文摘

发现了雪旺细胞促进骨生成的分子机制还不清楚。更好地理解雪旺细胞如何加速骨生成,RNA-Seq和质/女士被用来探索MC3T3-E1雪旺细胞的转录组和代谢反应。成骨分化是由高山染色。慢病毒是构造改变Mif的表达在雪旺细胞(巨噬细胞迁移抑制因子)。免疫印迹(WB)分析是用来检测蛋白表达。这项研究的结果表明,Mif必不可少的雪旺细胞促进骨生成,其下游CD74 / FOXO1也参与促进雪旺细胞在骨生成。此外,雪旺细胞在preosteoblasts调节氨基酸代谢和脂质代谢。这些发现公布雪旺细胞的机制,促进骨生成Mif在哪里的一个关键因素。

1。介绍

雪旺细胞被发现在骨生成有重要的作用。在开发期间,神经和雪旺细胞osteoprogenitor利基支持成骨分化的细胞导致新骨形成1]。在骨修复,几项研究已经发现,雪旺细胞可以用来促进骨生成TEB(组织工程骨)2,3]。此外,许旺细胞前体被发现有助于骨骼的形成在小鼠和斑马鱼胚胎发育期间(4]。雪旺细胞也发现在体外促进骨生成5]。然而,雪旺细胞如何促进骨生成的机理尚不清楚。

Mif是一个重要的炎性细胞因子参与组织保护和再生,如神经和肌肉(6- - - - - -8]。它可以与多种细胞合成;存储在细胞质中,如雪旺细胞;和释放与一个特定的刺激,如bacteria-derived代谢物和缺氧9]。Mif已发现中扮演重要角色的开发和修复骨骼;然而,它的作用在骨仍是有争议的。差异的发现可能导致刺激来自不同细胞(5,10]。

最重要的是,本研究将研究Mif在雪旺细胞促进骨生成的作用。此外,preosteoblast细胞的转录组和代谢反应和代谢组学、转录组之间的相关性进行了分析,了解雪旺细胞的机制及其Mif在促进骨生成。

2。材料和方法

2.1。细胞培养

雪旺细胞从老鼠收获坐骨神经与先前发表的方法(11]。24小时后初始镀和去除成纤维细胞孵化2 - 3天,阿拉伯糖苷(10⁵mol / L)添加到培养基中。coculture系统建立与six-well Transwell清楚聚酯膜插入与0.4μ孔隙大小(合演康宁,美国)。 雪旺细胞被镀在transwell插入; MC3T3-E1细胞组织培养板上镀。MC3T3-E1收获了RNA-Seq和LC-MC / MS coculture 3天后。

2.2。慢病毒载体

Mif击倒超表达病毒、慢病毒是由上海Genechem有限公司有限公司的Mif超表达慢病毒(lv-Mif), Mif序列克隆到Ubi-MCS-Cherry-SV40-puromycin。Mif击倒的慢病毒(sh-Mif), Mif的siRNA序列,克隆到U6-MCS-Ubiquitin-Cherry-IRES-puromycin CCTGCACAGCATCGGCAAGAT,慢病毒。

2.3。高山染色和活动

检测成骨细胞的分化,经过12天的商业套件coculture MC3T3-E1细胞成骨分化培养基(Cyagen muxmt - 90021), MC3T3-E1洗了PBS和彩色商业工具根据制造商的指令(σ,美国)。高山活动被高山活动工具包(P0321S Beyotime)。短暂,细胞细胞溶解和孵化显色底物和检测缓冲区在37°C 6分钟;孵化停在停止解决方案;然后,高山活动为405 nm。

2.4。RNA-Seq

RNA-Seq和RNA-Seq分析被执行之前报道(12]。删除适配器和低质量的读取,原始读取被首先修剪,然后映射到老鼠基因组与Hisat2 v2.0.5,和基因表达水平量化为已读计数生成与featureCounts v1.5.0-p3。DESeq2 R包(1.16.1),当时基因差异表达分析。

2.5。没有针对性质/女士

没有针对性与UHPLC质/ MS分析系统(击败,热费希尔科学)UPLC本·酰胺列( ,1.7μ米)耦合到Q Exactive HFX质谱仪(Orbitrap MS,热)。流动相由25更易与L醋酸铵和25在水中氢氧化氨( )(A)和乙腈(B)。autosampler温度和注射4°C的3μl

QE HFX质谱仪用于其能力获得MS / MS谱在information-dependent收购(IDA)收购的模式在控制软件(Xcalibur热)。收购软件在这种模式下不断评估全扫描质谱。ESI源条件设置为:30 Arb鞘气体流量、25 Arb辅助气体流量,对毛细管温度350°C, 60000女士完全分辨率,分辨率为7500 MS / MS, 10/30/60指标模式的碰撞能量,和3.6 kV(积极)喷涂电压或-3.2 kV(负面),分别。

原始数据被转换为mzXML格式ProteoWizard和处理内部程序,开发与R和基于XCMS峰值检测、提取、对齐和集成。然后,内部一份数据库(BiotreeDB)应用于代谢物注释。截止为注释被设定为0.3。

2.6。实时定量rt - pcr (qPCR)

从细胞总RNA纯化使用试剂盒(表达载体,15596026),使用'脚本reverse-transcribed™RT大师混合(豆类、日本),并使用Taq SYBR绿色能源受到qPCR PCR大师混合(表达载体,A25777) CFX96™实时系统(Bio-Rad)。Gapdh是作为内部控制。引物序列如下:高山前进:CACGTTGACTGTGGTTACTGCTGA和反向:CCTTGTAACCAGGCCCGTTG;Col1a1转发:GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC和反向:GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA;Osx转发:TGACTGCCTGCCTAGTGTCTACA和反向:TGGATGCCCGCCTTGT;Runx2转发:CATGGCCGGGAATGATGAG和反向:TGTGAAGACCGTTATGGTCAAAGTG;和Gapdh前进:ATGTGTCCGTCGTGGATCTGA和反向:ATGCCTGCTTCACCACCTTCTT。

2.7。免疫印迹

进行预处理细胞聚集在冰和细胞溶解里帕裂解缓冲。蛋白质分离Bis-Tris 4% - -12%聚丙烯酰胺凝胶和转移到PVDF膜。一夜之间,这些墨迹被孵化与初级抗体在4°C,然后二次抗体。以下主要抗体采用:肌动蛋白(Servicebio GB12001;1:1000);Aldoc (Proteintech, 14884 - 1 - ap 1: 5000);CD74 (bios、bs - 2518 r, 1: 2000);CYP51 (Proteintech, 13431 - 1 - ap 1: 5000);EBP (Proteintech, 15518 - 1 - ap 1: 1000);ENO2 (Servicebio GB11376 1: 1000); FDFT1 (Proteintech, 13128-1-AP, 1 : 1000); FOXO1 (Servicebio, GB11286; 1: 2000); Gapdh (Proteintech, 60004-1-Ig, 1 : 20000); Gpi1 (Proteintech, 15171-1-AP, 1 : 1000); Hif-1a (Servicebio, GB111339, 1 : 1000); Mif (Proteintech, 26992-1-AP, 1 : 1000); NSDHL (Proteintech, 15111-1-AP, 1 : 1000); PFKL (abcam, ab181064, 1 : 5000); Pgk1 (abcam, ab199438, 1 : 2000); PKM (abcam, ab150377, 1 : 5000); p53 (Proteintech, 10442-1-AP, 1 : 1000); Tpi1 (abcam, ab196618, 1 : 1000).

2.8。统计分析

GraphPad棱镜8.0.1 (GraphPad软件,LLC)是利用统计分析量化高山活动。的 所有实验记录。两组之间的统计学意义与学生的评估 - - - - - -测试。值< 0.05被认为具有统计学意义。微分基因和微分代谢物的内容是用来提供转录组和代谢组的相关性。斯皮尔曼相关分析中使用值< 0.05被认为具有统计学意义。

3所示。结果

3.1。Preosteoblast许旺细胞的转录组的反应

在骨生成研究雪旺细胞的影响,我们cocultured雪旺细胞和MC3T3-E1。雪旺细胞被immunofluorescent特征识别和目标标记S100和GFAP染色(补充图S1a)。正如前面发表(13,14雪旺细胞,促进成骨细胞的分化(数字1(一)- - - - - -1 (e))。RNA-Seq显示,雪旺细胞可以调节多个基因的表达在MC3T3-E1(图1 (f)),200转录调节和391转录表达下调(图1 (g))。差异基因的聚类分析(图进行治疗1 (h))。KEGG路径分析显示20个最重要的丰富通路(图1(我)),包括矿物质的吸收,主要是由破骨细胞。它表明,雪旺细胞可以调节成骨细胞和破骨细胞耦合和矿化。除此之外,最丰富的途径还包括细胞周期,细胞具备干细胞,和信号通路包括p53和HIF-1和新陈代谢,如糖酵解,类固醇生物合成、氨基糖和核苷酸糖代谢。然后,我们研究了preosteoblast雪旺细胞的代谢反应。

3.2。Preosteoblast许旺细胞的代谢反应

没有针对性质/女士进行研究preosteoblast许旺细胞的代谢反应。后cocultured与雪旺细胞代谢物在MC3T3-E1改变在很大程度上(图2(一个))。数据采集是在正面(POS)和负面(底片)离子模式(数据2 (b)- - - - - -2 (d)并补充图S2)。所有样品的色谱正(POS)和负(底片)离子模式如图2 (b)并补充图S2。代谢途径分析的结果通过泡沫图(图所示2 (e)),改变了代谢产物主要是富含“氨基酸代谢”;亚油酸的新陈代谢(属于脂肪酸代谢)由雪旺细胞也显著升高。然而,没有明显葡萄糖代谢的变化。经过进一步的功能注释差异代谢物积累和KEGG数据库,重要的代谢物变化也富含氨基酸代谢(图3,变焦地区),如精氨酸生物合成(底片,POS);半胱氨酸和蛋氨酸代谢(POS);甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢(POS);缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成(否定)。

3.3。代谢和转录组的反应之间的相关性Preosteoblast雪旺细胞

在进一步的分析中,我们研究了微分代谢物和基因之间的相关性。微分记录选择从以下途径:果糖和葡萄糖代谢包括糖酵解/糖质新生和甘露糖代谢;脂肪酸代谢包括类固醇生物合成;信号通路包括p53、HIF-1 FOXO信号通路;和矿物质的吸收(补充图S3)。微分代谢物被从顶部和显著差异(补充图16代谢物S3)。所有的微分成绩单和代谢物选择相关分析补充图所示S3。相关分析是基于微分成绩单和代谢物(图的内容4)。微分代谢物是高度相关的信号通路与最大数量的显著相关性p53信号通路在POS模式和最大数量的显著相关性FOXO1信号通路在底片模式。

3.4。Mif雪旺细胞促进骨生成

Mif在雪旺细胞是一个关键的趋化因子在神经再生(15,16]。阻塞Mif在许旺细胞大大减少神经突产物(17]。Mif也被发现是促进成骨细胞分化[5]。然后,我们探索Mif在雪旺细胞促进成骨细胞分化的作用。首先,确认是否可以释放Mif雪旺细胞,我们进行ELISA,发现一个剂量反应曲线的Mif在应对越来越多的SN(图4(d))。因此这些结果证明Mif与雪旺细胞分泌的因素。然后,我们研究了Mif在雪旺细胞的作用促进骨生成;Mif在雪旺细胞过表达或表达下调慢病毒(补充图S4a),慢病毒载体并不影响雪旺细胞对骨生成的函数(补充图S4b)。我们可以发现,过度的Mif可以显著提高雪旺细胞的能力促进骨生成,Mif明显变弱的差别而对这些雪旺细胞促进骨生成的能力(数据5 (b)和5 (c))。

CD74 Mif的主要受体(18]。世行结果表明CD74表达式MC3T3-E1细胞增加了雪旺细胞,和CD74已经改变后Mif的表达过度(差别/对这些数字5 (f)和5 (h))和一个一致的趋势。RNA-Seq结果,Hif-1a、p53和FOXO1信号通路是最杰出的途径参与对雪旺细胞,促进骨生成。根据世行结果,Hif-1a和p53的表达是由雪旺细胞表达下调,但他们的表达是不一致的与雪旺细胞及其Mif促进骨生成。FOXO1调节是由雪旺细胞,其表达变化符合Mif / CD74信号的变化轴当雪旺细胞促进骨生成。自FOXO1是一个转录因子,细胞核FOXO1水平也是衡量,和因子表达的变化也符合Mif / CD74信号的变化轴当雪旺细胞促进骨生成(数字5 (g)和5(h))。最重要的是,雪旺细胞促进骨生成的信号通路Mif / CD74 / FOXO1。

根据RNA-Seq结果,葡萄糖代谢有微分成绩单(糖酵解/糖质新生和gluctose和甘露糖代谢)和脂肪代谢(类固醇生物合成)。然后,WB进行检测的表情反应微分因素在类固醇生物合成(图5 (d))和糖酵解/糖质新生(图5 (e)雪旺细胞和Mif)。发现CYP51、FDFT1 NSDHL脂质代谢都是由雪旺细胞调节,但只有NSDHL被雪旺细胞Mif监管。在糖代谢,的表达^⋅⋅Pgk1 Tpi1调节由雪旺细胞;ENO2 PKM被雪旺细胞表达下调;然而,所有上述因素在葡萄糖代谢不受Mif来自雪旺细胞。

4所示。讨论

作为一个最大的器官(支配19),周围神经纤维广泛分布在骨组织和最常发现在新陈代谢活跃的骨20.]。雪旺细胞是周围神经系统的神经胶质细胞形成髓鞘(21];在这里,我们发现由Mif雪旺细胞能促进骨生成。研究迄今为止所提供相互矛盾的证据关于Mif在骨的作用;Onodera等人产生转基因小鼠overexpressing Mif (Mif Tg)和混合启动子组成的巨细胞病毒(CMV)增强器和一个β肌动蛋白/β球蛋白启动子。他们发现,骨形成若干措施增加Mif Tg老鼠(10]。然而,郑et al。5]发现4-iodo-6-phenylpyrimidine (4-IPP), Mif的抑制剂,通过抑制成骨细胞分化和矿化也会p65 / NF -κB信号级联,这意味着Mif和骨之间的负相关。Mif与多元函数是一种多功能蛋白(22];因子合成和储存在细胞质中,它将被释放和功能激活后不同的刺激(23),如bacteria-derived代谢物(24,25,缺氧26,27),和其他炎性细胞因子(28]。先前的研究未能证明一致的Mif和骨之间的联系,和偏见Mif的反应可能来自不同来源的结果。

此外,我们发现,雪旺细胞促进骨生成Mif。CD74 II型跨膜蛋白,假定的Mif受体发挥作用在Mif-regulated反应(29日,30.]。妈妈等人发现CD74 KO小鼠的骨表型相似的Mif KO小鼠31日]。我们发现CD74由雪旺细胞和Mif MC3T3-E1细胞。FOXO1属于FOXO家族转录因子(FOXO),可以将环境信号转化为基因表达(32),调节许多细胞过程,包括细胞生存、增殖、分化、凋亡、抗氧化应激、代谢、炎症、和老化(33- - - - - -36]。FOXO1促进骨生成;超表达/损耗FoxO1 MC3T3-E1细胞可能有助于促进成骨细胞分化[/衰减37]。FOXO1与Runx2的底层机制和高山基因启动子(38]。在这里,我们发现FOXO1参与雪旺细胞促进骨生成和受Mif / CD74。FOXO1通常参与脂质代谢和lipid-related疾病的发展中起着至关重要的作用[39]。

我们发现,雪旺细胞可以提高亚油酸preosteoblast细胞。进一步,我们发现NSDHL,参与类固醇合成的酶,由雪旺细胞及其Mif升高。Mif可以调节新陈代谢在许多代谢性疾病,如糖尿病的葡萄糖代谢;然而,它的作用在骨代谢以前从未被彻底研究。NSDHL扮演着重要的角色在骨骼发育;NSDHL基因的缺陷的原因male-lethal突变光秃秃的补丁(Bpa)与条纹(Str)表型;杂合的Bpa女性相比就是小巫见大巫,证明异常沉积的钙在尾椎骨40,41]。亚油酸是人体维持许多重要的生理功能,如磷脂的合成和脂质代谢。亚油酸是发现有能力防止age-induced骨质流失(42通过减少脂肪细胞在小鼠和增加osteoblastogenesis [43]。总之,雪旺细胞和Mif可以调节脂肪酸代谢促进骨生成。雪旺细胞的代谢物的监管主要是富含氨基酸代谢。“氨基酸前体几个代谢途径至关重要,正如天冬氨酸和谷氨酰胺对嘧啶和嘌呤合成,同时提供至关重要α酮戊二酸,柠檬酸循环(44]。通过复杂的过渡和国米,intra-interactions代谢物形成复杂网络仍然需要进一步的研究来阐明。

5。结论

这些发现公布雪旺细胞的机制,促进骨生成,雪旺细胞加速骨通过Mif及其下游CD74 / FOXO1还参与促进雪旺细胞在骨生成。雪旺细胞和Mif可以调节preosteoblasts氨基酸代谢和脂肪酸代谢。

数据可用性

所有数据需要评估的结论存在于纸和/或补充材料。可能会被要求提供额外的数据与本文相关的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

作者的贡献

秦军和李Hui-Jie江设计和执行主要研究实验,分析数据,和写的手稿;李冯纯化雪旺细胞和雪旺细胞修改;Na-Zhi詹鄯善李进行免疫印迹实验;Zi-Jie陈和Bo-Han常表现高山染色;程Xiu-Yun苏和的彭真评论和批准最终的手稿;Guo-Xian裴和刘洋的构思和监督的研究。

确认

我们感谢员工的解放军Xijing医院骨科研究所。这项工作是支持科研资金支持的南方科技大学(Y01416214)和国家自然科学基金委青年中国国家自然科学基金项目(批准号81902202)。

补充材料

补充图S1:代表色谱正(POS)和负(底片)离子模式。补充图S2:微分成绩单和代谢物选择进行相关性分析。补充图S3: (a)代表世行图像检测感染效率;(b)高山活动, 。(补充材料)