文摘gydF4y2Ba

在脂肪组织细胞功能异常负责一些与肥胖相关的代谢疾病。脂肪细胞形成的过程是理解基本理解这些疾病。脂肪细胞分化的脂肪干细胞/基质细胞(ADSCs)显示减少的mRNA水平白介素21受体(IL21R)在这个过程中。尽管受体与代谢疾病有关,却很少有研究干细胞的功能。在这项研究中,我们使用共聚焦免疫荧光化验确定IL21R colocalizes与线粒体蛋白质ATP5B ALDH4A1,人类ADSCs的细胞核。我们证明了沉默和超表达IL21R并不影响细胞增殖和线粒体ADSCs活动。然而,IL21R沉默并减少ADSC脂肪形成的能力。还需要进一步的研究来理解IL21R之间所涉及的机制和脂肪形成的分化过程。gydF4y2Ba

1。介绍gydF4y2Ba

脂肪干细胞/基质细胞(ADSCs)被认为是适合应用于再生疗法有几个原因,包括他们的易用性和效率可以提取,处理,和扩展gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]。此外,他们是一个研究模型来理解细胞分化的机制。这个过程是由特定的生理条件,影响干细胞执行特征功能和集成专业组织(gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。脂肪细胞是成熟的细胞构成的脂肪组织,形成脂肪形成,一个复杂的和调整过程(看过的gydF4y2Ba3gydF4y2Ba])。脂肪生成使用preadipocyte模型已经被广泛地研究过了gydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba为了更好地理解他们的特点在脂肪组织健康(看过的gydF4y2Ba4gydF4y2Ba])。gydF4y2Ba

不同的研究调查了细胞分化过程通过使用大规模的RNA序列在人类ADSCs[脂肪形成的gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。我们之前证明白介素21受体的数量(IL21R)与多核糖体减少在脂肪形成的早期分化相关的信使rna (gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。另一项研究发现,IL21R mRNA的数量减少的polysomal分数ADSCs刺猬信号通路的激活和增加当后者堵住了gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。IL21R是一种跨膜糖蛋白分子质量的大约60 kDa,这是群类型的一部分我白介素受体。其与一个共同的γ链(CD132)形式复杂heterodimeric受体(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。白介素21与IL21R(受体)和能传感信号进入细胞通过蛋白质JAK1 JAK3, STAT1,和STAT3主要参与者JAK-STAT信号通路(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

IL21R表达B淋巴细胞等免疫细胞的细胞,T淋巴细胞,自然杀手(NK)、巨噬细胞和树突细胞(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。在体外实验中表明IL21扮演了一个角色在NK细胞的增殖和成熟人群从骨髓成熟b细胞的增殖人口costimulated anti-CD40,和T细胞的增殖与anti-CD3 costimulated [gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。IL21也被发现在一些肿瘤细胞系,肠道上皮细胞受炎性疾病,胃上皮细胞在感染gydF4y2Ba幽门螺杆菌gydF4y2Ba和风湿性关节炎滑膜gydF4y2Ba17gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba]。实验用动物模型还显示,IL21R-deficient小鼠抗体生产和减少细胞毒性T淋巴细胞反应的失败(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。IL21R成熟脂肪细胞也表达了和被证明调节脂类分解(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。此外,IL21R和IL21在扩散中发挥作用,乳腺癌细胞迁移和入侵(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。然而,人类ADSCs IL21R的作用知之甚少。因此,我们的研究目的是研究蛋白质定位ADSCs和探索的作用在这些细胞IL21R沉默和overexpressing它。此外,我们寻求评估可能改变细胞增殖,线粒体活动,和脂肪生成。gydF4y2Ba

2。方法gydF4y2Ba

2.1。隔离、文化和脂肪中提取干细胞的分化gydF4y2Ba

合作的核心细胞技术(PUCPR),我们孤立的,讲究的,脂肪中提取干细胞特征(ADSCs)皮下脂肪组织通过吸脂的腹部(详细描述,请参见[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba])。一般信息关于性别、年龄、身高和体重的捐助者提供补充表gydF4y2BaS1gydF4y2Ba。组织捐赠者的同意下得到指南涉及人体受试者的研究和伦理委员会批准of Fundacao Oswaldo Cruz,巴西(研究设计院:48374715.8.0000.5248)。所有的测试进行细胞培养在通道3 - 5。gydF4y2Ba

2.2。免疫荧光gydF4y2Ba

ADSCs镀在无菌玻璃盖玻片在24-well板块共焦显微镜(徕卡SP5共焦显微镜)可视化和96孔板进行分析的轻歌剧CLS含量高成像系统(PerkinElmer®,沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)。细胞被洗了三次磷酸盐(PBS) 37°C 5分钟和固定在甲醇(默克公司)-20°C 10分钟。细胞培养与PBS / 0.5% Triton在室温下为透化作用30分钟。我们使用1% PBS / BSA作为屏蔽解决方案1小时。主要的抗体anti-IL21R 1: 25 (10533 - i - ap, ProteinTech) anti-ATP5B 1: 25 (sc - 55597,圣克鲁斯生物技术)和anti-ALDH4A1 1: 50 (sc - 398911,圣克鲁斯生物技术)在一夜之间,PBS / BSA 1%被孵化稀释4°C。我们进行了孵化与二次抗体Alexa萤石488(σ)或Alexa萤石546(σ)1:400一小时在室温和保护。我们用DAPI 1gydF4y2BaμgydF4y2Ba克/gydF4y2BaμgydF4y2BaL细胞核染色在PBS稀释了五分钟。gydF4y2Ba

2.3。过度的IL21RgydF4y2Ba

过度使用执行GenEZ ORF的克隆IL21R (NM_021798)由pcDNA3.1 + / C - (K) -DYK向量(GenScript)。转染3000年使用Lipofectamine 6-well板块进行试剂(英杰公司)提供质粒DNA ADSCs遵循制造商的协议。最后的五浓度gydF4y2BaμgydF4y2Ba3.75 g的DNAgydF4y2BaμgydF4y2BaL 3000年Lipofectamine试剂,10gydF4y2BaμgydF4y2BaL的P3000 2毫升的媒体。负控制克隆,截断IL21R使用克隆。获得截断质粒,限制限制性内切酶消化制造商的协议HindIII(新英格兰生物学实验室)之后。HindIII消化产生的截断版本删除在IL21R核苷酸1到457 cd、消除细胞外部分的氨基酸序列包含N-glycosylation和二硫键的网站。gydF4y2Ba

2.4。短干扰RNA化验gydF4y2Ba

三个独特的27 mer siRNA工器IL21R (Origene-SR323990)被稀释20倍gydF4y2BaμgydF4y2Ba米以下制造商的指示。Trilencer-27普遍炒小干扰rna双负控制(SR30004)用作压制负面的控制实验,也称为“争夺。“转染中执行6-well板使用10 nM IL21R siRNA或争夺siRNA和5gydF4y2BaμgydF4y2BaL Lipofectamine 3000试剂(表达载体)制造商的协议。posttransfection 24小时后,信使rna和蛋白质测定qPCR和免疫印迹。gydF4y2Ba

2.5。反向Transcription-Quantitative聚合酶链反应(RT-qPCR)gydF4y2Ba

执行总RNA提取使用RNeasy迷你包(试剂盒)。约1gydF4y2BaμgydF4y2Bag的RNA被用来合成cDNA使用Improm-II工具包(Promega)根据制造商的指示。特定基因的相对表达被RT-qPCR评估使用LightCycler®96仪器(罗氏)和SYBR选择主混合(生命科学)。样本在95°C的环境为30秒,紧随其后的是35周期60°C 30秒和72°C,持续30秒。然后融化过程由孵化在72°C 10分钟。本研究中使用的引物序列F5gydF4y2Batcctggaaatgtggaacctcc3gydF4y2Ba和R5gydF4y2Batggcctcgtccttcagct3gydF4y2Ba为gydF4y2BaIL21RgydF4y2Ba;F5gydF4y2Bagaggactgagcatcgagca3gydF4y2Ba和R5gydF4y2Bacatgtgatctgacaccctgaa3gydF4y2Ba为gydF4y2BaSTAT3gydF4y2Ba;gydF4y2BaFgydF4y2Ba5gydF4y2Baggcgatgctggcgctgagtac3gydF4y2Ba和R5gydF4y2Batggttcacacccatgacga3gydF4y2Ba为gydF4y2BaGAPDHgydF4y2Ba和F5gydF4y2Bataccacgtcatctcctttgatggct3gydF4y2Ba和R5gydF4y2Bagtgcggctgcttccataa3gydF4y2Ba为gydF4y2BaPOLR2AgydF4y2Ba。RT-qPCR实验进行了一式三份。的gydF4y2Ba每个基因结果归一化基于GAPDH或POLR2A表达式,计算每个基因的相对表达。gydF4y2Ba

2.6。西方墨点法gydF4y2Ba

这些细胞被收获和离心机在700 xgydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟在4°C。上层清液被免职,颗粒是治疗变性缓冲区(160 mM Tris-HCl pH值6.8,4% SDS, b-mercaptoethanol 10%, 24%甘油24%和0.02%溴酚蓝)。溶菌产物分离13%钠十二烷基sulfate-polyacrylamide凝胶电泳(sds - page)和转移到硝化纤维膜。兔子anti-IL21R抗体(1:200;Proteintech)、兔anti-GAPDH抗体(1:1000;细胞信号),IRDye®800 cw山羊anti-Rabbit免疫球蛋白二次抗体(1:10000)被用作二次抗体。LI-COR奥德赛的红外信号被捕获设备。ImageJ软件(gydF4y2Bahttps://imagej.nih.gov/ij/gydF4y2Ba)是用于定量分析,基于线性和凝胶图像量化信号范围。gydF4y2Ba

2.7。扩散分析gydF4y2Ba

细胞增殖测定使用点击它EdU流式细胞术分析工具包。治疗后与核或质粒转染,细胞维持在90%的融合与10 6-well盘子被孵化gydF4y2BaμgydF4y2BaM EdU 24 h与10% SBF DMEM补充。负染法控制,细胞从相同的人口没有处理EdU。24小时孵化后,流式细胞仪分析细胞收获,准备根据制造商的协议(点击它™EdU Alexa萤石™647流式细胞术分析工具包,英杰公司™)。EdU-labeled细胞定量分析方法进行使用FACSCanto二流式细胞分析仪(BD生物科学)和Flow-Jo分析软件(FlowJo™10.6.3版本)。gydF4y2Ba

2.8。线粒体膜电位(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba评估gydF4y2Ba

为了评估线粒体膜电位(gydF4y2Ba ),gydF4y2Ba细胞培养与50gydF4y2BaμgydF4y2Ba罗丹明123(生命技术®),15分钟在4°C(受光照),洗,resuspended PBS。荧光强度是衡量流式细胞术与FlowJo如前所述和分析软件。gydF4y2Ba

在第二种方法来测量gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba转染后24 h核或超表达),细胞被孵化与线粒体探针JC-10(西格玛奥德里奇)。这与红色荧光染料形式聚合(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba细胞内线粒体与极化,而在细胞去极化的线粒体膜,单体的和绿色荧光染料(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba红色和绿色荧光之间的比率是用来衡量gydF4y2Ba在基底细胞(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba和解偶联州(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba简单,细胞在每个实验条件与JC-10最先孵化,以及gydF4y2Ba率测量。细胞被对待解偶联剂CCCP(羰基氰化物3-chlorophenylhydrazone, 0.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米)15分钟37°C,和gydF4y2BaΔgydF4y2BaFcccp被记录。荧光是量化使用轻歌剧含量高成像系统。的gydF4y2Ba 计算获得的相对比例gydF4y2Ba在每个实验条件。gydF4y2Ba

2.9。脂肪形成的分化和量化gydF4y2Ba

脂肪形成的差异化,ADSCs被播种在6 -或24-well板(喷气Biofil),治疗不同的日子(1、3、7、10、14天)与基础培养基含有脂肪形成的分化诱导物(Lonza)制造商的指示。控制,保持细胞与基底介质没有脂肪形成的诱导物。确定脂肪形成的等级分化和脂质积累,细胞的细胞质甘油三酯检测到与尼罗红染色(N3013σ)。简单,细胞在PBS洗,然后用4%多聚甲醛固定10分钟。与PBS的细胞被洗两次,染了30分钟了。尼罗红(1:1000)和PBS再洗,染色与DAPI 10分钟(1毫克/毫升)(分子探针)。染色细胞检查下轻歌剧CLS含量高成像系统和检查使用和谐4.8软件(PerkinElmer)。总共16每在20 x放大照片是获得生物一式三份。量化的原子核,DAPI通道上的图像被收购(355 - 385 nm励磁和430 - 500海里排放)。核与gydF4y2Ba 被认为是在分析排除细胞碎片。图像获得488年Alexa频道(460 - 490 nm励磁和500 - 550 nm发射)的比例确定尼罗红点的细胞,强度和脂质囊泡的数量。gydF4y2Ba

2.10。统计分析gydF4y2Ba

统计分析与执行GraphPad Prism 7.0版。实验差异争夺和siIL21R或pcDNA IL21R过度ADSC测定学生的未配对gydF4y2Ba - - - - - -gydF4y2Ba测试分析mRNA表达分析、蛋白质定量,线粒体,细胞增殖分化化验。实验数据中存在的差异进行评估通过双向方差分析和多重比较。的数据显示gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba和gydF4y2Ba 被认为是具有统计学意义。gydF4y2Ba

3所示。结果与讨论gydF4y2Ba

3.1。在ADSCs IL21R展品中的亚细胞的本地化gydF4y2Ba

尽管存在gydF4y2BaIL21RgydF4y2Ba信使rna曾在人类ADSCs [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)的蛋白表达和细胞内定位IL21受体仍然未知。因此,我们使用anti-IL21R抗体进行免疫染色,分析了共焦显微镜,以精确确定IL21受体的定位在ADSCs(数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。观察到的亚细胞定位IL21R线粒体模式。确认这些观察,我们执行一个colocalization实验使用特定的β亚基酶抗体ATP合酶(ATP5B)和醛脱氢酶4家人A1 (ALDH4A1)(数据gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS1gydF4y2Ba)。结果证实蛋白质的colocalization IL21R ATP5B和ALDH4A1 ADSCs的线粒体(数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。有趣的是,我们还发现了原子核的经典之中存在IL21R ADSCs(数字gydF4y2Ba1(一)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (b)gydF4y2Ba)。这些结果代表第一个确认ADSCs IL21R的线粒体和核位置。我们评估的本地化IL21R脂肪形成后,发现尽管脂质囊泡的存在,IL21R保持细胞定位(数据的相同的模式gydF4y2Ba1 (c)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba1 (d)gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

IL21R及其配体20年前首次被描述作为一个类我位于细胞膜的细胞因子受体的淋巴组织(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。我们所知,这是第一次报告的colocalization IL21R与线粒体蛋白质(ATP5和ALDH4A1) ADSCs使用免疫荧光分析,表明线粒体IL21R的可能作用。中的亚细胞的本地化已经被描述为其他受体在不同细胞的隔间。作为一个例子,G的典型范式protein-coupled信号意味着heterotrimeric G蛋白质功能与同源受体位于质膜(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。然而,heterotrimeric G蛋白可能在其他细胞间也有不同的功能gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。例如,克gydF4y2BaαgydF4y2Ba12日的四个家庭之一gydF4y2BaαgydF4y2Ba子单元heterotrimeric G蛋白,调节线粒体活性,形貌,膜透性gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。IL21R同样可以hADSCs的线粒体中的作用。虽然并没有直接涉及IL21R线粒体,受体及其配体被证明参与代谢重编程的监管和t细胞分化。具体地说,它是表明T细胞活化后,IL21保留幼稚T细胞的氧化新陈代谢phosphorylation-based典型,不像IL2诱导有氧糖酵解(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。ADSCs分化期间也经过代谢重组。短时间内分化诱导后,ADSCs可以改变一个精力充沛的和氧化代谢轮廓gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba

有趣的是,在我们的结果中,我们也发现了存在IL21R ADSCs的核心。在过去的十年中,越来越多的证据表明存在各种类型的细胞表面受体,如受体酪氨酸激酶(rtk),肽激素受体,细胞核和细胞因子受体(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。例如,身体表皮生长因子受体与STAT3在原子核相互作用,导致转录激活诱导一氧化氮合酶(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。小王和合作者描述的新角色IL21R多发地的细胞类型。使用外周动脉疾病的小鼠模型,他们发现,在缺氧和血清饥饿条件下,IL21R调节内皮细胞。此外,IL-21发现促进信号转导和转录激活3 (STAT3)信号,导致bcl - 2 /伯灵顿比增加,并增加内皮细胞生存和血管生成(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba]。同时,IL21绑定到其受体导致多个下游信号分子的激活,因为STAT3激活IL-21对T卵泡辅助细胞的分化至关重要(gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba),而STAT3激活IL21中扮演着重要的角色在b细胞分化和免疫球蛋白类开关(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba]。还需要进一步的研究来理解的角色IL21R在细胞核和受体是否能身体与STAT3的方式类似于表皮生长因子受体。考虑到这些有趣的结果,我们探讨是否损失或获得IL21R可能影响功能不同的细胞过程,如扩散和ADSCs线粒体活动。gydF4y2Ba

3.2。超表达和沉默IL21R不改变未分化ADSCs的表型gydF4y2Ba

为了检查ADSCs IL21R所扮演的角色,我们在细胞过表达IL21R和评估其影响。ADSCs与pcDNA3.1转染质粒包含gydF4y2BaIL21RgydF4y2Ba基因或截断IL21R克隆作为一个消极的控制。为了验证的程度gydF4y2BaIL21RgydF4y2Ba转染24小时后信使rna,我们执行中存在(图gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba),IL21R蛋白质的数量被免疫印迹(图量化gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS2gydF4y2Ba)。我们发现显著增加IL21R RNA和蛋白质含量比控制数据gydF4y2Ba2(一个)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。IL21R蛋白质重60.13 kDa,有五个N -和一个C-glycosylation网站(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba),每个修改添加~ 2.5 kDa。因此,IL21R糖化在6个地点重约85 kDa。增加假定IL21R蛋白质的糖基化的形式可以发现IL21R-overexpressed ADSCs相比控制(图gydF4y2Ba2 (b)gydF4y2Ba)。不可能想象的变化IL21R本地化后IL21R超表达(图补充gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

鉴于我们colocalization发现,我们评估的影响IL21R过度线粒体膜电位(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba利用罗丹明123和JC-10化验。这些显示控制(数据相比没有明显的变化gydF4y2Ba2 (c)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba2 (e)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS5gydF4y2Ba)。自扩散是一个基本的过程,尤其是对干细胞,我们评估后的增殖率IL21R过度使用EdU公司分析(数据gydF4y2Ba2 (f)gydF4y2Ba和gydF4y2Ba2 (g)gydF4y2Ba标记Ki67的)和细胞增殖标志物表达在细胞周期的所有阶段,除了G0期(图补充gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)。我们的结果显示无显著增殖活动24小时文化时期的变化。gydF4y2Ba

作为第二战略了解ADSCs IL21R所扮演的角色,我们执行IL21R基因沉默使用短干扰RNA (siRNA)方法。然后我们评估沉默细胞的表型IL21R线粒体活动的表达和增殖。转染24小时后,的表达gydF4y2BaIL21RgydF4y2Ba信使rna是显著降低相对于负控制(争夺)(图gydF4y2Ba3(一个)gydF4y2Ba)。我们还观察到一个减少IL21R蛋白质水平,用免疫印迹(图gydF4y2Ba3 (b)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。不可能想象的变化IL21R本地化后沉默IL21R(图补充gydF4y2BaS3gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

额外的努力理解ADSCs IL21R的线粒体位置,我们评估IL21R沉默的可能影响线粒体的活动。细胞被孵化与染料JC-10罗丹明123验证相对线粒体膜电位(gydF4y2Ba )。gydF4y2Ba我们的结果显示一个无意义的差异gydF4y2Ba后IL21R基因沉默相比,两个线粒体中的负控制探针(数字gydF4y2Ba3 (c)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3 (e)gydF4y2Ba)。结果,我们建议的沉默IL21R ADSCs并不影响线粒体的活动。gydF4y2Ba

理解减少IL21R表达式是否会影响细胞增殖率,我们测量的EdU和ki67 siIL21R和消极的控制(争夺)。我们的分析表明,IL21R沉默的增殖率没有显著影响ADSCs 24小时文化时期(数字gydF4y2Ba3 (f)gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba3 (g)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba

3.3。IL21R调控在脂肪生成,其压制削弱ADSCs的脂肪形成的分化gydF4y2Ba

我们之前证明,使用RNA序列,IL21R mRNA水平与多核糖体减少脂肪形成的初始步骤中分化(gydF4y2Ba 和gydF4y2Ba )gydF4y2Ba(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。在这里,我们量化的总水平IL21R信使rna在不同的时间在脂肪生成(1、3、7、14天)来验证这个结果。正如所料,IL21R成绩单的表达显著减少后第一个24小时内感应控制相比(无诱导细胞)。进一步分化过程中(3、7、14天),没有发现差异在noninduced IL21R表达和诱导细胞。gydF4y2Ba

IL21与其受体的相互作用通过JAK-STAT触发信号转导到细胞内信号通路,主要包括JAK1, JAK3, STAT1和STAT3蛋白(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。考虑到关键作用IL21 / IL21R复杂的STAT3信号通路,我们强调STAT3脂肪细胞中高度表达,是一个著名的参与者在脂肪生成gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba]。我们量化的mRNA表达STAT3在脂肪生成,我们验证了它的表达显著增加,经过三天的诱导和维持这种模式直到第14天(图gydF4y2Ba4 (b)gydF4y2Ba)。刘et al。(2020)表明,IL21可以促进成骨分化通过激活JAK3 / STAT3通路在人类瓣膜间质细胞(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba]。因此,我们质疑IL21R在分化过程中的作用。gydF4y2Ba

因为IL21R似乎监管在脂肪形成的初始阶段,我们想知道受体可能影响脂肪形成的分化。要回答这个问题,我们评估的脂肪形成的能力IL21R-silenced ADSCs。小干扰rna转染后24小时内,ADSCs诱导脂肪形成的分化。第十天分化,细胞被固定和贴上尼罗红(图gydF4y2Ba4 (c)gydF4y2Ba和图补充gydF4y2BaS6gydF4y2Ba)。彩色脂质囊泡是由轻歌剧量化的含量高成像系统。我们的研究结果表明,IL21R沉默降低细胞的百分比沾尼罗红(图gydF4y2Ba4 (d)gydF4y2Ba)表明沉默IL21R可以干涉的发生脂肪形成时细胞分化。有趣的是,每个细胞的平均荧光强度(图gydF4y2Ba4 (e)gydF4y2Ba),每个细胞的脂质囊泡数量,信使rna PPAR的表达gydF4y2BaγgydF4y2Ba,脂肪形成的关键调节器(图补充gydF4y2BaS6DgydF4y2Ba),没有不同的争夺控制和沉默细胞(图gydF4y2Ba4 (f)gydF4y2Ba)。积极的百分比尼罗河红细胞低细胞overexpressing IL21 IL21 + IL21R,独自一人,虽然没有差别在细胞overexpressing IL21R(图补充gydF4y2BaS6A-CgydF4y2Ba)。需要更多的研究来了解IL21R在脂肪生成的参与,尤其是配体的存在。gydF4y2Ba

本研究的局限性捐赠者的细胞之间的差异的结果,以及IL21R沉默,它显示一个的IL21R可以掩盖效应在不同的过程评估。有必要评估线粒体或敲除细胞或细胞的过度增殖活动IL21R与其配体,关联IL21,可以肯定的是IL21R在这些过程中的作用。此外,研究线粒体的细胞分离和透射电子显微镜需要理解IL21R的位置及其作用的细胞器。在这里,我们确定的影响IL21R细胞分化成脂肪细胞的数量和内容没有改动PPAR的表达gydF4y2BaγgydF4y2Ba。更多的研究评估其他基因与脂肪形成和其他分析时间需要了解IL21R干涉细胞分化过程。IL21R mRNA的数量在多核糖体减少脂肪生成的开始(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。这里,我们确认结果,表明IL21R基因沉默会损害脂肪形成。之前的一项研究发现,72小时从脂肪形成感应所需的最少时间承诺和高效分化(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。因此,IL21R表达式的障碍在ADSCs脂肪形成的早期阶段可能妥协其分化的承诺。考虑到IL21R及其配体相关JAK / STAT信号通路(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),统计1、3、5 a和5 b表达的脂肪细胞和脂肪生成期间监管审查(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)可以想见,IL21R可能通过激活STAT3参与脂肪形成。更多的研究是必要的来证实这个假说。gydF4y2Ba

几项研究已经表明刺猬(Hh)信号通路作为脂肪生成抑制剂(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。Hh通路的激活减少IL21R mRNA的表达,及其抑制增加IL21R mRNA水平与平移相关机械(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba]。与这些研究结果一致,我们的研究结果表明,IL21R消极地影响脂肪形成的差异化的沉默。gydF4y2Ba

4所示。结论gydF4y2Ba

最后,我们发现,经典之中的本地化IL21R发生在人类ADSCs的线粒体和细胞核。此外,IL21R沉默能够减少这些细胞(图的脂肪形成的能力gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。需要更多的研究来了解IL21R之间所涉及的机制和脂肪形成的分化过程。gydF4y2Ba

缩写gydF4y2Ba

IL21R:gydF4y2Ba	白介素21受体gydF4y2Ba
ADSCs:gydF4y2Ba	脂肪干细胞/基质细胞gydF4y2Ba
ATP5B:gydF4y2Ba	的β亚基酶ATP合酶gydF4y2Ba
GAPDH:gydF4y2Ba	Glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶gydF4y2Ba
kDa:gydF4y2Ba	KilodaltongydF4y2Ba
扫描电镜:gydF4y2Ba	平均数标准误差。gydF4y2Ba

数据可用性gydF4y2Ba

没有数据被用来支持本研究。gydF4y2Ba

伦理批准gydF4y2Ba

本研究遵循指南涉及人体受试者的研究和伦理委员会的批准gydF4y2BaFundacao Oswaldo CruzgydF4y2Ba巴西研究设计院:48374715.8.0000.5248)。gydF4y2Ba

的利益冲突gydF4y2Ba

作者报告,没有潜在的利益冲突或财务利益。gydF4y2Ba

作者的贡献gydF4y2Ba

男朋友,MJB、电动汽车和PS进行分子的研究。CLKR ADSC进行隔离。贝克海姆进行了共焦显微镜。AMA轻歌剧进行分析。MAS进行血细胞计数实验。男朋友,MJB和PS起草了手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。米菲克里斯蒂娜Falavinha和玛丽亚茱莉亚Barison贡献同样这项工作。gydF4y2Ba

确认gydF4y2Ba

作者感谢技术开发的程序工具Health-PDTIS / FIOCRUZ使用其设施。这项工作是支持的Inova Fiocruz / Fundacao Oswaldo Cruz (Inova vppcb - 008 - fio - 18)和CNPq / Proep442324/2019-7。gydF4y2Ba

补充材料gydF4y2Ba

图补充S1:细胞内定位ADSCs IL21R。免疫荧光标记的未分化ADSCs使用gydF4y2BaαgydF4y2Ba-IL21R,gydF4y2BaαgydF4y2Ba-ATP5B和ALDH共焦显微镜。(a, b) ADSCs (TAL27和32)孵化主要抗体gydF4y2BaαgydF4y2BaAlexa488 -IL21R,二级抗体结合,gydF4y2BaαgydF4y2Ba-ATP5B (Atp5b位于线粒体ATP合酶),和Alexa 546和二次抗体结合gydF4y2BaαgydF4y2Ba-ALDH4A1,二级抗体共轭Alexa 546。ADSCs被孵化与DAPI核染色。图像然后合并显示gydF4y2BaαgydF4y2Ba-IL21R是与gydF4y2BaαgydF4y2Ba-ATP5B ALDH4A1,表明该蛋白位于线粒体和细胞核内。酒吧规模:50gydF4y2BaμgydF4y2Bam。图补充S2:细胞内定位的IL21R ADSCs后沉默或超表达。免疫荧光标记的未分化ADSCs使用gydF4y2BaαgydF4y2Ba-IL21R(绿色)和DAPI(蓝色),代表的捐赠者TAL23图像。(一)控制ADSCs;(b)细胞转染争夺;(c)与siIL21R细胞转染;(d)细胞没有孵化主要抗体。与控制(e)细胞转染质粒(pcDNA);(f)细胞与质粒转染IL21R过度;(g)细胞与质粒转染IL21过度;和(h)细胞转染质粒IL21R和IL21超表达。共有9个照片是连接每个条件。 Scale bar: 200 μgydF4y2Bam。图补充S3:检测水平IL21R蛋白质与siIL21R ADSC沉默(a)和IL21R过度利用免疫印迹(b)。蛋白质含量GAPDH是用作控制的负载。gydF4y2Ba 。gydF4y2Ba图补充S4: Ki67 +细胞在ADSCs沉默(24 h)或超表达(48 h) IL21R不受细胞融合的影响。的增殖ADSCs提交IL21R沉默24 h或超表达48 h被DAPI和Ki67染色处理标准免疫染色程序(莱拉et al . 2021年)。图像被使用高含量的图像系统轻歌剧CLS(珀金埃尔默)。为每个好25照片被收购;核是DAPI频道(励磁355 - 285 nm,发射430 - 500 nm);Ki67染色收购alexa488频道(励磁460 - 490 nm,发射500 - 550 nm)。和谐的分析软件4.8(珀金埃尔默),不含细胞的边缘并选择核循环性大于0.9。二次抗体控制(a)和Ki67积极控制(b)所示。核的数量用DAPI标记和核的强度Alexa488大于7000任意单位强度进行评估,相应细胞阳性Ki67标记基于二次抗体控制(c)和Ki67-positive控制(d) Alexa488强度显示在核区域。评价细胞融合是否会干扰压制下增殖细胞轮廓(e)或超表达IL21R (f), Ki67表达式是评估在40%或90%的细胞融合,双向方差分析进行评估的数据,没有意义。 ( 独立的捐助者)(TAL27, 32岁,36)。比例尺对应于100年gydF4y2BaμgydF4y2Bam。参考:莱拉et al . Bismuth-based纳米粒子影响脂肪形成的人类脂肪间充质干细胞的分化。毒理学体外77,105248。ns:不重要。图补充S5: (a) CCCP滴定:546/488比例的解偶联状态ADSC提交不同的CCCP浓度(0.01 - -2.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba米),在JC-10的存在。实验是在技术一式三份和数据分析了单向方差分析和图基的多个对比测试。(b, c)基底和解偶联状态控制和转染细胞:546/488比例的基底和非耦合(0.5gydF4y2BaμgydF4y2Ba挺)州沉默(b)和overexpressing (c)细胞。实验是在生物一式三份(TAL 23、27和32)和数据分析了双向方差分析和Dunnett多个对比测试。gydF4y2Ba ,gydF4y2Ba ,gydF4y2Bans:不重要。图补充S6: ADSCs被诱导脂肪形成的十天。细胞培养与尼罗红(亲脂性的荧光染料)和分析使用轻歌剧含量高成像系统。(a, b)代表的荧光图像ADSCs overexpressing IL21R, IL21, IL21R + IL21, pcDNA经过十天的脂肪形成和沾尼罗红(绿染色)和DAPI染色(蓝色)。酒吧规模:200gydF4y2BaμgydF4y2Ba捐助TAL23 m。代表的图像。(c)尼罗河Red-positive细胞的相对比例。(d) PPAR的表达水平gydF4y2BaγgydF4y2Ba在控制(gydF4y2Ba )gydF4y2Ba和沉默(siIL21R)细胞诱导与否(ctrl)脂肪形成的差异化在10天。实验在生物一式三份,执行和数据分析了单向方差分析和图基的多个对比测试。gydF4y2Ba ,gydF4y2Bans:不重要。表补充S1: ADSCs捐赠信息。ND:没有数据。gydF4y2Ba(gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba)gydF4y2Ba