的是,CTNNB1,最大的程度的基因网络编码β-连环蛋白1蛋白质和Wnt信号调控的重要元素,与钙粘蛋白和肌动蛋白细胞骨架调节信息粘附[gydF4y2Ba47gydF4y2Ba]。先前的研究表明,激活Wnt /gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白信号可以抑制脂肪形成的分化(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba]。此外,雷焦等人发现WNT5a压抑的PPARgydF4y2BaγgydF4y2Ba通过激活表达和脂肪生成gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白信号(gydF4y2Ba50gydF4y2Ba]。众多研究表明,PPAR的激活gydF4y2BaγgydF4y2Ba与减少gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白水平(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba]。坚持,我们的差别研究发现对这些gydF4y2BaβgydF4y2Ba连环蛋白表达和PPAR upregulationgydF4y2BaγgydF4y2Ba在hADSC-Exo cotransplanted脂肪移植。最后,图聚类的方法被用来扩大途径之间的关系,证实了我们的调查证明Wnt信号通路途径参与高度连接信息附着力()粘合连接处并且cell-ECM附着力(粘着斑),也被连接到prosurvival Rap1通路,MAPK和PI3K-AKT。我们的研究结果提供了新的见解的分子机制的作用ADSC-Exo生存的脂肪移植(图gydF4y2Ba6 (f)gydF4y2Ba)。然而,在我们的研究中也有一定的限制。例如,不涉及具体的microrna hADSC-Exo从事这个途径;因此,针对机制还不够强劲。然后,我们将使用单细胞测序技术比较细胞和分子组件参与再生脂肪移植,以进一步探讨脂肪移植物的生存机制。gydF4y2Ba

5。结论gydF4y2Ba

总之,我们的研究表明,hADSC-Exo促进脂肪移植的血管生成和维护ADSC的脂肪形成的差异化能力,促进脂肪移植的保留和提供了一个理论依据hADSC-Exo脂肪移植的临床翻译。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

下一代测序数据用于支持本研究的发现是由王Yuchong许可制,所以不能免费提供。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者宣称没有利益存在竞争。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

可馨陈Jiachao Xiong,和沙徐了同样的工作。可馨陈和Jiachao熊设计,进行实验,分析数据,并写了手稿。沙徐和Minliang吴进行实验。:雪和川Lv编辑的手稿。Yuchong王、吴Minjuan构思,设计实验,检查/编辑稿件。和所有作者批准了最终版本的手稿。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

这项研究是由国家重点研究和开发中国干细胞与转化研究计划重点项目(批准号2018 yfa0108301),上海市卫生和计划生育委员会临床研究项目(20184 y0113)和中国国家自然科学基金(批准号81871578)。gydF4y2Ba