文摘

背景和目标。心肌缺氧损伤后,重要的是增强血管形成对损伤修复和恢复血液供应。先前的研究已经表明,心脏成纤维细胞(CFs)心肌损伤后血管生成中发挥至关重要的作用。小细胞外囊泡(股票)源自人类脐带间充质干细胞(hucMSCs)炎症环境中促进fibroblast-to-myofibroblast分化和心血管效应。现在仍不知道是否签订调节心脏成纤维细胞,促进心肌损伤后血管新生。方法和结果。我们孤立主要CFs Sprague-Dawley老鼠(1 - 3天)和治疗用脂多糖(LPS)和有限合伙人+塞。RNA序列分析显示,angiopoietin-like 4 (Angptl4)有限合伙人+塞组增加超过LPS组。后抑制Angptl4表达式在股票和慢性疲劳综合症,细胞增殖,Transwell迁移,和管形成分析被用来检测人类脐静脉内皮细胞的血管生成活动。β连环蛋白表达在慢性疲劳综合症被免疫印迹检测。的β连环蛋白抑制剂ICG001被用来检查是否β连环蛋白参与了proangiogenic CFs被塞的潜力。塞夫增强CFs的proangiogenic潜力在炎症条件下,联系在一起β连环蛋白信号。CFs的proangiogenic潜力下降时Angptl4在CFs和hucMSCs撞倒了。结论。塞夫通过Angptl4 CFs促进血管生成调节炎症的环境。这可能提供研究基础和塞治疗心肌损伤。

1。介绍

急性心肌损伤有很高的死亡率。心肌损伤后的修复机制包括抑制炎症,增强血管生成,减少纤维化和重构。血管再生和恢复血液供应至关重要的炎症间隙和损伤修复(1]。因此,促进血管生成被认为是一个不错的选择对于心肌损伤的修复。心脏成纤维细胞(CFs)是主要的noncardiomyocytes,在受损组织的重塑中发挥重要作用2]。CFs的proangiogenic潜力也被报道。萨拉斯瓦提等人孤立的两种不同的纤维母细胞亚型的老鼠心脏心肌梗死后,证明了FSP1 +纤维母细胞proangiogenic作用[3]。CFs在心脏损伤修复的作用可以从炎症血管生成(4,5]。已经证明间充质干细胞(msc)或液促进组织损伤的修复和血管生成6,7]。李等人表明,干细胞小细胞外囊泡(股票)促进心脏血管生成提供mir - 486 - 5 - p,这是相关成纤维细胞的基质金属蛋白19 [8]。液源自人类内皮祖细胞增殖和血管生成增加慢性疲劳综合症(9]。我们先前的研究已经表明,液源自人脐带msc (hucMSC-exs)心血管效应(10]。hucMSC-exs也促进炎症的fibroblast-to-myofibroblast分化阶段,有心血管效应11]。然而,塞夫是否能调节CFs促进血管生成在炎症环境需要进一步的研究。

在这项研究中,我们从Sprague-Dawley孤立主要慢性疲劳综合症(SD)大鼠(1 - 3天)和证明塞增强proangiogenic CFs的潜力。火山的地图(度)和浓缩的差异表达基因分析angiogenesis-related基因的RNA序列后(RNA-seq)对慢性疲劳综合症的分析表明,Angptl4可能是一个值得注意的基因。angiopoietin-like 4 (Angptl4) angiogenin-like蛋白家族中的一员,是一个分泌糖蛋白(12]。因此,我们调查了proangiogenic炎症环境中潜在的Angptl4 CFs。

几项研究已经表明,Wnt /β连环蛋白信号通路参与调节血管生成(13]。Angptl4也是相关联的β连环蛋白(14]。在这项研究中,所扮演的角色β连环蛋白在CFs的活动增强了塞夫也被调查。

2。材料和方法

2.1。动物

依法所有动物的实验进行指导的护理和使用实验动物,经江苏大学动物实验中心在镇江,江苏,中国。SD大鼠(1 - 3天)被用于这项研究。

2.2。细胞培养

分离、培养hucMSCs如前所述[15]。脐带来自江苏大学附属医院(江苏,中国),和所有供应商给了知情同意。在基本培养基培养hucMSCs是α(αmem;Gibco、大岛屿,与10%胎牛血清(美国纽约)的边后卫;生物产业,拜特HaEmek,以色列)37°C 5%有限公司₂。慢性疲劳综合症的主要是隔绝的心1-3-day-old SD大鼠根据既定的方法16]。人类脐静脉内皮细胞从美国获得(通过传代形成细胞类型文化集合(美国弗吉尼亚州马纳萨斯)和培养high-glucose杜尔贝科修改鹰的介质(H-DMEM;Gibco)与10%的边后卫在37°C公司5%₂。

2.3。塞夫提取

当hucMSCs融合达到80%完成αmem,完全培养基所取代αmem补充10% sEVs-depleted的边后卫。48小时后,上层的收集和离心机 10分钟, 为20分钟 30分钟清除残骸。上层清液集中与100 kDa分子量截止(MWCO)超滤离心管(美国微孔,Billerica的)。集中上层清液是离心机 为70分钟。底部的沉积在PBS resuspended。混合物再次离心 70分钟,沉积物包含股票resuspended在PBS和储存在-80°C。

2.4。纳米粒子跟踪分析(NTA)

孤立的签订与PBS稀释。签订的浓度和粒度分布是评价通过使用莫尔文Panalytical nanosight纳米颗粒分析仪(英国莫尔文)。数据分析通过使用ZetaView 8.05.12 SP1的软件版本。

2.5。电子显微镜

股票涨跌互现,20μL是添加到样品装直径2毫米的铜网,和一个样本被过剩。铜网倒在2%的磷钨酸下降为负染法在室温下5分钟。干燥后,得到图像用透射电子显微镜(JEOL、东京、日本)。

2.6。流式细胞术

当hucMSCs的密度达到90%,细胞被收集和孵化与CD34抗体,CD19、CD45、CD90、CD29,和CD105(美国圣地亚哥eBioscience) 30分钟在4°C,洗了三次,300年resuspendedμL PBS。立即收集和分析数据的流式细胞分析仪(美国Billerica Becton Dickinson)。

2.7。免疫荧光分析

当CFs的密度达到70 - 80%,上层清液被除去,PBS的细胞被洗了三次。这些细胞被固定为4%多聚甲醛在室温下20分钟和permeabilized 0.1% Triton x - 100 15分钟。细胞被封锁的5%牛血清白蛋白(BSA) 30分钟在37°C和孵化主要抗体α光滑的肌肉肌动蛋白(αsma) (1: 200;美国伯明翰博士德)、波形蛋白(1:100;细胞信号技术,丹弗斯,美国),胶原蛋白I (1: 100;博士德),periostin (1: 100;美国Rosemont Proteintech)、CD31 (1: 50;Arigo、台湾)和Angptl4 (1: 100;细胞信号技术)在一夜之间在4°C。第二天,fluorescence-conjugated二级抗体(1:1000;细胞与细胞信号技术)是孵化1 h在37°C。细胞核与赫斯特33342年复染色(美国圣路易斯Sigma-Aldrich)和图像在荧光显微镜下观察(奥林巴斯DP73、东京、日本)。

2.8。西方墨点法

蛋白质分离与里帕裂解缓冲含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂,PMSF,由10 - 15% sds - page分离,转移到PVDF膜(美国微孔)。接下来,PVDF膜被封锁5%牛奶1 h和孵化一夜之间在4°C主要抗体CD9 (1: 1000;细胞信号技术)、TSG101 (1: 1000;博士德)的研究(1:800;Proteintech), calnexin (1: 1000;博士德),αsma (1: 1000;博士德)、波形蛋白(1:1000;细胞信号技术),胶原蛋白I (1: 1000;博士德),periostin (1: 1000;Proteintech)、CD31 (1: 1000;Arigo), Angptl4 (1: 800;细胞信号技术)、细胞周期蛋白D1 (1: 800;细胞信号技术),β连环蛋白(1:800;细胞信号技术)和GAPDH (1: 2000;细胞信号技术)。第二天,二次抗体(1:3000;细胞信号技术)孵化的膜1 h在37°C。乐队是由增强化学发光图像可视化分析。

2.9。RNA-seq分析

主要治疗CFs与脂多糖(LPS) (100 ng / mL)和有限合伙人+塞(200μg / mL) 24 h。总RNA提取和分析。RNA序列数据都是来自深圳华大基因研究院(中国深圳)。所有值修正了统计学意义使用错误检测率(罗斯福)为多个测试。 和罗斯福调整 被认为是具有统计学意义。

2.10。小干扰rna转染Angptl4

Angptl4 siRNAs是由RIBOBIO(中国):siRNA1: 5 - - - - - -GCAGAGTTTACAGACTCAA-3 ,siRNA2: 5 - - - - - -GCAGCCATTCCAATCTAAA-3 ,和siRNA3: 5 - - - - - -GGACAATACTTCCACTCTA-3 。当细胞的密度达到50 - 70%,siRNAs或消极的控制(数控)rna转染到细胞使用Lipofectamine 2000(美国表达载体,卡尔斯巴德,海里)。6小时后,与新鲜培养基中取代了,进一步的细胞培养48 h。

2.11。逆转录-聚合酶链反应(rt - pcr),

总RNA提取试剂盒的试剂(表达载体)。互补脱氧核糖核酸是获得使用rt - pcr试剂盒(CWBIO、剑桥、马、美国)。PCR程序进行UltraSYBR混合(CWBIO) StepOnePlus实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)。信使rna表达规范化β肌动蛋白。列出所有PCR引物的序列表1。

2.12。上层清液制备

主要治疗CFs与PBS(控制),有限合伙人(100 ng / mL),有限合伙人+塞(200μ克/毫升)或有限合伙人+塞(200μg / mL) + ICG001 (10μ米)24 h。Angptl4的作用,进一步研究主CFs与NC-siRNA转染(NC-CF)或Angptl4-siRNA (si-CF) 48 h和LPS处理+塞,有限合伙人+ NC-siRNA-sEVs(有限合伙人+ NC-sEVs)和有限合伙人+ Angptl4-siRNA-sEVs(有限合伙人+ si-sEVs) 24 h。使用CFs洗了三次PBS和改变了新的媒介进一步24小时。所有上层清液离心机 5分钟治疗HUVECs之前移除碎片。

2.13。伤口愈合实验

HUVECs是培养与血清H-DMEM 6-well板块。当细胞充满了文化井,单层细胞挠直线使用无菌吸管小费。PBS是用来洗细胞碎片。细胞治疗与上层清液来自预防慢性疲劳综合症。十二小时后,图像被显示为一个显微镜(尼康、东京、日本)。三个字段被拍到,迁移率计算通过使用ImageJ软件。

2.14。细胞增殖实验

CFs收集预处理的上层清液治疗HUVECs和镀在96 -孔板(3000个细胞/)。在24、48和72 h, 10% CCK-8试剂(Beyotime生物技术,中国上海)添加到井中。两个小时后,450海里的吸光度是通过使用一个微型板块分光光度计(美国BioTek Winooski, VT)。

2.15。Transwell迁移分析

培养了HUVECs supernatant-pretreated CFs 24 h。200年HUVECs被添加到心房μL血清H-DMEM ( 细胞),600年μL H-DMEM含有10%的边后卫是添加到下室。8 h后37°C公司5%₂迁移的细胞被固定并与结晶紫染色10分钟。图像被显示为一个显微镜(奥林巴斯DP73)。三个随机选择的字段被拍到,细胞被使用ImageJ软件计算。

2.16。管形成分析

培养了HUVECs supernatant-pretreated CFs 24 h。然后, HUVECs /表面被添加到100年μL基底膜基质(美国纽约康宁)96孔板和孵化6 h在37°C。三个随机选择的字段拍摄通过倒置显微镜(尼康)。管形成数字和分支点使用ImageJ软件进行了分析。

2.17。统计分析

数据有 。学生的 - - - - - -测试或单向方差分析与事后测试被用于实验和对照组进行比较。所有数据与GraphPad Prism 8.0软件进行了分析。 被认为是表明一个显著差异。

3所示。结果

3.1。表征hucMSCs、签订和慢性疲劳综合症

识别hucMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的状况。CD90、CD29、CD105 hucMSCs中高度表达,但CD34, CD19和CD45并不表示(图1(一))。hucMSCs的形态是纺锤状(图1 (b))。透射电子显微镜(TEM)表明,孤立的囊泡有典型的膜结构(图1 (c))。NTA透露,塞的大小是50 - 160纳米(数据1 (d)和1 (e))。为了进一步确定股票的描述,我们发现通过免疫印迹exosomal标记蛋白的表达。CD9、TSG101和研究是hucMSCs表达和签订,但calnexin只是表达hucMSCs(图1 (f))。我们也测量了CFs的表面蛋白免疫荧光和免疫印迹。αsma,波形蛋白,胶原蛋白,periostin表达主要慢性疲劳综合症,而CD31不是(数字1 (g)和1 (h))。这些结果为后续实验提供了足够的支持。

3.2。塞夫增强Proangiogenic CFs的潜力

调查是否签订监管CFs促进血管生成在炎症环境中,我们主要治疗CFs有限合伙人或有限合伙人+签订24 h,然后收集上层的。HUVECs上层清液的细菌培养24小时。CFs的上层清液使用塞提升扩散HUVECs炎性环境(图所示2(一个))。此外,扩散的细胞周期蛋白D1蛋白是调节有限合伙人+塞组较LPS组(数字2 (b)和2 (c))。伤口愈合和Transwell化验的结果表明,迁移HUVECs增加在有限合伙人+塞组较LPS组(数字2 (d)- - - - - -2 (g))。管形成试验表明管形成数字和分支点增强在有限合伙人+塞组较LPS组(数字2 (h)- - - - - -2 (j))。

3.3。Angptl4增加与塞治疗慢性疲劳综合症

塞夫增强proangiogenic CFs的潜力。进一步探索机制,RNA-seq CFs进行分析找到度有限合伙人和有限合伙人+塞组。火山的地图度和浓缩angiogenesis-related基因分析显示Angptl4可能是一个重要的候选基因(数字3(一个)和3 (b))。验证测序数据中存在建议签订Angptl4 mRNA表达的增加在CF炎性环境(图3 (c))。此外,Angptl4也增加的蛋白质水平有限合伙人+塞夫集团(数字3 (d)和3 (e))。免疫荧光染色显示Angptl4调节在有限合伙人+塞组较LPS组(数字3 (f)和3 (g))。

3.4。抑制Angptl4 CFs和股票导致血管生成减少

我们先前的研究已经表明,液可能被慢性疲劳综合症(11,17]。此外,它是显示在图3 (d)和3 (f)Angptl4的蛋白质水平显著增加在有限合伙人+塞组较LPS组。的表达Angptl4塞和hucMSCs测量。结果表明,Angptl4塞表达(图4(一))。有两种可能的机制。塞调节Angptl4在CFs的表达,或股票交付Angptl4 CFs。Angptl4 hucMSCs和CFs siRNA撞倒了。免疫印迹显示siRNA3击倒效果在hucMSCs和慢性疲劳综合症(最好的数据4 (b)和4 (c))。Angptl4撞倒在签订的Angptl4 siRNA3(图4 (d))。此外,与NC组相比,CFs Angptl4表达显著降低LPS + si-CF + si-sEVs组(Angptl4撞倒在股票和CFs Angptl4 siRNA3)(图4 (e))。此外,我们评估了Angptl4对血管生成的影响。结果表明,扩散和迁移HUVECs减少Angptl4撞倒时在股票和慢性疲劳综合症(数字4 (f)- - - - - -4 (h))。此外,如图4(我)- - - - - -4 (k)分支点和管形成数量都减少了有限合伙人+ si-CF + si-sEVs组。这些结果表明,Angptl4是调节CFs促进血管生成的关键分子。

3.5。Proangiogenic塞与CFs增强的潜力β连环蛋白

Wnt /β连环蛋白信号通路参与血管生成(18]。Angptl4也是相关联的β连环蛋白在皮肤真皮成纤维细胞14]。尽管Angptl4和之间的交互β连环蛋白被描述在其他的研究中,慢性疲劳综合症的关系并没有被研究过。此外,Angptl4的规定β在CFs连环蛋白在血管生成是未知的。因此,我们发现β西方墨点法连环蛋白表达在慢性疲劳综合症。β连环蛋白增加在有限合伙人+塞组较LPS组。在CFs和hucMSCs抑制Angptl4表达式后,表达β连环蛋白也降低(图5(一个))。因此,监管Angptl4 CFs促进血管生成,可能是相关的β连环蛋白。进一步阐明的角色β连环蛋白在血管生成,治疗慢性疲劳综合症β连环蛋白抑制剂ICG001。最合适的抑制剂浓度是10μM(图5 (b))。此外,如图5 (b)HUVECs扩散,减少与ICG001治疗后(10μ米)的价格相比有限合伙人+塞组。Transwell试验显示迁移HUVECs也抑制了ICG001(数字5 (c)和5 (d))。管形成试验表明,分支点和管形成数量都减少了治疗后ICG001(数字5 (e)- - - - - -5 (g))。这些结果表明,β连环蛋白信号为proangiogenic CFs增强的潜力是非常重要的股票。

4所示。讨论

已经证明,液源自msc可以促进心肌梗死后血管生成,从而改善心脏功能(8]。此外,CFs作为主要细胞proangiogenic属性在扩散阶段后心肌梗死(19]。在我们以前的工作,这是显示液提升fibroblast-to-myofibroblast分化心肌梗死后炎症阶段,发挥心血管效应。在这项研究中,签订监管CFs炎症环境中促进血管生成。Angptl4是与血管生成有关。结合RNA-seq数据,我们发现Angptl4在CFs塞治疗后增加。进一步的研究结果表明,股票也包含Angptl4蛋白质。可能签订了Angptl4慢性疲劳综合症或塞调节Angptl4在CFs的表达,促进血管生成。Angptl4撞倒后在签订和CFs Angptl4 siRNA3, CFs的血管生成潜力下降,表明股票增强通过Angptl4 CFs的proangiogenic潜力。在炎症阶段,促进血管生成可能对心脏功能的恢复有益的影响。

据报道,β连环蛋白参与血管生成(20.]。我们的研究结果建议的表达β连环蛋白在CFs是减少抑制CFs和hucMSCs Angptl4表达式。此外,CFs的proangiogenic能力增强了塞夫是减少的β连环蛋白转录抑制剂ICG001。它已经表明,Angptl4 Spemann组织者的表达非洲爪蟾蜍光滑的胚胎和Wnt拮抗剂作为促进脊索的形成和防止肌肉分化(21]。Angptl4结合钙粘着蛋白11日释放膜结合β连环蛋白加速伤口关闭(14]。然而,Angptl4和之间的交互β连环蛋白没有解释在心肌损伤修复的研究。目前的研究表明,通过Angptl4签订监管CFs促进血管生成。然而,有复杂的细胞群,包括心肌细胞、成纤维细胞、内皮细胞和心肌梗死后炎性细胞在炎症阶段。它们之间的相互作用和proangiogenic潜力已经证明(22]。心肌细胞、巨噬细胞和成纤维细胞分泌蛋白质,股票,或微泡,调节心肌损伤后细胞间的沟通。细胞类型包括Angptl4表达水平的增加,促进血管生成和进一步改善心脏功能,没有被探索。

近年来,塞治疗已经成为焦点在心肌损伤修复,虽然有一些挑战功效和收益率等问题。然而,股票的优点仍有希望。塞药物逐渐达到了临床开发阶段,已经成为下一代的潜在药物输送技术(23]。在这项研究中,我们发现签订监管CFs促进血管生成增加Angptl4表达式或交付Angptl4炎症环境中。我们阐明慢性疲劳综合症的作用在血管生成早期心肌损伤后,可为进一步的研究提供一个新的想法在心肌损伤的修复机制和股票的治疗应用。

5。结论

我们的研究表明,签订监管CFs炎症环境中通过Angptl4促进血管生成。这可能提供实验依据与股票研究或治疗心肌损伤。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者确认他们没有利益冲突。

作者的贡献

JJL表现并分析了实验和写的手稿。XX, SYF RW导致实验试剂和数据分析做准备。HW和WZ提供实验材料。张芯瑜设计和监督。阅读和批准所有的作者都最后的手稿。

确认

这项工作得到了国家自然科学基金(批准号81800270)。