文摘

千分尺规模sac-like肺泡是最重要和基本单元为肺气体交换。因此,支架的设计和制造为肺泡再生组织工程方法应该满足一些地形、功能要求等大的表面积,灵活性,和高透气性故土。的透气性测试支架通过一个快速和简单的方法也是高度要求协助新支架的开发。本研究制作alveolus-like支架与常规孔隙形状、高孔隙连通性和高孔隙度由逆蛋白石技术与随机不信任多孔支架由两种不同的盐浸出技术材料(聚氨酯和聚(L-lactic酸))。固定支架表面改性的VEGF。肤浅和新技术基于泡沫计原理使测量多孔支架的透气性特别方便了。支架的细胞反应是评估通过培养骨髓间充质干细胞和肺上皮NL20 coculturing内皮HUVECs。我们的结果表明,新设计的透气性设备提供快速、无损、可再生的、准确的评估不同支架的透气性。多孔聚氨酯支架由逆蛋白石的方法有更好的透气性比其他支架用于这项研究。细胞工作表明,VEGF表面改性,聚氨酯逆蛋白石支架诱导alveolus-like组织和肺组织工程中有前途的应用程序。

1。介绍

肺部疾病的患病率一直在增加,因为吸烟,空气污染(高灰尘和化学粒子在空气中),和遗传疾病1]。慢性阻塞性肺疾病(COPD)急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI / ARDS),肺动脉高压(PH),囊性纤维化(CF)和肺癌的肺部疾病与高死亡率(2- - - - - -6]。然而,人类肺再生能力非常有限。一旦受到损坏或退化肺,肺的功能将发生不可逆转的损害。肺组织移植是治疗肺部疾病的金标准,并帮助拯救生命。这是一个有效且安全的治疗病人患有各种终末期肺部疾病。与此同时,50000多名成人肺移植已经进入国际社会的心脏和肺移植注册到2014年(7]。然而,这种治疗面临着巨大的挑战:捐献器官短缺,昂贵的手术,和短中因慢性肺部移植同种异体移植物功能障碍,以及复发的潜在病理在某些情况下(8]。晚期肺移植后死亡率呈现在大约50%的患者在移植后5年7]。因此,组织工程方法就是能产生生物兼容的替代品来恢复和支持肺组织功能(9成为一个非常有前途的治疗。

良好的透气性是肺的关键特性。肺泡内气体交换的基本和必要的单位。通过组织工程支架为肺泡再生方法应该有多个连接孔和孔壁良好的透气性。许多支架,如脱细胞,明胶海绵,海绵和胶原蛋白微胶囊(10- - - - - -12),一直在探索制备组织工程肺肺细胞如上皮和内皮细胞增长。以前,逆蛋白石支架均匀和可控孔隙大小、孔隙连通性高,细孔壁被调查血管渗透(13]。逆蛋白石支架的结构特点可以模拟地形肺泡肺,使本身的一个有前途的肺组织工程支架的候选人。

描述一个脚手架是否适用于肺泡生产、透气性测试应该进行。几个可靠的透气性测试人员对食品包装、纺织、和论文可根据压力计原理及ASTM标准,例如,透过测试设备类型GDP-C;压差透气性测试仪,弗雷泽;和ASTM 1434 - 82和ASTM D73714,15]。然而,他们不适合的透气性测试多孔支架在组织工程由于其小批量的大小,相对较大的孔隙,和独特的建筑16,17]。考虑到高透气性的多孔支架,需要高精度气体流量计在气体测量的测试。利维报道泡沫计技术作为一种简单而可靠的方法测量气体的体积流率的应用程序(18]。当前研究的目的是制造和比较多个alveolus-like支架用于肺组织工程和设计一个方便和简单设备能测试这些产生的透气性支架以指导更好的制造alveolus-like支架。

2。材料和方法

2.1。制造Alveolus-Like支架

两种类型的多孔支架与不同的体系结构是捏造的。一种类型是gelatin-based逆蛋白石支架孔隙结构均匀,IOS表示,另一个是盐浸出和随机分布的多孔支架孔隙结构,作为SLS表示。两种类型的聚合物、聚氨酯(PU)(美国Sigma-Aldrich)和聚(L-lactic酸)(丙交脂)(Gorinchem Purac BV,荷兰)被用来制作支架。

IOS支架后生成与轻微修改如图建立了协议1(13]。首先,统一的明胶微球大小从180年μm - 430μ通过改变实验参数(甲苯和明胶溶液的流量和毛细管的直径)(表1)生产使用微流体装置如图1(a)。其次,模板模具与多层六角形包装明胶微球形成(图1(b))。然后15% ( )聚氨酯溶液中1,4 -二恶烷(美国Sigma-Aldrich)放入模具(图1(c))。复合模具被冻结在-20°C 6小时然后冻干一夜之间在一个冷冻干燥器中脱去溶剂。最后,明胶微球被通过模具沉浸于水浴与温和搅拌过夜(图43°C1(d))。PU-IOS支架5毫米的高度和直径5毫米。


图1
原理的三维多孔支架制备方法逆蛋白石。(一)凝胶粒子生成的微流体装置;(b)凝胶模板形成甲醇气氛在80°C烤箱烘焙30分钟;(c)聚氨酯溶液渗透通过凝胶模板和填充每个凝胶粒子之间的差距;(d)聚氨酯支架系列冷冻干燥6小时后的凝胶颗粒和删除沉浸在45°C水浴24小时。
表1
实验参数来控制不同的凝胶粒子的直径。

生成SLS支架,食盐(氯化钠)颗粒直径在250年μ米和350μ米被收集的筛子,然后混入15% PU溶液或6% ( )丙交脂溶液(英国在氯仿、σ)聚氨酯和丙交脂支架,分别的重量比聚合物溶液和生理盐水1:9。盐和聚合物复合材料保存在一个圆模具3 - 5天有机溶剂,蒸发后的复合材料被沉浸在水浴浸盐颗粒彻底。SLS支架直径5毫米和5毫米的高度被收集。

2.2。透气性测试装置设计

方便和简单的设备评估透气性多孔支架的设计基于泡沫计原理(18,19]。该设备由4部分示意图绘制,如图2。第1部分是用于天然气运输;它是由一个注射器泵(KD科学)和50毫升注射器(规范国民住宅)。第2部分是用于样本。多孔支架与定义的维度和一个更大的比表面积,发泄的50毫升注射器被发泄稳定。第3部分是显示组件组成的流动方向改变通过一个三通接头,2毫升注射器没有柱塞(规范国民住宅),和一个浮动利率债券是由洗涤剂电影从混合物中产生的粘性解洗涤剂和蒸馏H2O 4的比例:1。数码相机记录了浮子运动第4部分。洗涤剂后电影放在底部的2毫升注射器,注射器泵成立推动注射器内的空气通过支架由不同的流率。浮子的运动速率的读出使用不同类型的支架的透气性。


图2
原理图设计透气性测试装置四部分组成。1:天然气运输部分组成的注射泵和注射器;2:样品固定部分,使样品对通风稳定;3:显示部分使用洗涤剂电影作为气体浮子;4:由数码相机记录部分。
2.3。表征Alveolus-Like支架
2.3.1。观察支架

IOS和SLS支架由聚氨酯的形态和丙交脂,明胶微球,六角包装胶模具被亮视场显微镜观察(奥林巴斯、美国)和扫描电镜(范Teneo VS,美国)。

2.3.2。透气性

的透气性PU-IOS支架与各种孔隙大小和SLS支架由丙交脂和聚氨酯被设计的测量装置。首先,支架( 毫米)被放置在50毫升注射器与稳定的依恋。注射泵的流量被设置为5,10,20、30和40毫升/分钟,对于每一个样本。为每个流程设置和测试,浮子的运动距离指示作为初始高度, ,最后一个高度, ,对应于初始时间, ,最后一次, ,分别被相机记录。浮子的运动速度( )是由以下公式计算:

每个实验至少重复三次。支架样品之间的透气性比较浮子运动速率。

2.3.3。机械性能

IOS和SLS支架的机械性能( 毫米)是衡量机械测试机(BOSE 3200系列电力量,英国)10毫米/分钟的速度下的压缩模式。从原始force-deformation绘制应力和应变曲线按照下列公式。相应的杨氏模量进行了计算。

2.4。制造组织工程的肺泡
2.4.1。表面改性

为了提高细胞对PU-IOS,表面改性是通过引入血管内皮生长因子(VEGF)支架共价[20.]。首先,氨等离子治疗应用于聚氨酯支架引入胺组。为此,聚氨酯支架被投入的等离子体反应室压力从21 mbar增加到50 mbar氨气体泵。等离子治疗持续了5分钟。支架为70%乙醇浸泡2小时消毒。其次,介绍了肝素固定在支架表面通过交联反应1-ethyl-3 -盐酸(3-dimethylaminopropyl)碳化二亚胺(EDC)和N-hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS)。氨plasma-treated聚氨酯支架被EDC的解决方案(2毫米),Sulfo-NHS(5毫米)和肝素(1毫克/毫升)2 -吗啉代ethanesulfonic酸(MES)缓冲区和孵化2小时在室温下将肝素。与PBS洗涤三次后,支架浸到100年μL VEGF的解决方案(100 ng / mL)嫁接在一夜之间在4°C。植入支架是用PBS为进一步应用程序并将其保持在4°C。

2.4.2。msc文化

所述,从大鼠骨髓msc孤立在我们之前的研究21)被用于这项研究。总之,在胫骨和股骨骨髓还是斯普拉格−Dawley老鼠冲10毫升的细胞培养基和转移到两个T25培养瓶(美国NUNC)和孵化αmem培养基(美国Hyclone)补充10%胎牛血清(抗生素的边后卫,BI,以色列)和1%(美国Hyclone) 37°C公司为5%2。中每3天更换一次直到细胞达到融合。细胞被亚文化在1:2板比例。通过3 - 5 msc被播种到VEGF-modified alveolus-mimicking多孔支架与细胞播种密度104/毫米3。整洁PU-IOS支架与msc播种作为对照组。由上述结构是有文化的αmem培养基在37°C公司为5%2每两天,媒介改变了。

2.4.3。Coculture

人类脐静脉内皮细胞(HUVECs Lonza)和人类支气管上皮细胞系(NL20,写明ATCC) cocultured观察alveolus-like定位的两种类型的细胞支架。媒体NL20包含火腿的F12(英国Lonza),有4%的边后卫,1.5 g / L NaHCO的1.3%3谷酰胺,1%的2毫米,0.1毫米不必要的氨基酸的1%,1%的抗生素抗有丝分裂的,0.5的0.05%μ克/毫升氢化可的松。媒体的媒体HUVECs由200 (M200热费希尔)低血清增长2% (lgs,热Fisher)的补充。NL20和HUVECs的比率4:1和细胞密度为105/毫米3被播种到支架与50毫米的尺寸吗3。NL20贴上PKH26电池连接器(红色、Sigma-Aldrich)产品指令后细胞播种之前,和HUVECs被确定和CD31染色后终止培养。cell-scaffold构造是在混合培养基培养(1的比例:1),介质是改变每2天。

2.5。描述的组织工程化肺泡
2.5.1。CCK-8化验

可行性和msc增殖VEGF修改和nonmodified PU-IOS支架是由细胞计数检测kit-8 (CCK-8 Dojindo,日本)如我们之前所述研究[20.]。简单地说,1、3和5天细胞播种后,CCK-8解决方案的稀释1:10与媒体添加到每个样本和培养在37°C公司为5%2。两个小时后,100年μL的媒体都被转移到96孔板测量吸收值的波长450 nm使用标仪(美国BioTek Symergy HT)。

2.5.2。共焦的观察细胞活力和形态

上培养的msc VEGF的可行性修改和nonmodified聚氨酯支架在第七天是由生活和死亡染色试验根据产品手册(美国英杰公司可行性/细胞毒性工具包)。共焦显微镜(德国徕卡)被用来观察生活和死亡msc在聚氨酯支架。活细胞成像作为绿色488海里的激发和死细胞红535海里的激发。三维(3 d)重建的图像 - - - - - -10叠加二维图像μ米的步骤。

coculturing 21天之后,NL20的位置和分布和HUVECs支架被表达荧光检测;NL20被标签显示为红色PKH26电池连接器染料,而HUVECs和CD31染色抗体。CD31染色标记,结构是固定的4%多聚甲醛(PFA)首次在室温下30分钟。删除PFA之后,构造与PBS洗两次,放入1% BSA屏蔽解决方案,和孵化一小时。与PBS洗两次后,CD31主要抗体(goat-antihuman,圣克鲁斯,英国),稀释1% BSA的比率1:100年,添加和孵化至少16小时在4°C。构造与PBS清洗三次,孵化与二次抗体(FITC-donkey antigoat, 1: 100年,圣克鲁斯,英国)在37°C 3小时。最后,构造被DAPI洗3次与PBS和复染色细胞核,然后由共焦显微镜观察。

2.6。统计分析

所有定量结果表示为 。每组至少6用于复制。使用单向方差分析,进行了统计分析 - - - - - -测试每个群比较确定的意义。的值 被认为是具有统计学意义。

3所示。结果

图3显示了图像porogen粒子和气孔形成的支架。它可以看到生成的微流体装置均匀明胶微球的直径 , ,和 μ(数据3(一个)- - - - - -3 (c))与筛选方法(250 - 350年μ米,图3 (d))。数据3 (e)- - - - - -3 (g)显示了聚氨酯多孔支架孔隙均匀,和图3 (h)显示了丙交脂SLS支架与不规则的毛孔。

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图3
porogens可见图像和毛孔内支架。凝胶粒子生成的微流体装置具有不同直径(a - c),氯化钠粒子(d)和多孔支架(情况)。凝胶颗粒的直径 (一), (b), (c)和生理盐水粒子大小为250 - 350μm (d)。支架产生逆蛋白石技术(eg)和盐浸出方法(h)。

图4显示了多层六角形包装明胶微球(图4(一)和PU-IOS支架(数据4 (b)和4 (c)用于MSC培养。可以看出,我们获得的明胶微球有统一的直径和拥挤的微球形成六角连接。图4(C1)显示了PU-IOS支架的横截面均匀孔隙和孔隙连接,和图4(C2)显示了PU-IOS支架的形态与小孔内大毛孔,表明聚氨酯材料不包括完整的明胶微球和紧密明胶微球表面孔隙连接创建的。

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图4
明胶微球的图片包装模具,形成支架。多层六角形包装明胶微球(a) (A1, A2)和PU-IOS支架(b) (B1, B2)亮视场显微镜。(c) (C1, C2)形成聚氨酯支架通过扫描电镜观察。箭头显示小毛孔粗大毛孔内,通过连接明胶微球。

透气性测试装置设计的可靠性评估通过分析气体流速的关系和浮子运动速率。我们测试设备没有支架通过设置注射泵的流量在5、10、20、30、40毫升/分钟,发现洗涤剂电影的浮子装置上升以恒定速率对应的泵率条件下,复制(数据没有显示)。图5显示了气体渗透率测量的结果IOS和SLS支架在不同气体运输率。PU-IOS孔隙大小为180、310和430μ米,PU-SLS PLLA-SLS孔隙大小为250 - 350μm是用于验证所设计的设备。从图可以看出5每组之间没有明显的区别,当气体运输率为5,10,20毫升/分钟。而当流量增加到30 mL / min, PLLA-SLS的透气性也明显低于其他群体,这表明聚氨酯比丙交脂有更好的透气性。通过密切关注浮子28之间移动速度和32毫升/分钟(图5 (b)),它是发现PU-IOS比PU-SLS更好的透气性。此外,透气性PU-IOS随着孔隙大小的增加逐渐增加。这些结果表明,材料的类型,孔隙形态和大小在很大程度上造成了透气性。

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图5
透气性的结果聚氨酯支架(IOS)由逆蛋白石技术具有不同孔隙直径和丙交脂支架(SLS)由盐浸出方法。(b)是在广场的放大的图像部分(a)。

PU-IOS的机械性能和PU-SLS PLLA-SLS图所示6。很明显,PU-IOS孔隙大小的310年和430年μ米有类似的刚度,刚度PU和丙交脂盐浸出方法产生的多孔支架远高于逆蛋白石的支架。与丙交脂相比,聚氨酯盐leaching-formed支架是柔软的。图6 (b)表明PLLA-SLS支架杨氏模量与最高聚氨酯支架。

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图6
机械性能的聚氨酯支架由逆蛋白石技术(IOS)和盐浸出方法(SLS)和丙交脂支架由盐浸出方法(SLS)。(一)根据压缩应力-应变曲线绘制数据。(b)支架的杨氏模量。 ; 。

在数据7(一)和7 (b)活和死染色图像显示,更多的生活和更少的死msc VEGF-modified聚氨酯支架图7 (b)比在整洁的聚氨酯支架图7(一)在第七天。此外,它可以看出msc在传播VEGF-modified PU-IOS支架上而不是圆形的PU整洁的支架。图7 (c)显示了CCK-8 PU-IOS支架上培养的msc的结果在天1,3,5。很明显,msc在VEGF-modified PU-IOS最好支架细胞相容性比未改性聚氨酯支架(P< 0.05)。从3 d图像,我们可以看到,沿墙msc增长的毛孔,形成alveolus-like结构VEGF-modified PU-IOS支架(图8 (b)。

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图7
共焦生活和死亡的2 d图像msc在PU-IOS支架培养7天。(一)(a1a3)整洁的聚氨酯支架;(b) (b1b3) VEGF-modified PU-IOS支架。绿色:活细胞;红色:死细胞;(A3, B3)合并图像。定量细胞生存能力培养的两种类型的支架在天1,3,5评估CCK-8装备提出了(c)。
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图8
共焦三维图像的生活和死亡msc在PU-IOS支架培养7天。(一)(A1, A2)整洁的聚氨酯支架;(b) (B1, B2) VEGF-modified PU IOS支架;(A1, B1)俯视图;(A2, B2)侧视图。绿色:活细胞;红色:死细胞。

图9显示了NL20附件3天colocalization NL20和HUVECs播种后21天。的红色荧光数据9(一个)和9 (b)显示NL20细胞跟踪PKH26和绿色的HUVEC CD31染色的抗体(图9 (c))。在合并后的形象图9 (d),我们可以看到的黄色这意味着colocalization NL20细胞和HUVECs。

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图9
共焦图像coculturing NL20细胞和HUVECs VEGF PU-IOS支架修改。NL20细胞成像和标签由PKH26住细胞追踪(红色)3天21天,而HUVECs被确定CD31染色(绿色)21天。(一)共焦 - - - - - -叠加3 d图像的构建培养3天。黄色的圆圈显示细胞附着在孔隙表面。(b)共焦住的2 d图像构造为21天培养;(c)共焦的2 d图像构建培养21天HUVECs细胞CD31染色显示位置;(d)合并图像。

4所示。讨论

慢性肺部疾病,如慢性阻塞性肺病、CF、PH值,和癌症,没有治愈除了肺移植。然而,供体肺的关键不足以及潜在immunorejection限制肺移植的使用。代的功能肺组织通过组织工程方法已经表明高承诺满足临床需求。复制肺泡的复杂的三维建筑结构和功能单位成为一个挑战成功的肺组织工程。在这项研究中,我们采用逆蛋白石制造技术生产多孔支架使用高弹性聚氨酯(PU-IOS)相比,支架由硬聚乳酸盐浸出技术的关注透气性和细胞支架之间的附着能力。PU-IOS支架与VEGF修改生成一致的卓越的结果比其他类型的支架。新透气性测试装置演示了各种支架的可靠的测量结果。

明胶海绵止血手术材料已广泛应用于临床几十年了。临时支架,明胶海绵将完全退化或体外和体内迅速吸收。其多孔结构和合适的孔隙大小类似于肺的肺泡被用于组织工程包括美国(11,22- - - - - -24]。安德雷德等人用明胶海绵海绵和胎鼠肺细胞再生一个alveolus-like结构和探索肺再生的潜在应用11]。明胶海绵制成的明胶酶在水溶液中稳定,较低的环境。与明胶海绵海绵相比,使用逆蛋白石制造技术可以生成脚手架制服和可控孔隙大小和常规孔隙连接,它模仿了肺泡集群更好,因此适合肺组织工程。

由于弹性和渗透性能,聚氨酯及其家庭成员作为气道支架bronchotracheal癌症和动态文化室肺组织工程(25,26]。改善生物相容性、PU修改了VEGF在这项研究中,可提高附件和msc的增殖。结果CCK-8天1、3、5和生活和死在第七天染色表明,VEGF的修改是非常有效的,这也验证了我们之前的研究(20.]。HUVEC,有趣的是,当coculturing内皮细胞和上皮细胞的colocalization NL20清晰可见(图两种类型的细胞9),这表明,逆opal-fabricated支架支持alveolus-like结构上的多个细胞群。

我们成功地增长MSC PU-IOS支架旨在探索肺再生新的细胞来源。临床上很难获得自体肺细胞(内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞)对上述患者肺部疾病。诱导MSC分化或肺部祖细胞(27]是一种很有前途的和现实的方向来生成由肺组织肺泡组织工程方法。数据7和8表明,msc是伴随着人类的墙孔;它仍然可以发现,msc不能形成一个整体孔隙结构像肺泡,这可能是由于文化时间短使形成细胞板和静态培养法。这是我们研究的一个限制。更长的文化时间和动态方法应该被用来形成一个肺泡结构在将来的研究中。

透气性是肺组织的一个基本特征。然而,很少有研究,以测试肺三维多孔支架的透气性26),尽管在食品包装领域成熟的渗透测试方法已经建立(17]。在这项研究中,我们设计了一个简单的设备评估透气性的肺组织工程多孔支架注射泵气体运输组件和洗涤剂的电影。根据税的研究,泡沫计方法显示一个99.75%的测量精度(18]。我们进行了三组实验来确认我们的设备的可行性和准确性。测试结果没有支架显示气体流率的线性关系和运动速度的洗涤剂的电影。然后,支架的孔隙形态和材料透气性进行了分析。

我们制造丙交脂盐浸出多孔支架、PU盐浸出多孔支架,与不同的孔隙大小和PU逆蛋白石支架透气性测试。据报道,各种技术包括溶剂浇铸/粒子浸出、气体发泡,相分离技术可以生产多孔支架(疏的~ 35 - 60%),但有限的毛孔(之间的互连28]。张等人证明了逆蛋白石支架(~ 74%的孔隙度)高互连(窗口大小的60 - 70μ米)有较高的大分子的扩散速度(FITI-dextran, ),相比,支架与非均匀孔隙和30的窗口大小μ米(29日]。我们的研究结果的透气性与这些报告一致。连接孔隙率较高,聚氨酯逆蛋白石支架有渗透率高于聚氨酯盐浸出支架,这说明我们的透气性测试装置的可靠性。

接下来,我们比较了材料对气体渗透性的影响。我们发现聚氨酯盐浸出支架有更好的透气性比丙交脂支架由相同的技术,这表明聚氨酯有更好的透气性财产和更适合肺组织工程相比,丙交脂。保等人报道,O2和有限公司2渗透丙交脂用于包装是0.14 Barrers Barrers (22.8°C)和1.1 (30°C),分别为(30.),而O2和有限公司2渗透的PU图兰和他的同事们报告的5.17 Barrers和78.69 Barrers 25°C,分别为(31日]。总的来说,考虑到我们透气性结果和以往的研究,我们得出结论,支架的透气性不仅由制备方法还取决于使用的材料的特点。我们新的透气性设备准确地检测到个人和组合透气性的因素。

应用流量的气体也会影响检测结果。我们设置流量5、10、20、30、40、50毫升/分钟观察浮子的运动,发现很难区分的渗透率属性时支架率低于20毫升/分钟。较低的气体流速可能无法产生足够的压力。因为精致的洗涤剂泡沫,流量不能设置高于50毫升/分钟的打破,因为这将会导致洗涤剂的电影。因此,气体流速设定在30或40毫升/分钟适合测试多孔支架的渗透性。这是一个新设备的限制。更耐用的和敏感的浮动利率债券需要被发现。

5。结论

在当前的工作中,我们提出了一个有用的策略肺组织工程支架的制造和设计了一种透气性测试人员协助制造。逆蛋白石技术生产的聚氨酯支架导致高度连接孔和弹性性质,证明高细胞附着和colocalization上皮和内皮细胞成alveolus-like组织。VEGF-modified支架增强的结果。洗涤剂的透气性测试仪设计电影浮子可以区分透气性支架孔隙形态不同,用不同的材料做的。

数据可用性

所有的研究数据都包含在这篇文章。

的利益冲突

作者声明没有竞争的经济利益。

确认

这项工作是支持的EC FP7居里夫人之下国际传入的奖学金;中国自然科学基金(批准号31800810);中国江苏省自然科学基金(批准号BK20180998);中国博士后科学基金(批准号2019 m651973);和江苏计划项目博士后研究基金(批准号2018 k055b)。