文摘

人类诱导多能干细胞(hiPSCs)可以有效地分化成心肌细胞(CMs),可用于心脏疾病建模、药物筛选和再生心肌受损。xeno-free文化系统的实现是至关重要的全面探索这些细胞的潜力。然而,分化使用xeno-free粘附矩阵往往导致低厘米收益率和缺乏功能性厘米表,能够持久的额外的成熟阶段。在这里,我们建立了一个分化平台使用TeSR / Synthemax xeno-free厘米,包括金属堆焊步骤,结合两个多功能净化/浓缩代谢的方法。结果表明,金属堆焊步骤是必要的重建一个完全集成的、紧密厘米表。此外,金属堆焊导致cTnT表达式从65%增加到75%,2.2 - 3.1厘米的输出每hiPSC比得上效率观察到当使用TeSR /基底膜基质。此外,补充PluriSin1和Glu^{- - - - - -}虫胶⁺中允许增加CM内容80%以上的前提下CM表完整性或功能。因此,这个xeno-free分化平台是一个可靠和健壮的方法生产hiPSC-derived CMs,增加使用这些细胞的可能性范围广泛的应用程序的安全。

1。介绍

心血管疾病(心血管病)是全球死亡的头号杀手,2019年与1790万相关死亡对应全球总死亡人数的32%,为世界卫生组织估计的1]。从这些中,85%是由于心脏病发作或中风。在严重的缺血性事件中,心脏左心室可以减掉10⁹十亿心肌细胞(CMs) (2]。此外,心脏组织提供了一个非常低的再生能力(3,4]。因此,心肌再生一次严重的心脏病发作之后需要外部源的CMs。

人类诱导多能干细胞(hiPSCs)可以产生多种功能细胞与再生医学应用潜力巨大(5]。CMs是其中最有前途的hiPSC-derived细胞和可用于疾病建模、药物筛选和作为治疗受损的心脏组织细胞来源(6- - - - - -8]。在过去几年,多个临床试验已经开始使用人类胚胎干细胞(hESC)派生心脏祖细胞(9]或hiPSC-derived心肌细胞(hiPSC-CMs) [10)(NCT04396899,NCT03763136,NCT03759405),主要依靠工程心脏补丁或细胞表。然而,对于这些治疗的安全和标准临床实现,优化培养条件,无动物成分,及其集成净化步骤是至关重要的。

维护和分化hiPSCs通常使用人工基底膜执行(或Geltrex),一个未定义的混合基底膜基质蛋白质提取Engelbreth-Holm-Swarm老鼠肿瘤。这些定义的质量和构成矩阵可以从很多很多不同,为临床应用提供安全问题由于动物病原体污染的风险和免疫原11,12]。Chemically-defined和xeno-free矩阵,如vitronectin [13,14],Synthemax [15)——vitronectin多肽和层粘连蛋白(16),可以作为替代品。然而,hiPSC心脏分化诱导整合素表达的变化,这通常会导致细胞分离从这种类型的chemically-defined矩阵(17- - - - - -19]。因此,策略来减轻细胞分离在xeno-free hiPSC心脏分化培养系统是必要的。

此外,细胞疗法基于人类多能干细胞(hPSC)的使用衍生品的风险相关的畸胎瘤的形成。因此,它是至关重要的有效的分化平台集成净化步骤,选择性地消除潜在的未分化hiPSCs可能留在文化。此外,净化和浓缩步骤,促进细胞表完整而微调CM比例至关重要,允许进一步与成熟过程的集成,重要的药物筛选和疾病建模应用程序(20.]。各种各样的方法,如流式细胞仪、mac电脑,或miRNA-responsive信使rna的结构,描述了可有效净化和/或浓缩hiPSC-derived细胞培养(21- - - - - -26]。然而,这些方法需要破坏细胞的表或hiPSCs基因操作。另一种方法是使用代谢净化/浓缩策略,选择性地消除hiPSCs探索代谢hiPSCs和hiPSC-derived细胞之间的区别。这提供了多种优于其他方法,因为这个方法方法允许无缝集成与差异化协议。Ben-David等人表明hiPSCs可以有效地使用PluriSin1被淘汰,一个Stearoyl-CoA desaturase-1 (SCD1)抑制剂,没有显著影响成熟细胞(27]。同样,Tohyama等人报道的方法净化心脏文化,加强CM百分比和消除其他细胞,包括hiPSCs,通过消除葡萄糖的培养基和乳酸取而代之28]。

在这里,我们描述的集成xeno-free hiPSC心脏分化平台,基于先前建立的WNT信号调制协议,可调两步代谢净化/浓缩阶段,使用PluriSin1和乳酸glucose-free中补充。障碍伴有严重的细胞分离时使用xeno-free涂料克服了使用金属堆焊一步,这增加了CM产量和重建CM表结构完整性。hiPSC-CMs派生xeno-free条件下表现出一定程度的成熟与以前公布的结果(20.)的接合金属堆焊与两个代谢净化/浓缩步骤没有hiPSC-CM功能产生负面影响。

2。材料和方法

2.1。人类诱导多能干细胞的文化

在这部作品中,hiPSC细胞系iPS-DF6-9-9 T。使用B,从WiCell银行购买。该细胞系向量自由和来自包皮成纤维细胞核型46,XY。维护hiPSC文化进行使用mTeSR1媒介(干细胞技术)6-well组织培养板涂层与基底膜基质(BD生物科学)稀释1:30在DMEM / F12。分化之前,hiPSCs改编在同一个xeno-free文化系统用于分化通过TeSR2介质(干细胞技术)或基本8介质(热费希尔科学)。盘子被涂上一层Synthemax II-SC(康宁),合成vitronectin-based肽,浓度为5μ克/厘米²Vitronectin XF(干细胞的技术),定义人类重组蛋白,在浓度为1.25μ克/厘米²或从鼠源层粘连蛋白(σ)的浓度2.5μ克/厘米²。Enzyme-free使执行使用EDTA(热费希尔科学)在PBS溶液稀释浓度为0.5毫米。细胞培养与EDTA在室温和5分钟刷新培养基。对于细胞计数,一个100年的样本μL 400年孵化μL (Accutase 7分钟在室温和台盼蓝样本稀释。相衬图片获得使用徕卡DMI 3000 b显微镜和数码相机尼康DXM 1200。

2.2。人类iPSC-Cardiomyocyte分化、金属堆焊和净化

人类细胞则被播种密度 细胞/厘米²和维护与日常媒介变化在多能状态条件下。在95%左右confluency, hiPSC心脏分化诱导了适应以前描述的WNT信号调制协议(29日]。通过使用CHIR99021 WNT信号调制,激活WNT信号通过抑制GSK3-mediatedβ和使用IWP4连环蛋白降解,抑制WNT分泌和活动通过防止WNT棕榈酰化的豪猪。金属堆焊的一步,细胞分离板的6天使用EDTA和RPMI / B27 -胰岛素的媒介。细胞被山肩板涂上vitronectin或Synthemax比例从1:1 - 1:3。净化步骤是由补充RPMI / B27 -胰岛素介质与20天6μM PluriSin1(开曼)。对于净化/浓缩,RPMI / B27介质在12天改为RPMI没有葡萄糖(热费希尔科学)补充4毫米的钠L-Lactate(σ)。

厘米的输出是根据方程来计算: 在这对应的总数可行的细胞数在15天,用台盼蓝法,乘以细胞的百分比表达cTnT获得最终的CMs和除以的数量 ,这对应于最初播种hiPSCs的数量。最后一厘米得到金属堆焊过程的对应数字的总和CMs获得所有分裂源于最初的山肩。

2.3。流式细胞术

与PBS和心脏细胞被洗床单使用0.25%(使单一化 )trypsin-EDTA(热费希尔科学)。Trypsin-EDTA中和使用RPMI / 20%的边后卫的媒介。细胞被固定使用2% ( )多聚甲醛在室温下(PFA) 20分钟。然后,细胞被离心机和resuspended 90% ( )冷甲醇,孵化15分钟在4°C。样本然后洗3次使用0.5%的解决方案( )BSA在PBS (FB1)。老鼠单克隆免疫球蛋白主要抗体心肌肌钙蛋白T (cTnT)(热科学、克隆骁将)稀释1:250年FB1 + 0.1% ( )卫(FB2)和孵化1 h在室温下。细胞被洗FB2和细胞颗粒与山羊resuspended anti-mouse alexa - 488二级抗体(热费希尔科学)稀释1:1000年FB2和孵化在黑暗中30分钟。细胞被洗两次,和细胞颗粒在500年resuspendedμL的PBS和分析FACSCalibur流式细胞分析仪(正)。数据分析使用FlowJo (v10 FlowJo LLC)。

2.4。实时聚合酶链反应

提取RNA从每个条件和控制使用高纯RNA隔离设备(罗氏)制造商的指示。RNA是量化使用nanodrop和1μRNA的g转换为互补使用高容量cDNA逆转录工具包(热费希尔科学)。相对基因表达是评估使用10 ng cDNA,每个引物(表的250海里S1),使用快速SYBR绿色主人混合(热费希尔科学)与一个退火温度设置为60°C。融化曲线进行最终评估如果引物放大只有正确的扩增子。值治疗后2^{- - - - - -ΔΔCT}方法。GAPDH基因表达作为内生控制和相对的微分表达式校准使用天0。

2.5。免疫荧光染色法和共焦显微镜

共焦显微镜的样品由金属堆焊hiPSC-CMs在盖玻片(没有。1,VWR) 24-well板井内。24小时后,细胞被固定为4% ( )PFA 15分钟,用PBS和孵化屏蔽解决方案(10% ( )门店,0.1% ( )在PBS Triton-X) 1 h。孵化后,cTnT老鼠免疫球蛋白抗体(热科学、克隆骁将)稀释1:250年染色溶液(5% ( )门店,0.1% ( )在PBS Triton-X)在室温下和孵化2 h。与PBS洗涤后,二次抗体山羊anti-mouse免疫球蛋白alexa - 488(热费希尔科学)稀释1:500年染色溶液在室温下和孵化1 h。细胞与PBS然后洗2次,孵化为2分钟3μ克/毫升的DAPI稀释在PBS和洗3次。然后,盖玻片的CMs是由薄板(没有。1,VWR), hydrated with antifade mounting medium (Vectashield, Vector Labs) and sealed with varnish.

激光共焦扫描显微镜(CSLM)和双光子激发用莱卡TCS SP5共焦图像获得倒置显微镜(DMI6000) 63.3 x水浸复消色差的目的(1.2数值孔径)。alexa使用488 nm - 488激发了氩离子激光器的线,和荧光发射收集500 nm和560 nm之间使用可调系统和徕卡TCS SP5分束器。DAPI激励是通过使用多光子激发Ti:蓝宝石激光(Spectra-Physics美态BB, 710 - 990 nm)作为激励源设置为780海里。DAPI荧光发射收集400 nm和478 nm之间。激光强度是由一个acoustic-optical过滤器控制系统。图像处理使用ImageJ /斐济(http://fiji.sc)[30.]。薄丝(cTnT)长度测量是使用另外执行软件,如前所述[20.]。

2.6。钙成像

细胞上的山肩Matrigel-coated 8-wellμ幻灯片使用EDTA (Ibidi)。48小时后,钙瞬变测量使用Fluo-4直接测定钙工具包(热费希尔科学)。Fluo-4 prewarmed在37°C和加载到细胞通过添加同等体积的培养基中。细胞培养在37°C为30分钟。在实验中,使用化学受体受体激动剂,盐酸异丙肾上腺素(σ)或氯化carbamoylcholine(σ)被稀释在prewarmed Fluo-4解决方案和加载到细胞的最终浓度1μ在37°C m细胞孵化15到30分钟。

样品测定使用先前描述的共焦显微镜和干燥的目的 (数值孔径为0.40),获得的图像的分辨率 ,与700 Hz的扫描速度和帧间隔97毫秒的在60 - 120秒。Fluo-4励磁使用488纳米线进行了氩离子激光器和荧光发射收集(500 - 650 nm)使用徕卡海德拉巴混合探测器。样本测量后4 - 5分钟内离开孵化器通过一组加热阶段在37°C维持温度之前和期间的测量。

2.7。数据和统计分析

使用方差分析来评估数据和统计分析进行总体差异多个数据组和未配对的双面韦尔奇的 - - - - - -测试具体比较两组。值低于0.05被认为是统计学意义(值< 0.05,值< 0.01,值< 0.001)。

3所示。结果

3.1。WNT信号激活的影响加上粘附基质对心肌细胞产量和单完整定义

我们开始通过适应心脏分化协议从丽安et al。29日),不同的文化系统和具体模型hiPSC线用于这项工作,通过优化WNT信号激活的步骤。事实上,这是一个心脏分化再现性的关键因素,因为不同hiPSC线可以将不同水平的内生WNT信号组件和变化在细胞循环配置文件,从而导致不一致的反应文化条件和信号调节器(31日]。为此,我们筛选对分化的影响效率的初始浓度CHIR99021 (CHIR)通过测量心肌细胞标记的表达cTnT在15天的区别,使用流式细胞仪(图1(一))。所有条件,CHIR / 8的浓度μM /分离导致毒性和细胞死亡。此外,第一个7天的承诺,增加细胞死亡,重塑,和细胞表重组(视频S1)。

两个文化系统,TeSR /人工基底膜和TeSR / Synthemax, 6μM CHIR透露的最佳浓度厘米分化,导致cTnT阳性细胞的平均为67%和65%,分别为(数字1 (b)和1 (c))。系统TeSR /基底膜基质,6μM CHIR导致心脏表(视频的形成紧密地联系在一起S2),而7μ米和8μM常常导致宽松的表。TeSR / Synthemax 7μ米和8μM CHIR导致减少或缺乏细胞数量与CM的表现型。此外,在使用xeno-free系统的主要挑战之一TeSR / Synthemax严重分离的细胞,在暴露于化学抑制剂,主要分化效率高(视频时S3)。这个结果也观察到当vitronectin或层粘连蛋白(图使用S1A和印地)。此外,替换TeSR E8导致相似的分化效率当基底膜基质(图就是S1C)。然而,一个非常重要的分化效率的降低是观察当基底膜基质被Synthemax取代,导致6.4%的平均cTnT当6阳性细胞μM CHIR(图S1D)。因此,由于厘米和整体表超然,分化产生TeSR / Synthemax明显减少,导致2.2厘米/播种hiPSC与3.4相比TeSR /基底膜基质文化系统(图1 (d))。

3.2。金属堆焊恢复心脏表完整性Xeno-Free条件和改善心肌细胞输出

解决这一问题的细胞分离xeno-free涂料使用时,我们假设一个金属堆焊步骤可以结合差异化协议重新分配前细胞分离事件的发生。自抑制WNT信号的基因表达增加ISL1和NKX2.5,我们预期的出现心脏祖细胞(年度"特别关注国")在第五天(图文化S1E和S1F)。因此,金属堆焊文化过程中的步骤是集成在一天6的区别(图2(一个)),因为我们假设年度"特别关注国"是最好的人口的利益最大化金属堆焊一步由于年度"特别关注国"公认的增殖能力和心脏multipotency [32]。这一步可能会让心脏表的数量的增加,CM产出和重建的CM表当xeno-free矩阵(图使用2 (b))。

系统TeSR /基底膜基质,将金属堆焊一步的分流比1:2或者1:3(图没有明显影响分化效率2 (c))。另一方面,对于TeSR / Synthemax,分流比为1:1重建细胞表和导致显著增加从65%到75%的cTnT表达式在15天而控制没有金属堆焊(图2 (d))。类似的影响观察E8 /人工基底膜(图S1G)。此外,金属堆焊允许显著增加的厘米每播种hiPSC产出系统,增加,对于TeSR /人工基底膜,从3.4到4.8或4.7(图2 (e)),如果金属堆焊在执行1:2或1:3,分别增加,对于TeSR / Synthemax,从2.2到3.1或4.3(图2 (f)),如果细胞被山肩1:1或1:2,分别。类似的观察增产E8 /人工基底膜,从3.4到4.8(图S1G),如果金属堆焊在执行1:2。因此,总的来说,引入金属堆焊步骤允许重建的心脏表xeno-free文化条件下,并显著增加CM输出。

3.3。集成一个两阶段的净化和浓缩协议

除了金属堆焊,两步纯化和浓缩在分化综合平台的目标消除潜在剩余的未分化hiPSCs也作为一个可调的CMs工具控制百分比表在不损害表结构的完整性,这是至关重要的长期成熟(20.]。这是通过补充Plurisin1的培养基,专门消除hiPSCs通过抑制油酸生物合成(27,33),结合使用glucose-free介质补充乳酸(Glu的4毫米^{- - - - - -}虫胶⁺),它利用生化差异的CMs与其他细胞类型相比,特别是hiPSCs有效代谢乳酸通过氧化磷酸化产生能量(28]。

PluriSin1和Glu^{- - - - - -}虫胶⁺策略,独立使用时,成功地消除了hiPSC殖民地在不到48 h(图S2A)。使用单引号或双剂量的20倍μM PluriSin1不影响cTnT百分比的节目文化没有金属堆焊(图开通),尽管双剂量往往导致细胞死亡金属堆焊时(图执行S2C)。另一方面,Glu^{- - - - - -}虫胶⁺有时间对分化的影响没有金属堆焊(图S2D比48 h),尽管长时间曝光导致细胞死亡和损失的增加CM表结构完整性,独立于涂层材料(图使用S2F)。与金属堆焊,尽管减少cTnT表达不明显(图S2E),细胞死亡和细胞板分离已经观察到48 h和CM输出(图上产生重大影响S2G)。因此,纯化的步骤使用Plurisin1集成在文化平台在6天,与金属堆焊,最大化假设hiPSCs接触毒品。此外,净化和Glu /浓缩^{- - - - - -}虫胶⁺在48小时执行文化没有金属堆焊和在24小时山肩文化,在12天,击败后表型观察,证实了CMs的存在能够承受glucose-free媒体的影响和乳酸作为能源的使用(图3(一个))。

接合的纯化步骤,使用PluriSin1和Glu^{- - - - - -}虫胶⁺(损益表),导致在cTnT阳性细胞显著增加了这两个文化系统TeSR /人工基底膜和TeSR / Synthemax,而山肩的增加并不显著的文化,可能是由于潜在的人口现象选择金属堆焊步骤(所提供的数据3 (b)- - - - - -3 (c))。对于TeSR /基底膜基质,损益表导致增加的百分比从67% cTnT阳性细胞,控制,85%(图3 (b))。TeSR / Synthemax,损益表导致从65%增加,控制,82%(图3 (c))。此外,金属堆焊过程中共轭与损益表导致显著增加CM输出两个系统(数据3 (d)和3 (e))。TeSR /基底膜基质,CM输出从损益表的3.0增加到6.3,损益表与金属堆焊的分流比1:2(图3 (d))。TeSR / Synthemax厘米输出从损益表的1.6增加到2.6,损益表与金属堆焊1:1(图3 (e))。类似的结果观察E8 /人工基底膜(图S2H -我)。执行文化的影响没有金属堆焊(视频S4)和金属堆焊(视频S5),有或没有损益表一步,心表的完整性很容易被肉眼观察到。

3.4。评估hiPSC-Derived成熟心肌细胞结构和功能

最后,CMs在结构上和功能上分析了30天的文化。CMs的混合人口和不结盟观察心脏纤维(图保持一致4(一))。薄丝长度测量在30天平均是1.09μm(图4 (b)),这是符合我们组发表的结果之前的长期成熟hiPSC-CM表(20.]。引入金属堆焊和损益表步骤无显著影响钙瞬态配置文件(图4 (c))。代表钙概要文件获得CMs可以观察到金属焊补图4 (d)。异丙肾上腺素反应,β肾上腺素能受体激动剂,增加心跳频率,导致收缩关闭的样本。虽然有些细胞表保持跳动的表型,他们展示了心律不齐的行为,如在图4 (e)强调,正如所料,不成熟的hiPSC-CMs在这个阶段的成熟过程20.]。氯化氨甲酰胆碱、毒蕈碱的受体激动剂,降低收缩频率,没有完全恢复跳动表型的关闭。此外,当使用碳酰胆碱第一,没有异丙肾上腺素,显著降低频率没有被观察到。总的来说,这些结果显示无显著差异的CM成熟CMs之间有或没有获得金属堆焊和有或没有净化/浓缩步骤。正如预期的那样,在这个阶段分化的过程中,一定程度的结构和功能不成熟仍然存在。

总之,这些结果表明文化平台的成功开发的差异化hiPSC-CMs xeno-free条件下,将金属堆焊一步,重建心脏表,可调hiPSC工具损耗和心肌细胞浓缩,同时保持细胞表的完整性,对于进一步hiPSC-CMs长期成熟,CM功能。

4所示。讨论

近年来,潜在疗法依靠hiPSC-CMs和心脏祖细胞被引向临床研究。然而,缺乏高效xeno-free分化平台集成方法有选择地消除未分化hiPSCs会阻碍这些治疗方法的安全性。这项工作的重点是建立和优化xeno-free心脏分化与净化/浓缩步骤集成平台。首先,我们使用Synthemax优化心脏分化过程,商用,chemically-defined, xeno-free粘附涂层,在接合金属堆焊的一步。其次,我们与代谢综合xeno-free分化方法净化/浓缩方法通过优化Plurisin1和Glu的补充^{- - - - - -}虫胶⁺媒介。我们的研究结果表明,xeno-free分化平台集成了两个净化/浓缩步骤能够产生结构集成2.6厘米,内部收益率hiPSC-CMs每hiPSC。

我们研究开发以来限制xeno-free平台我们专注于分化效率和CM输出,同时保持厘米表的完整性。的一个关键的限制我们的研究是缺乏一个畸胎瘤试验,这是需要评估代谢净化/浓缩方法的效率。没有一个完整的描述的心脏单内容关于noncardiomyocyte细胞也应该注意到,特别是血管和基质细胞,这将提供额外的信息功能。此外,执行功能的研究是有限的,更详细的成熟度的hiPSC-derived CMs将增加进一步的见解,特别是测量关键重要的表达calcium-handling蛋白质,代谢变化,评估和线粒体的成熟。

xeno-free平台的关键步骤之一是心脏的金属焊补单严重脱离发生之前,自脱离导致较低的厘米厘米功能的输出和损失。部分分离心脏组织通常最终折叠在自己,创造显著的细胞质量停止收缩,几天后失去生存能力的文化。金属堆焊过程中完全恢复心脏表在6天,后心脏承诺达成年度"特别关注国"阶段(32),必须增加CM产出和分化效率。布里奇等人也观察到超然的分化细胞xeno-free涂料使用时,除了人类重组层粘连蛋白的存在,它仍然是一个昂贵的涂料解决方案(18]。hESC和派生CMs表达类似的整合蛋白亚型(17,19]。细胞与基底膜基质结合和层粘连蛋白主要是由α6β1整合蛋白,而绑定vitronectin Synthemax是由αVβ5整合蛋白(17),有10倍的低亲和力(16]。附件主要是在损失或CHIR和IWP4曝光后,可与整合素水平的变化表达和细胞应激期间可能发生的承诺对心脏中胚层(18]。

除了金属堆焊的步骤中,我们综合xeno-free分化平台使用代谢与两步净化/浓缩的策略。这两种方法与PluriSin1和Glu补充使用^{- - - - - -}虫胶⁺之前显示,为了防止独立,形成畸胎瘤(27,28]。Ben-David等人报道,混合文化的差异和分化hPSCs补充20μM连续两天PluriSin1阻止畸胎瘤的形成(27,33]。类似于我们观察hiPSCs Tohyama等人报道,24 - 48 h (Glu)^{- - - - - -}虫胶⁺媒介就足以完全妥协的可行性鼠标已经和noncardiomyocyte人类细胞系,如HepG2和主要培养外周淋巴细胞(28]。人类PSC-derived拟胚体,作者用Glu-Lac + 6天CMs的比例获得最大化(28]。胚状体身体分化产生分化细胞的混合人口,导致可怜的收益率和多种细胞类型污染物(34]。分化的平台,我们使用一个有效的主导作用的单层差异化协议依赖WNT信号(35]。假设,因此,高分化效率应该结果在较低比例的未分化的hiPSCs,也更容易受到代谢调节器在单层培养的环境(36- - - - - -38]。此外,我们更强调了细胞表的完整性,而不是调整Glu^{- - - - - -}虫胶⁺方法对CM纯度特别高。事实上,长时间的文化Glu^{- - - - - -}虫胶⁺会导致过度丧失生存能力noncardiomyocyte心肌细胞的极端重要性提供支持维护和派生hiPSC-CMs[的进一步成熟20.,28,39]。这种效果,我们的最适条件定义为20μ米PluriSin1和Glu^{- - - - - -}虫胶⁺48 h。使用金属堆焊时,差异化的文化更加敏感和毒性/分离观察如果这些方法的应用超过24小时的持续时间。PluriSin1 SCD1活动抑制,同样重要的是其他细胞类型和新生儿心肌细胞凋亡的抑制作用和活性氧生成(40]。因此,观察敏感性相关的山肩细胞PluriSin1可以无法抵消压力引起的操纵细胞,在接合较低细胞densities-higher exposure-led细胞死亡和顺向细胞板中断暴露在PluriSin1连续天。然而,耦合两种方法有潜力产生临床安全hiPSC-CM表。确认畸胎瘤形成预防和必要的优化,依靠净化方法的可调谐性选择,应该为每个特定的应用程序执行。

除了净化方法探索在这工作,其他代谢净化和浓缩hiPSC-derived心脏的文化策略,如使用高浓度的丙氨酸,可以探索(41]。此外,耦合代谢与代谢成熟净化和浓缩方法,如厘米代谢转向脂肪酸氧化,可以提供多个协同优势42- - - - - -44]。

如前所述,维护长期成熟心脏表的完整性是很重要的。成熟的一步是至关重要的发展可靠的疾病模型和药物筛选平台,因为不成熟hiPSC-CMs,缺乏成人CMs的生化结构和电生理学,会导致谨慎的结果(43,45- - - - - -47]。我们先前表明,长期的文化,120天,显著改善结构成熟厘米表(20.]。其他成熟的方法,如电刺激hiPSC-CMs,可能促进更快的成熟,原始CMs通过改进电生理学和钙瞬态配置文件(48- - - - - -52]。

5。结论

总之,我们成功地实现了一个xeno-free心脏分化平台通过引入和优化金属堆焊一步,导致结构综合心脏床单,分化产量的增加以及增加CM输出。此外,我们集成xeno-free分化平台有两个通用的净化和浓缩步骤,为了防止形成畸胎瘤,必要时hiPSC-CMs仅供在再生医学中的应用。我们的平台兼容长期文化,或其他成熟的方法,促进发展的进一步提高可靠的疾病模型和药物筛选平台。

数据可用性

数据支持本研究的结果可按照客户要求定制。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

T.P.D.写的手稿,设计了实验,收集,分析和解释数据。肺结核,协助数据收集和解释。S.N.P.,F.F.,M。P. assisted with confocal microscopy and calcium imaging. T.G.F., M.M.D., and J.M.S.C. contributed to data interpretation and experimental design. All authors critically revised and approved the final manuscript.

确认

这项工作是由国家企业管理学院帕拉基金会资金从Ciencia e Tecnologia (FCT;ip),在项目的范围/ 04565/2020的选答研究中心生物工程与生物科学研究所(iBB)和项目拉/ P / 0140/2020研究所联合实验室的卫生和Bioeconomy (i4HB)。t·p·迪亚斯得到了FCT (SFRH / BD / 78774/2011)。作者也承认葡萄牙平台的资金BioImaging (ppbi - poci - 01 - 0145 -菲德尔- 022122)的欧洲区域发展基金(菲德尔),通过里斯本的支线运营项目(PORLISBOA 2020)。

补充材料

补充表S1:用于实时PCR引物配对。补充图S1:优化心肌细胞分化和金属堆焊使用不同的文化系统。补充图S2:净化和浓缩步骤优化。补充视频S1:延时的第一个7天心脏分化使用Wnt信号协议。补充视频S2:心脏表获得使用6天15μm hiPSC CHIR诱导心肌分化的生长在Matrigel-coated盘子。补充视频S3:代表细胞和心肌细胞表超然的例子从盘子xeno-free涂料。补充视频S4:脱离肉眼观察到在15天的hiPSC Synthemax-coated板块分化使用6μM CHIR和有或没有接触净化和浓缩步骤。补充视频S5:金属堆焊1:1天6允许CM表的调整和收缩肉眼可见的15天。(补充材料)