文摘
骨组织提供支持和保护不同的器官和组织。衰老和不同的疾病可以导致骨再生的速度减少或不完整的愈合;因此,组织工程的替代品可以是一个可以接受的替代传统的疗法。在目前的工作,我们已经开发了一个在体外成骨分化模型间充质干细胞(msc)的基础上,首先分析了影响文化的媒体和细胞的起源这一过程的效率其次推断它的3 d环境中评估其可能应用在骨再生疗法。两个成骨培养基被使用(一个商业从干细胞技术和第二个补充与地塞米松、抗坏血酸,glycerol-2-phosphate,和BMP-2),与人体细胞的间质表型从两个不同的起源:脂肪组织(hADSCs)和牙髓(hDPSCs)。成骨的标记的表达在2 d文化是评估在一些文化时期通过免疫荧光技术和实时基因表达分析,参考mg - 63细胞的成骨的起源。相同的策略是外推到一个3 d环境的聚乳酸(PLA), 3%的海藻酸水凝胶。的表达成骨的标记中检测出hADSCs和hDPSCs 2 d或3 d环境中培养。然而,获得msc的成骨分化是基于使用的培养基和细胞的起源,因为更高的成骨的标记水平被发现与BMP-2 hADSCs与培养基培养时补充。此外,使用的3 d文化是适合细胞生存和成骨的归纳。
1。介绍
骨组织提供支持和保护我们身体的不同器官(1,2]。它是最具活力的组织我们的有机体,它也在不断地改造,允许不仅适应机械力量,而且损伤的修复。在生理条件下,骨再生能力非常好,虽然这能力是有限的小缺陷在特定条件下(3]。在这些不利条件,一个成功的修复,老年性骨质疏松症变得特别相关,因为至少50%的人口患有慢性虚弱和恶化的生活质量由于骨质疏松症,也引起裂隙的出现(4]。尽管骨的再生能力,内源性修复在某些情况下是不够的;因此,人们提出了不同的治疗过程(5]。骨移植是一种使用最广泛的替代修复骨折,因为它允许一个伟大的再生在整形手术6),显示了三个重要的生物学性质等骨再生osteoconduction, osteoinduction和骨生成6]。除此之外,一个重要的标准评估骨愈合骨整合的结果,认为骨之间的结构和功能键和植入物(7]。
传统疗法显示骨再生率低,慢性疼痛和感染8]。为数不多的长期成功的结果,因此,由于这些传统疗法可以产生,越来越多的兴趣,发展新的治疗策略,加速生理修复骨折,如组织工程技术专注于治疗和修复骨损伤(8,9]。
组织工程的主要目的是将活细胞与3 d支架和生物活性分子结构模拟细胞外基质,促进组织修复和再生10- - - - - -12]。因此,关键的第一步是选择一个细胞类型。对骨再生,成骨细胞将是一个不错的选择,但他们是postmitotic细胞在活的有机体内,在体外,他们表现出低的扩散和快速程序性细胞死亡(13]。另一方面,间充质干细胞(MSC)是一个很好的选择,因为他们是能够自我复制和分化成特定细胞系如骨细胞、克服的缺点利用分化细胞(14,15),事实上这些多能细胞广泛应用于再生医学(16- - - - - -18]。骨髓干细胞(BM-MSC)将是一个合适的候选人成骨的再生,但入侵过程要求获得他们代表了一个重要的缺点19,20.]。出于这个原因,其他细胞间质表型,如位于脂肪组织(ADSCs)或牙髓(DPSCs),代表一个可接受的替代(17,21,22]。此外,DPSCs显示潜在的增殖和分化能力大于ADSCs [21]。
考虑到第二步是骨组织工程中使用的脚手架和仿生材料(23),3 d结构,必须提供适当的架构和环境发展和增长的骨组织,指导骨折修复的复杂的过程。脚手架的设计促进细胞增殖、生存、粘附、迁移,以及加速骨重建,提供一个综合分析结构指南,和,在某些情况下,作为载体材料生长因子或抗生素(11]。事实上,显微组织的变化影响msc的响应,可以修改,例如,细胞粘附到支架表面,细胞增殖和成骨分化23]。由于这些原因,脚手架必须生物相容性和noncytotoxic在机械和表面性质类似于骨组织(11,24,25]。现在,天然和合成聚合物都是用于生产这些支架。天然聚合物、海藻酸、透明质酸等,广泛应用因其生物相容性和诱导细胞生长的26,27];然而,他们缺乏骨的力学性能28]。关于合成聚合物,聚(乳酸)酸(PLA)、聚(lactic-co-glycolic)酸(PLGA),聚已酸内酯(PCL)存在的可能性,调整和修改他们的机械性能29日];然而,他们现在的缺点缺乏生物活性相关,限制与宿主相互作用的组织。一个可能的解决方案是混合材料的生产,提高细胞粘附,矿化和成骨分化29日]。然而,这方面的研究很少,因此,有必要规范这些混合材料的设计和制造方法,研究不同的干细胞培养的生物学行为。在这方面,使用商用3 d打印设备和材料感兴趣的可以快速生成原型适合在活的有机体内研究[30.]。
最后一步包括生长因子,它的形成至关重要,维护,和骨组织的再生诱导祖和炎症细胞迁移到损伤部位和启动愈合过程12,26,31日]。此外,这些分子增加疤痕形成,限制过度骨形成,加速愈合过程(32]。例如,富含血小板血浆(PRP),它拥有丰富的自然和合成生物材料,可用于骨科结合自体骨由于其有效性在伤口愈合过程中(33]。因此,成骨分化是基于不同的生长因子如PDGF的行动,TGFβFGF, IGF, BMP等(30.,34]。BMP组成一个家庭的蛋白质BMP7或BMP2的重要性在骨形成的控制35,36]。BMP2中起关键作用的表达成骨的标记,如碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC) [37,38]。此外,地塞米松诱导MSC增殖在体外及其分化成骨的血统(39),尽管它诱导矿化。出于这个原因,连同使用地塞米松β甘油磷酸盐和抗坏血酸(40]。前者起着重要的作用在矿化过程和成骨活动的调制,抗坏血酸是至关重要的增加细胞活力,刺激成骨细胞产生I型胶原蛋白(11,40]。
我们的目标在当前工作研究的感应作用BMP2成骨分化的人类ADSCs和DPSCs (hADSCs和hDPSCs)。两种类型的细胞的成骨的潜力进行了研究在2 d文化中,分析骨相关蛋白的表达(碱性磷酸酶和骨钙素),钙沉积在细胞培养中,通过组织和细胞形态的细胞骨架肌动蛋白丝。全面研究不同基因的相对表达水平与骨也。最后,这些细胞的骨分化潜能在体外在3 d环境中进行了研究。为了这个目的,一个3 d打印的脚手架原型制造计划和海藻酸,种子细胞,和bone-inductive BMP2的能力。
2。材料和方法
2.1。实验设计
hADSC hDPSC, mg - 63细胞在二维环境中培养与增殖和成骨分化媒体(补充BMP2或MesenCult参考感应介质)的密度 细胞/毫升2、3和4周。碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC)免疫荧光标记的蛋白质进行检测,和细胞骨架组织研究了染色的肌动蛋白丝rhodamine-conjugated phalloidin。钙沉积进行了分析与茜素红染色。相关基因的相对表达骨被实时rt - pcr分析。一旦成骨的模型评估的2 d文化, 细胞/毫升培养3周在脚手架原型组成的3 d打印的解放军框架与海藻酸嵌入。在这些支架,骨钙素的表达通过免疫荧光被用作成骨分化的标志。
2.2。细胞培养
人类脂肪干细胞(hADSCs)和人类牙髓干细胞(hDPSCs)从Lonza购买(瑞士巴塞尔),和mg - 63细胞从美国类型文化集合(写明ATCC®crl - 1427™;Sigma-Aldrich;马德里,西班牙)。mg - 63细胞细胞系来源于骨肉瘤,被选为一个积极控制成骨分化(41]。细胞培养在75厘米(2]烧瓶与扩散介质组成的αMEM (Gibco;美国WA)补充10%胎牛血清(的边后卫)(Gibco;美国),1% penicillin-streptomycin (P / S)抗生素解决方案(Gibco;美国),2毫米谷酰胺(Gibco;美国)hADSCs和hDPSCs, mg - 63细胞,这个媒介是补充1%解决不必要的氨基酸(NEAA) (Gibco;100 nM丙酮酸钠(美国)和1% Gibco;美国)。成骨分化被取代增殖培养基诱导分化成骨的媒体。两种不同的分化成骨的媒体使用:商业成骨分化培养基MesenCult™(# 05465干细胞技术;法国格勒诺布尔)和介质组成的αMEM补充10%的边后卫,1% P / S抗生素解决方案,2毫米谷酰胺,10μg / ml glycerol-2-phosphate(默克公司;达姆施塔特,德国)4μg / ml抗坏血酸(默克公司;德国),0.1μg / ml地塞米松(默克公司;德国),50 ng / ml BMP2(干细胞技术;法国)。细胞培养是在湿润的气氛中保持在37°C, 5%的公司2,95%的空气,每2 - 3天更换培养基。
2.3。免疫荧光
细胞培养在8-well Millicell EZ幻灯片(默克公司)3天在增殖培养基,然后,媒介也换成成骨分化培养基(BMP2-supplemented或商业MesenCult媒体)4周。样本与4%多聚甲醛固定磷酸盐(PBS), pH值7.4,10分钟后沿与PBS洗涤三次5分钟在RT,细胞permeabilized 0.1% Triton x - 100在PBS 5分钟,清洗三次。
检测高山和OC蛋白质的表达,30分钟的幻灯片是孵化屏蔽解决方案(1%牛血清白蛋白(BSA)和PBS Tween-20 1.1%)。一夜之间,然后,他们被孵化在4°C鼠标反高山或反OC免疫球蛋白抗体(MAB 1448年和1419年马伯,分别;研发系统;美国明尼阿波利斯)1:200稀释的抗体稀释剂。幻灯片被洗了三次和孵化FITC-conjugated兔子anti-mouse免疫球蛋白二次抗体(D2883默克公司;在PBS瑞士),稀释1:200,2 h,在RT在黑暗中,之前报道(42]。
检测丝状肌动蛋白(f -肌动蛋白),permeabilized幻灯片与PBS preincubated含有1% BSA 30分钟减少非特异性背景。然后,一个包含200解决方案μl PBS和5μl (rhodamine-conjugated methanolic phalloidin股票的解决方案(分子探针,热费希尔科学;沃尔瑟姆,妈,美国)被添加到样品和孵化20分钟在RT,正如前面报道(43]。
最后,使用的幻灯片酒精度,OC,或与PBS f -肌动蛋白检测清洗三次,和核DNA沾4 ,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)(σ),样本分析使用徕卡生物系统公司4000 d荧光显微镜DM(徕卡生物系统;位于德国)和拍摄徕卡DFC 340 fx相机(徕卡生物系统)。
2.4。茜素红染色
钙沉积,茜素红染色分析之前报道(44,45]。短暂,hADSC hDPSC, mg - 63细胞培养在8-well Millicell EZ幻灯片(默克公司)与成骨分化媒体(BMP2-supplemented或商业MesenCult媒体)。经过4周的文化中,细胞与4%多聚甲醛固定PBS, pH值7.4,10分钟在RT,用蒸馏水洗两次,覆盖着茜素红溶液(2%茜素S在蒸馏水,pH值4.2)长达15分钟在RT,样本洗两次蒸馏水和苏木精染色10年代。最后,这些细胞被洗两次,和一个标准与乙醇脱水的解决方案(50 - 70 - 100%)和两个二甲苯进行最后的步骤。样本和研究使用徕卡DMBL光学显微镜(徕卡生物系统;德国)。照片被抓获,徕卡ICC50数码相机(徕卡生物系统)。
2.5。实时rt - pcr
具体的表达成骨的实时rt - pcr基因进行了研究。RNA分离和纯化,逆转录(RT)进行了使用高容量cDNA合成装备(生命技术;马德里,西班牙),制造商的指示。
使用通用的互补脱氧核糖核酸被放大实时PCR基因表达主混合(生命技术;西班牙)和7900 ht实时Thermocycler(应用生物系统公司;美国CA)根据供应商的指令。放大,以下预先设计分析需求(生命技术;西班牙)使用:BGLAP (Hs01587813_g1) CSF1 (Hs00174164_m1) CSF2 (Hs00929873_m1) IBSP (Hs00913377_m1) MT-CO1 (Hs02596864_g1) RUNX2 (Hs01047973_m1)和SPP1 (Hs00959010_m1)。GAPDH (Hs02786624_g1)用作看家基因。每个基因的相对表达计算使用的比较ΔΔCT方法。所有的反应都在一式三份。
2.6。PLA支架制造、特性和卫生处理
对于3 d打印技术,多孔支架的设计使用Tinkercad™应用程序(欧特克;美国加州)的看台2软件(软件)Ultimaker的看台。不同生产参数被认为是,如墙[2],墙壁的厚度(1毫米),底部和顶部厚度(0毫米),填充密度(45%)、填充模式(行)和印刷速度(60毫米/秒)。支架是用BQ Hephestos 2打印机(BQ;马德里,西班牙)与0.4毫米喷嘴挤压机耦合的解放军线圈(1.75毫米直径的纤维)。
描述的脚手架,图片拍摄的房子- 5410扫描电子显微镜(Jeol;日本东京)距离15毫米和15千伏电压。五3支架的图像处理来测量平均孔隙大小与ImageJ /斐济软件,使用最近邻距离插件。三个样品的解放军和一些具有不同厚度的样品用于拉伸试验。三个样本的1.5毫米和2.6毫米和3.1毫米的四个标本。都是15.5毫米宽,下巴部分是60毫米长。Dy34牵引设备(Adamel Homargy部门D 'instruments SA);艾乌利、法国)使用1 kN负载细胞。首次应用10毫米/分钟的速度,和获得的数据使用TestWorks 4®软件(MTS系统;美国明尼苏达州)。
这些研究之后,支架被连续消毒洗涤剂用100 - 100 - 70 - 50 - 30%乙醇(以前过滤0.2μ米孔隙过滤器)和无菌超纯水,390 rpm风潮下的1 h每个常数。然后,样本洗两次与PBS 1 h。最后,细胞内的支架是干孵化器。
2.7。细胞毒性试验的3 d打印的支架
条件培养基被孵化获得3 d打印的支架与扩散介质无酚红,在37°C和震动1500 rpm 24小时和7天。细胞毒性测试通过孵化mg - 63细胞条件培养基,如前所报道(46,47]。短暂,mg - 63细胞被播种在96孔板的密度 细胞/。24小时后,培养基是scaffold-conditioned介质所取代。Latex-conditioned介质被用作积极控制细胞毒性。额外的细胞被培养24小时。然后,MTS试验(Sigma-Aldrich;马德里,西班牙)是由添加20μl (MTS试剂和孵化2 h。最后,吸光度测量在490 nm维克多X3 2.030 multilabel阅读器(PerkinElmer;麻萨诸塞州,美国)。吸光度值成正比细胞生存能力。
2.8。制造混合Hydrogel-PLA Scaffold-Containing细胞
3 d打印PLA支架与细胞悬浮在嵌入式海藻酸如下。3%海藻酸溶液与超纯水制备含有40毫米玫瑰和300毫米氯化钠,pH值7.4,消毒在121°C和1台柜员机20分钟。然后,hADSCs或hDPSCs ( 细胞海藻酸/毫升)被添加到解决方案prewarmed 37°C。支架被安置在12-well文化板块和嵌入式100μl的海藻酸包含细胞悬液的解决方案。然后,海藻酸的聚合是通过添加解决方案包含102毫米CaCl诱导2和10毫米的消息灵通的无菌蒸馏水在10%的浓度对海藻酸的最终体积/样品。30分钟scaffold-containing细胞被孵化的RT,然后沉浸在增殖培养基。经过3天的文化、媒介取代与成骨分化媒体(BMP2-supplemented或商业MesenCult)和支架培养额外3周。培养基是每2 - 3天更换一次。
2.9。数据显示
所有实验都是一式三份。手稿中给出的数据代表的结果。相对表达数据分析使用GraphPad Prism 5.0软件(GraphPad软件Inc .)。方差分析的参数检验(方差分析)。的值被认为是具有统计学意义的差异 。
3所示。结果
3.1。BMP2-Supplemented介质诱导的细胞骨架重组和高山和OC蛋白的表达
我们研究BMP2-supplemented培养基的诱导成骨的能力在这两种类型的间充质细胞,hADSC和hDPSC 2 d文化长达4周。mg - 63细胞系是包含在研究控制细胞的成骨的血统。商业MesenCult中被用作参考诱导物在体外人类间充质干细胞的分化细胞的成骨的血统。总结了结果数据1- - - - - -3。
细胞骨架在mg - 63细胞分析显示离散变化的三个实验小组分析(增殖培养基和成骨分化BMP2-supplemented或商业MesenCult媒体)。在细胞培养与增殖培养基,观察肌动蛋白形成三维网络的长纤维通过细胞质,而积累在细胞的外围包在等离子体膜,但当成骨分化中添加了f -肌动蛋白在细胞胞浆染色下降,压力的增加纤维是观察到细胞边缘,与细胞接触的出现表明肌动蛋白纤维染色的焦积累。这些变化在细胞培养更明显BMP2-supplemented介质相比,商业MesenCult培养基(数字1(一),1(d)1(g))。
当mg - 63细胞增殖培养基培养,低表达的高山和OC细胞质中所示。然而,在高山的表达显著增加,OC蛋白质在mg - 63细胞与成骨分化培养媒体、商业MesenCult, BMP2-supplemented媒体。高山,之间没有差异观察成骨的媒体(数字1(b),1(e)1(h))。OC,仅略有增加时观察到的细胞培养介质与BMP2补充数据1(c),1(f)1(我))。
类似的趋势是hADSCs观察。在细胞培养与增殖培养基,观察肌动蛋白细丝穿过细胞质,包在质膜。成骨分化媒体诱导形成的圆周应力纤维和更大的细胞间接触(数字2(一),2(d)2(g))。高山的表达蛋白中没有检测到细胞在增殖培养基培养(图2(b))。尽管成骨分化培养基刺激这种蛋白质的表达,商业MesenCult媒介似乎比BMP2-supplemented介质(数据更有效2(e)和2(h))。OC的表达显著增加,蛋白质也观察到当细胞培养在成骨分化媒体研究,在增殖培养基培养细胞相比,这种蛋白质的表达没有检测到(数字2(c),2(f)2(我))。
hDPSC文化,细胞骨架的变化很难评估由于高增殖的细胞,因此,很难建立实验组(数据之间的差异3(一),3(d)3(g))。高山和OC的表达蛋白中没有检测到细胞培养与增殖培养基;然而,诱导成骨的媒体显著增加高山的表达和OC以类似的方式(数字3(b),3(c),3(e),3(f),3(h)和3(我))。
3.2。BMP2-Supplemented培养基诱导钙沉积在细胞培养
钙沉积是一种成骨细胞的活动的相关指标。研究钙沉积,茜素红染色在mg - 63细胞,hADSC hDPSC 2 d-cultured扩散介质或商业MesenCult或BMP2-supplemented成骨分化媒体,4周。没有观察到钙沉积的细胞类型研究与增殖培养基培养时(数据4(一)-4(c))。然而,MesenCult和BMP2-supplemented成骨分化媒体强烈诱导的钙沉积mg - 63细胞在两种类型的干细胞研究,虽然这是高hDPSCs hADSCs相比(数字4(d) -4(我))。
3.3。BMP2-Supplemented培养基诱导骨标记的基因表达
RUNX2(数据的表达5(一个)和6(一))增加了mg - 63细胞在培养3周与成骨分化媒体,显示与商业MesenCult培养基培养时显著增加三倍和2倍与BMP2-supplemented培养基培养,相比与增殖细胞培养介质。在hADSCs RUNX2的表达明显高于与BMP2-supplemented成骨培养基培养2周时,显示一个值接近三倍增加的控制样本与增殖培养基培养;然而,没有观察到的差异与商业MesenCult成骨分化培养基培养。hDPSCs的情况下,增加一个重要90倍时观察到与商业MesenCult培养基培养3周相比,控制,但是没有观察到的差异时随时与BMP2-supplemented培养基培养研究。
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对于BGLAP基因表达数据5 (b)和6 (b)),高表达的增加观察到两次文化的研究,与成骨分化媒体分析。mg - 63细胞培养与MesenCult介质2和3周,基因表达增加了近900倍,而hADSCs显示增加接近100倍后2周的文化与MesenCult中、在3周后30倍。最后,hDPSCs与MesenCult培养基培养2周后显示一个增量接近20倍的文化和大量增加10000倍,当细胞培养3周。当细胞培养2周BMP2-supplemented媒介,BGLAP表达式显示对mg - 63细胞显著增加8倍和三倍增加hADSCs和hDPSCs。这些高水平的表达仍然显著增加3周后的mg - 63细胞和hADSCs文化。
IBSP标记基因的表达(数字5 (c)和6 (c))增加hDPSCs BMP2-supplemented成骨分化培养基培养2周,显示出显著的4倍增加的控制,与增殖培养基培养。经过3周的文化与成骨分化媒体,这些细胞显示大量增加接近100倍MesenCult培养基和培养与BMP2-supplemented介质三倍。然而,hADSCs只显示这个基因的表达显著增加培养3周BMP2-supplemented介质时,显示控制相比增加5倍。
SPP1(数据的表达5 (d)和6 (d)),hADSCs会增加4倍,当与MesenCult培养基培养2周。hDPSC文化,他们展示了一个巨大的重要4000倍增加当培养3周MesenCult介质和温和的3 - 4倍增加2和3周的文化,分别与BMP2-supplemented成骨分化培养基培养。
对于CSF1基因表达数据5 (e)和6 (e)),hADSCs hDPSCs与BMP2-supplemented成骨分化培养基培养有显著提高近三倍的变化样品培养2和3周。然而,hDPSCs与商业MesenCult培养基培养时,显著增加接近100倍观察到只有3周的研究中,虽然hADSCs显示轻微但显著增加只在2周的文化。另一方面,mg - 63细胞培养的成骨分化媒体3周显示CSF1表达显著下降。
关于CSF2表达式(数字5 (f)和6 (f)),hDPSCs商业MesenCult培养基培养3周有显著提高200倍以上的控制,而增加时温和与BMP2-supplemented培养基培养2周,显示一个相对增加CSF2表达式接近2倍值控制。mg - 63细胞在表达式的值会增加15倍与商业MesenCult培养基培养3周,但没有显著差异CSF2表达观察与其他细胞或媒体使用。
最后,MT-CO1标记基因表达(数字5 (g)和6 (g)显示显著增加接近三倍价值hDPSCs BMP2-supplemented成骨分化培养基培养2周,3周后的培养基时,所有细胞类型显示重要的2倍增加。然而,在细胞与商业MesenCult成骨分化培养基培养,MT-CO1表达式只有不同hDPSCs培养3周,增加了高近100倍比控制。
3.4。3 d打印PLA支架的制造和表征
原型组成的3 d打印PLA支架制造为了研究BMP2的成骨的感应能力在3 d环境中。Tinkercad软件被用来设计支架组成的 对细胞培养或立方体 多维数据集的机械特性研究。STL文件生成和纹理进行使用的看台2软件根据材料和方法描述的参数,和原型使用Hephestos 2打印机打印。
支架的生物力学特征总结了表1。三个不同的支架被印刷, 是代表。
印刷的超微结构的组织支架使用扫描电子显微镜研究了。代表图像如图7。获得的支架孔隙度为55%,平均孔径1.1毫米长度和密度的毛孔(1孔/毫米2]。
最后,对细胞的毒性,mg - 63细胞培养条件培养基中描述的材料和方法,72 h。细胞毒性试验未显示显著差异与nonconditioned培养基培养细胞条件培养基。然而,当细胞培养与latex-conditioned媒介,作为一个积极的控制细胞毒性,细胞生存能力显示显著减少95%的活细胞(数据没有显示)。
3.5。BMP2诱导成骨分化在混合3 d打印PLA-Alginate支架
最后,我们研究了BMP2的成骨分化能力在一个复杂的3 d打印的褐藻酸盐支架。mg - 63细胞,hADSCs hDPSCs,培养在3 d支架如上所述。scaffold-containing细胞培养3周,不同的媒体:扩散介质或成骨分化媒体(商业MesenCult或BMP2-supplemented)。细胞骨架的组织被荧光染色rhodamine-phalloidin f -肌动蛋白的研究。骨钙素被选为标志的成骨分化和免疫荧光探测到。
图8显示了mg - 63细胞制造PLA支架。是观察到的细胞占据了毛孔支架,细胞的数量是高支架与增殖培养基和BMP2-supplemented成骨分化培养基培养,相比与商业MesenCult成骨分化培养基培养(数字8(一),8(c)8(e))。OC的存在被发现在mg - 63细胞培养在不同的媒体分析,但没有观察到的差异对于荧光强度或团体研究(数据之间的分布格局8(b),8(d)8(f))。
hADSCs培养在PLA支架时,没有观察到细胞的数量差异之间使用不同的媒体(数字9(一),9(c)9(e));然而,观察到的细胞密度低于mg - 63细胞。与mg - 63细胞,OC的存在并没有检测到hADSCs与增殖培养基培养(图9(b));然而,成骨诱导培养基诱导OC的轻微但类似的表达式(数字9(c)和9(e))。
关于hDPSCs,他们表现出更多的细胞经过3周的文化比hADSCs所有使用的培养基(数字10(一),10(c)10(e))。OC的表情就像hADSCs:细胞培养与增殖培养基时,没有观察到OC表达,而这种蛋白质存在时细胞与成骨分化培养媒体(数字10(b),10(d)10(f))。
4所示。讨论
人类的骨骼是由主要的骨组织,支持和保护不同的器官和组织1,2]。失去有效性在老化,有些病态也可以增加其脆弱性,导致骨折(48]。虽然骨有能力连续更新的一生中,自发愈合并不总是存在的理想条件(49]。目前,骨移植被用作解决这些伤害,促进骨愈合通过各种综合分析,有和成骨的机制,但是他们有一些局限性。
在目前的工作中,我们评估的最佳条件在体外骨髓间充质成骨分化的细胞。出于这个原因,成骨分化的影响中补充了地塞米松抗坏血酸,glycerol-2-phosphate, BMP2是研究两种类型的间充质细胞,hADSCs hDPSCs。此外,我们用mg - 63细胞作为控制和商业MesenCult成骨分化培养基中作为参考。证明了这些成骨分化培养基诱导msc分化的细胞的成骨的血统,因此,本研究的主要目的是评估和比较他们的成骨诱导活动,因此他们的角色在骨折修复(50]。一旦诱导媒体演示的效果,同样的模型外推到一个3 d环境,对其未来的应用程序作为治疗骨损伤。
细胞培养4周后,我们研究了两个基本的表达骨蛋白,如碱性磷酸酶(ALP)、骨钙素(OC) [41,51,52],它扮演着重要的角色在新骨的形成和成熟。承诺的msc成骨的血统取决于BMP和TGF等因素β1,调节特定标记的表达从preosteoblasts过渡到成骨细胞(如高山)或成熟的成骨细胞标记如OC (53,54]。一方面,我们观察到高山的表达和OC mg - 63细胞培养时增殖和成骨分化的媒体。另一方面,在增殖培养基培养我们观察到hADSCs hDPSCs没有表达这两个标记。然而,他们发现合成与成骨细胞谱系都培养时电感的媒体。此外,重要的是要指出,msc与商业MesenCult成骨分化培养基培养表现出更强烈的高山和OC合成比与BMP2-supplemented培养基培养。这些结果同意之前报道的Ravichandran et al。55)和卡夫et al。56),他也发现这两个标记的表达在msc与成骨分化培养基培养,从而证明成骨分化培养基诱导msc的表型变化与成骨分化有关。
作为Goncharenko等人表明还有其他特征如细胞形状、力学性能、组织细胞的细胞骨架在细胞分化发挥重要作用[57]。在我们的工作中,形态的msc phalloidin染色法研究了可能的变化促进了文化的媒体。mg - 63细胞和hADSCs没有显示细胞形状差异培养时所使用的不同的媒体。然而,我们观察到的差异在肌动蛋白丝hADSC样本,丝厚在细胞培养的成骨分化媒体比增殖培养基中培养。然而,它是不可能确定细胞形态学phalloidin-stained hDPSCs由于高细胞融合不允许我们适当的可视化。因此,我们可以肯定,有一种倾向,培养细胞保持形状不变,虽然似乎肌动蛋白丝的厚度的变化,根据Titushkin和曹,他描述了一种重组的细胞骨架当msc被暴露于一个成骨的刺激(58)和媒体报道,成骨分化促进了MSC的替代压力由薄肌动蛋白纤维,纤维形成网络结构成熟成骨细胞的特征。这些发现符合本文提供的结果,因为我们观察到细胞内phalloidin减少染色和圆周应力纤维的形成,以及增加病灶细胞接触,这是成熟的成骨细胞的特征。因此,如果msc诱导osteogenically,细胞骨架的动态重组发生的变化,和化学因素,如地塞米松已报告负责(59]。
因此,另一个如骨矿化成骨的标志是评估(60]。l型压敏电阻器Ca2 +通道(VDCCL)有助于成骨细胞功能活动,也存在于msc、成骨分化中起着重要的作用[61年]。因此,Ca的存在2 +存款与成骨分化细胞培养4周媒体分析了茜素红染色。mg - 63细胞与茜素红染色显示大Ca的存在2 +强烈的红色的存款。hADSCs相同的染色观察,但较小的存款比mg - 63细胞,表明矿化程度较低。在hDPSCs、大型彩色领域观察但强度较低,这表明中等沉积的Ca2 +不同意Ravichandran et al。55),报告大额存款。这可能是由于我们的种子细胞培养皿,与扩散能力。
然后,成骨基因表达的分析是由实时rt - pcr的方法。细胞培养与分化成骨的媒体是与那些与增殖培养基培养相比,作为一个控制参考。mg - 63细胞与成骨分化培养媒体表明BGLAP表达增加的2和3周,骨钙蛋白编码,一个特定的标记蛋白对成骨细胞成熟,因为它是专门合成的细胞类型(62年]。在3个星期,有轻微增加RUNX2的表达和MTCO1 mg - 63细胞。虽然RUNX2参与的承诺MSC成骨的血统(63年),MTCO1与前列腺素生产在稳态条件下,起着重要的作用在骨(64年]。2周后成骨分化的文化媒体,hADSCs BGLAP显示表达式,CSF1, RUNX2。CSF1负责诱导osteoclastogenesis和抑制成骨细胞的骨形成过程65年]。hADSC文化3周后,BGLAP表达维护与IBSP将骨涎蛋白编码基因的表达,发挥着重要的作用在骨矿化62年]。最后,hDPSCs培养2和3周成骨分化媒体显示增加基因标记BGLAP IBSP, SPP1。SPP1编码骨桥蛋白,成骨细胞成熟的一个重要蛋白质,因为它参与的过渡preosteoblast成骨细胞(66年]。
简单地说,商业MesenCult成骨分化培养基提升更高的提高成骨基因标记,如RUNX2 BGLAP, IBSP相比扩散介质或BMP2-supplemented成骨分化培养基。然而,BMP2-supplemented介质显示高值的增加成骨分化后3周的文化。出于这个原因,尽管商业媒介提高早期细胞分化,成骨培养基可用于成骨分化的msc。
一旦hADSCs的成骨分化潜能和hDPSCs研究了在二维模型中,这些细胞被培养在3 d环境中分析其成骨的潜力在机械结构和形态相似的骨头。最初,解放军被选为材料用于制造支架,由于其可用性的可生物降解的聚合物组织工程(25]。Resorbable等生物材料作为骨组织工程的解放军有很多优势,包括能力释放物质,如药物或生长因子为了增加osteointegration植入材料(67年]。从这个意义上说,有可能设计一个支架的基础上,提出了一个处理释放BMP2的能力。由于上述原因,中国人民解放军是用来打印支架使用3 d打印机。支架结构设计照顾孔隙度、价值的55%,这类似于人骨的50 - 90%孔隙度(10]。支架的表征表明,孔隙度的百分比非常相似的关于拉伸变形的百分比值。此外,细胞毒性试验保证这种材料是无害的。
细胞培养与海藻酸水凝胶在PLA支架下提高成骨分化能力的细胞研究。的有效性alginate-based水凝胶是在大量的再生过程(42,68年,69年]。经过3周的mg - 63细胞培养,OC表达式中检测出细胞在增殖和成骨分化培养媒体。然而,hADSCs和hDPSCs显示OC表达成骨分化媒体而不是扩散介质,像以前观察到在2 d的文化。其他重要的观察是mg - 63细胞的数量的增加和hDPSCs观察到文化在3 d环境中。细胞密度的关键因素之一,影响骨骼的再生组织,由于细胞增殖以及分化的重要性在组织工程。在这方面,比hADSCs hDPSCs显示更好的结果。
因此,这项研究的结果证明hADSCs的功效和hDPSCs骨组织再生疗法,由于他们足够的扩散和再生能力。此外,我们提出一个新领域的研究,因为没有先前的研究我们的知识,比较不同成骨细胞类型和刺激。这个特性是至关重要的找到最合适的培养条件,以实现最优的成骨分化状态,从而确保有效性在活的有机体内治疗。
5。结论
成骨分化在体外已经成功地实现了2 d文化中两个媒体分析,第一个从干细胞技术和第二个BMP2的补充。这是证实通过评估成骨的标记与基因的表达分析技术使用实时rt - pcr和免疫染色。我们证明了培养基的组成直接影响msc的成骨分化过程的效率,MesenCult是最合适的培养基hADSCs和hDPSCs BMP2-supplemented媒介。之间的显著变化已经被证明这两种类型的细胞,孵化在同一培养基在同样的条件下。
最后,根据文献,3 d模型提高生存和成骨诱导msc。然而,进一步的实验结果与二维文化将3 d之前是必要的,以保证这一过程的有效性。随后,它也将成为重要的考虑一些材料的适用性用于制造3 d结构,以及一个不错的选择的动物模型在活的有机体内应用程序。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果都包含在这篇文章。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突有关的出版。
作者的贡献
莎拉Martin-Iglesias贡献和劳拉·米利安同样的手稿。
确认
这项工作是由格兰特(pid2019 - 106099 - rb -促)(毫米)从经济产业省和西班牙政府的竞争力和格兰特(PROMETEO / 2020/069) (CC)的地方政府Comunitat Valenciana(西班牙)。CIBER-BBN和CIBERER由VI国家R&D&I计划2008 - 2011,Iniciativa 2010年甘蔗,Consolider计划,cib行动,和学院祝您健康卡洛斯三世,欧洲地区发展基金的援助。