文摘
到目前为止,肝细胞来源于人为多能干细胞(hiPSC)提供了一个潜在的无限资源,为临床应用和药物开发。然而,大多数hiPSC-derived hepatocyte-like从高纯度的内胚层细胞开始分化,这不足以准确复制复杂的监管信号在多个在肝细胞和组织器官形成,从而显示一个不成熟的表型和生存时间短在体外。在这里,我们描述了一个协议来实现对葡萄糖codifferentiation肝细胞和mesoderm-derived nonparenchymal包容BMP4进入肝细胞的分化中,它有一个有利于肝细胞的成熟和寿命的影响在体外。codifferentiation系统显示nonparenchymal细胞肝脏器官形成的重要作用。希望这些肝细胞这里描述提供了一种很有前途的方法在肝脏疾病的治疗。
1。介绍
在过去的几十年里,肝脏疾病不断上升成为全世界死亡和疾病的主要原因之一(1]。肝脏疾病是一个全球性的健康负担,包括超过1.2亿例终末期肝脏疾病,占全世界每年200万人死亡(2]。肝移植是唯一的治疗方法治疗终末期肝脏疾病(3]。目前,细胞疗法治疗肝移植正受到越来越多的关注,包括肝细胞移植、肝组织工程,生物人工肝装置(4]。然而,捐献器官的短缺或肝细胞仍然是一个瓶颈,限制了临床应用。
人类多能干细胞(hiPSCs)有无限的自我更新潜能,代表有前途的细胞来源提供足够的肝细胞(5,6]。然而,大多数的hiPSC-derived肝细胞启动了从高纯度的内胚层分化(DE)没有nonparenchymal细胞(7,8]。众所周知,异形的肝细胞之间的信息交互和nonparenchymal细胞是必不可少的对肝脏功能的开发和维护9,10]。肝星状细胞是主要的维生素A和存放地点是主要贡献者肝脏发展(11]。肝内皮细胞维持肝脏细胞外基质的释放组件刚度的(12]。微分系统缺乏nonparenchymal细胞不概括复杂的信息和肝脏中的cell-matrix交互,这限制了肝细胞成熟(13]。
为了克服这一缺陷,研究模拟肝脏发展结合肝内胚层细胞与内皮细胞和间叶细胞祖细胞,导致肝脏的一代开花如结构改善功能(14]。然而,这些研究同种异体细胞从多个孤立和产后个人仍有严重的局限性,如安全问题,繁琐的操作和细胞间排斥。
因此,需要新的方法来准备hiPSC-derived成熟肝细胞代替主要的肝细胞。这里,我们报道一种协议,它可以引发对葡萄糖的codifferentiation hepatocyte-like细胞和mesoderm-derived nonparenchymal细胞没有任何外源细胞,血清或基因操作。我们模仿肝脏发展通过结合与nonparenchymal细胞肝细胞,导致肝细胞的生成与改进功能。该协议有效地模拟不同细胞的微环境相互作用在肝脏胚胎发育期间,也许促进肝细胞的成熟和长寿。
2。材料和方法
我们跟着吴的方法等。15]。
2.1。细胞培养
人类多能干细胞(hiPSC)加州大学和WD来自广州生物医药与健康研究院、中国科学院。细胞系的通道数量范围从41岁到47岁。人类ESC H1是来自威斯康辛州细胞研究所。的细胞培养板涂层与基底膜基质(BD生物科学)和维护mTeSR™1中(干细胞的技术)。hepatocyte-like启动前的细胞分化,hiPSCs离解成块使用Accutase®方案(Sigma-Aldrich),镀上Matrigel-coated盘子和维护在mTeSR™1中。主要的肝细胞(Lonza) HCM的培养。
2.2。文化和hiPSCs成单层Hepatocyte-Like细胞的分化
当细胞达到40%的融合,mTeSR™1替换为RPMI 1640 (Gibco),含2% B27 -胰岛素(Gibco), 100 ng / mL苯丙酸诺龙(Peprotech),和50 ng / mL Wnt 3为3天(研发系统)。中被替换为IMDM (Procell)与20%击倒血清替代(Gibco), 1% GlutaMAX™补充(Gibco), 1%二甲亚砜(DMSO) (Sigma-Aldrich), 1%不重要的氨基酸(NEAA) (Gibco)和0.1毫米β巯基乙醇(β加)(Sigma-Aldrich) 4天。接下来,包含1%的文化被安置在IMDM GlutaMAX™补充,20 ng / mL制瘤素M (OSM) (Peprotech), 5 ng / mL碱性纤维母细胞生长因子(bFGF) (Peprotech), 0.5μ地塞米松(Dex) (Sigma-Aldrich),和1% insulin-transferrin-selenium(其)(Sigma-Aldrich) 5天。最后,分化细胞在肝细胞培养基培养(HCM) (Lonza)补充10 ng / mL肝细胞生长因子(HGF) (Peprotech), 0.5μM敏捷,10μM lithocholine酸(LCA) (Sigma-Aldrich) 10μM维生素K2(Sigma-Aldrich)和1%连续培养。
2.3。文化和hiPSCs成Hepatocyte-Like细胞的分化Codifferentiation系统
当细胞密度达到100%,mTeSR™1替换为RPMI 1640包含2% B27 -胰岛素,100 ng / mL苯丙酸诺龙,20 ng / mL BMP4 (Peprotech) 4天。中被替换,替换IMDM 20%基因敲除血清1% GlutaMAX™补充,1% DMSO NEAA 1%, 0.1毫米β加了5天。下面的步骤是一样的单层hepatocyte-like细胞。
2.4。文化和hiPSCs成Hepatocyte-Like细胞的分化优化Codifferentiation系统
当细胞达到100%的融合,mTeSR™1替换为RPMI 1640包含2% B27 -胰岛素,100 ng / mL苯丙酸诺龙,20 ng / mL BMP4 4天。中被替换为RPMI 1640包含2% B27 (Gibco), 30 ng / mL FGF4 (Peprotech)和20 ng / mL BMP2 (Peprotech) 5天。接下来,文化被安置在RPMI 1640包含2% B27, 20 ng / mL HGF, 20 ng / mL KGF (Peprotech)和进一步的培养5天。最后,分化的细胞培养与10 ng / mL OSM HCM补充和0.1μM敏捷连续培养。
2.5。碱性磷酸酶染色
碱性磷酸酶染色的hiPSCs是实现碱性磷酸酶检测设备(微孔,SCR004)。
2.6。免疫荧光分析
细胞被固定为4%多聚甲醛(PFA) (Sangon生物技术)在室温下20分钟(RT)、阻塞和permeabilized驴血清(杰克逊实验室),5%和0.3% triton x - 100 (Sigma-Aldrich)磷酸盐(PBS) (Solarbio) RT对1 h。细胞被洗3次与PBS每一步之间在RT为5分钟。接下来,这些细胞被孵化主要驴血清抗体在3%和0.3% triton x - 100一夜之间在4°C和二次抗体在1%驴血清1 h RT。最后,DAPI (Sigma-Aldrich)是用于染色细胞的细胞核。细胞与PBS洗4次5分钟后在RT中小学抗体和DAPI染色。免疫荧光图像都是获得使用徕卡Dmi8倒置显微镜。拉斯维加斯X软件(莱卡)是用于图像处理。使用的初级和二级抗体的完整列表中提供了补充材料(见补充2)。
2.7。流式细胞术
样本孵化Accutase / Trypsin-EDTA解决方案(Sigma-Aldrich) 37°C,直到细胞开始分裂。细胞被离心机和resuspended 4% PFA RT 15分钟和离心机resuspended与细胞内染色透化作用洗4次缓冲区(BioLegend) 5分钟在RT,细胞培养主要抗体在一夜之间4°C和二级抗体RT 1 h。结果分析了使用FACSCalibur流式细胞分析仪(BD生物科学)和加工使用FlowJo VX。
2.8。RNA提取和定量PCR
从细胞总rna分离试剂盒™试剂(表达载体)。互补脱氧核糖核酸的合成,1μ克总rna用PrimeScript RT试剂盒gDNA橡皮擦(豆类)。定量PCR进行结核病绿色预混料交货Taq II(豆类)使用LightCycler 480 II(罗氏)。相对量化进行标准曲线,看家基因和值归一化,和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。引物列出用于补充材料(见补充2)。
2.9。油红O和周期性Acid-Schiff染色
油红O(奥罗)和周期性acid-Schiff (PAS)(所有从Solarbio)染色进行按照制造商的指示。
2.10。细胞摄取和释放吲哚菁绿
细胞被孵化1毫克/毫升吲哚菁绿(ICG) (Sigma-Aldrich)在37°C 6 h。中包含协调小组被丢弃,PBS的细胞被洗。接下来,使用显微镜细胞吸收协调小组的检查。细胞终于回到了培养基和培养进一步12 h 37°C决定释放细胞协调小组。
2.11。衰老β加染色
文化被固定为4% PFA RT 20分钟,然后β加染色(手机信号)进行按照制造商的指示。
2.12。TUNEL染色
这些细胞被固定为4% PFA RT 30分钟,然后用TUNEL染色(Beyotime)根据制造商的指示。
2.13。AAT和铝青铜化验
人类alpha1-antitrypsin (AAT)和白蛋白(铝青铜)生产用ELISA试剂盒检测(Elabscience)按照制造商的指示。细胞培养24小时的新媒介,随后,细胞上清液收集在不同的时间点和分析白蛋白分泌。细胞使胰蛋白酶化和计算使用血细胞计数器或细胞溶解的蛋白质含量测定用BCA蛋白质分析工具包(Beyotime)。发光测量用光度计(GloMax发现,Promega)。
3所示。结果
3.1。筛选最优培养基hiPSC-Derived肝细胞的维护
2017年,王等人报道一个优雅的协议健壮和高效的一代的肝细胞来源于hiPSCs使用serum-free-based过程(16]。该协议通过强度的方法来生成hiPSC-derived肝细胞和概述图顺序形态学变化1(一)并补充图2。
(一)
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(c)
(d)
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(f)
(g)
(h)
(我)
重要的是为特定的应用程序选择最优媒介生成功能成熟肝细胞。五商业媒体相比,最近的研究表明,肝细胞培养基(HCM)是最适合培养主要人类肝细胞(17]。为了获得更好的文化条件改善肝细胞功能和延长生存在体外,我们首先HCM相比原始协议(Hepato病菌,HZM)在成熟阶段。
干细胞的多能性是一个重要的先决条件,以确保他们的定向分化。分化之前,我们检查了多能性的hiPSCs第0天通过流式细胞术和细胞免疫荧光,发现超过90%的coexpressed多能标记(OCT4、NANOG或SSEA4)(数据1 (b)和1 (c))。来验证我们的结果的准确性,我们使用hiPSC-UC, hiPSC-WD, H1(数据未显示)细胞系的研究(补充图1模拟)。
HiPSC-derived hepatoblasts(12天)是培养与分化期间HZM或HCM媒体直到30天。肝细胞的基因表达水平标记(HNF4α,法新社,CK18,AAT,CYP3A4,铝青铜)hiPSC-derived肝细胞明显增加了使用HCM HZM相比(图1 (d),补充图2 b)。免疫荧光结果显示coexpression型号蛋白质(法新社,铝青铜,CYP3A4, CYP2D6、适应型,HNF4α在25天,CK18)(数据1 (e)和1 (f),补充图2摄氏度)。这些结果表明,HCM可能更适合维护hiPSC-derived肝细胞。
随后,我们分析了肝细胞功能培养HCM或HZM媒体通过周期性acid-Schiff (PAS),油红O(奥罗)和吲哚菁绿(ICG)染色在25天(图1 (g),补充图1E,二维)。HCM组更多的脂质滴,在肝细胞糖原累积,这表明一个更好的脂质代谢和糖原合成能力比HZM组。同时,肝细胞培养的HCM中协调小组吸收和释放能力高于HZM组。ELISA试验表明,分泌铝青铜的数量和AAT更强烈HCM组(补充图2 e)。
检查在antisenescence HCM的角色,我们执行β在苏格兰哈里法克斯银行加染色。相差和染色图像显示更好的形态和更少β-Gal-positive细胞HCM组比HZM组肝细胞在天35到45天(数字1 (h)和1(我),补充图1F)。
总之,HCM中更适合维持肝细胞的功能源于hiPSCs通过比较与原差异化协议。因此,HCM随后被选为媒介培养肝细胞在成熟阶段。
3.2。Codifferentiation Nonparenchymal以及肝细胞细胞
切换到HCM中显著提高肝细胞功能和存活时间比原始的差异化协议;然而,我们仍然希望通过模拟肝脏发展实现新突破的过程在活的有机体内。组成的人类肝脏实质细胞(肝细胞和cholangiocytes)和nonparenchymal细胞(内皮细胞、枯氏细胞、肝星状细胞和肝脏居民和浸润淋巴细胞),来自不同细菌层(11]。肝脏的最早阶段发展取决于内胚层的上皮细胞之间的信号的精心编排,间叶细胞,内皮祖细胞(18]。我们希望优化内胚层介质,因此保留中胚层的承诺的一部分。BMP4已经应用到各种各样的内皮细胞的诱导19,20.]。我们假设取代肌动蛋白在内胚层BMP4介质将允许多重细胞codifferentiation。我们修改感应协议和图中顺序形态学变化2(一个),补充图3。随后,我们利用q-PCR和免疫荧光分析检查中胚层是否保留在内胚层的阶段。令人吃惊的是,细胞与BMP4基因治疗显示强劲upregulation内胚层(FOXA2和SOX17)和中胚层(T,EVX1,元,MIXL1)(图2 (b))。在第四天免疫荧光显示,大多数细胞表达DE标记FOXA2 SOX17,一小部分的表达中胚层细胞标记T(图2 (c))。T BMP4-treated组阳性细胞的数量明显超过Wnt3a-treated组(图2 (d))。这一结果表明,添加BMP4达到codifferentiation的中胚层和内胚层。
(一)
(b)
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(e)
(f)
我们还发现通过q-RCR mesodermal-derived细胞是否伴随着肝细胞分化和免疫荧光分析。q-RCR结果表明,内皮细胞标记物的表达(CD34,CD31,ALCAM,肌间线蛋白)逐渐增加,他们的表达水平更高BMP4-treated组肝细胞分化(图2 (e))。类似的结果是获得在另一个细胞系,iPSC-WD(补充图3 b)。免疫荧光显示,内皮细胞(肌间线蛋白-和αSMA-positive细胞)在肝细胞出现在BMP4-induced条件阶段(图2 (f),补充图3 d)。
总之,我们的结果表明,BMP4添加内胚层中可能保留的一部分中胚层细胞,可以分化肝细胞。然而,目前尚不清楚这些内皮细胞促进肝细胞成熟。
3.3。肝细胞功能测定肝细胞和细胞Nonparenchymal Codifferentiation之后
确认是否mesoendodermal codifferentiation能促进肝细胞的成熟,我们分析了信使rna和蛋白质水平的标记基因在肝细胞分化。q-PCR结果表明hepatocyte-associated基因的表达水平显著增加的时间分化仍在继续。更重要的是,的表达水平铝青铜,AAT,法新社,HNF4α,CYP3A4在BMP4-treated组相比显著增加Wnt3a-treated在分化(图3(一个),补充图3 c)。结果也证实了免疫荧光在25天(数字3 (b)和3 (c))。这些结果表明,mesoendodermal codifferentiation可以促进肝细胞成熟。
(一)
(b)
(c)
(d)
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(g)
(h)
为进一步验证这些结果,我们对肝细胞功能进行分析。都不是,奥罗,协调小组染色显示BMP4治疗表现出更好的函数相比Wnt3a-treated组天25(数字3 (d)和3 (e),补充图3 e)。这一结果表明,BMP4诱导的肝细胞更快的成熟也可能导致更快的衰老。亮视场图像显示BMP4-treated细胞逐渐失去它的多边形形态和核质比例很高,这是在天35 - 45(肝细胞衰老的一个重要标志21]。相位对比染色画面显示更少β加+细胞群Wnt3a组比BMP4组肝细胞在分化(数字3 (f)和3 (g))。进一步比较两个诱导条件下的肝功能,铝青铜的分泌和AAT被ELISA检测(图3 (h))。值得注意的是,BMP4协议引起的肝细胞分泌的能力铝青铜和AAT高于Wnt3a协议。
总之,添加BMP4的内胚层中允许mesoendodermal codifferentiation。该协议通过多细胞codifferentiation有效地促进肝细胞的成熟。然而,BMP4-induced肝细胞表现出更快的衰老。因此,仍然需要进一步的努力来获得肝细胞成熟度高,存活时间长在体外。
3.4。优化BMP4-Treated差异化协议大大促进Nonparenchymal细胞生产
为了获得更多的功能性肝细胞存活时间更长,我们进一步优化原始BMP4差异化协议。众所周知,肝脏来源于内胚层胚芽层。优化和规范最早的分化的步骤,这是明确的内胚层(DE),对生成肝细胞(非常重要22,23]。我们假设BMP4-treated组肝细胞的成熟是劣质Wnt3a-treated集团,这可能是由于短期I期和II期。因此,我们也做了调整的刺激时间I期和II期。
优化感应协议和顺序形态变化在分化每天0到30图所示4(一)并补充图4。q-PCR分析表明,细胞BMP4优化感应介质有较高的表达水平的mesoderm-related基因(肌间线蛋白,CD31,CD34,ALCAM,HGF)比原始介质在肝细胞分化(图4 (b),补充图4 b)。免疫荧光检测显示,细胞表达nonparenchymal标记在14到25天(数字4 (c)和4 (d),补充图4 d)。免疫荧光结果显示血管成熟标志的表达(CD31)在分化协议(数字4 (e)和4 (f))。
(一)
(b)
(c)
(d)
(e)
(f)
3.5。BMP4差异化协议的优化大大促进肝细胞功能
确认是否优化诱导肝细胞协议表现出更好的肝功能,我们对基因和蛋白质含量在分化。q-PCR结果表明,在优化中表达更高的肝脏肝细胞诱导成熟基因(铝青铜,AAT,HNF4α,CYP3A4,法新社原始介质(图相比)5(一个),补充图4摄氏度)。免疫荧光显示,肝细胞都表示肝成熟标志培养BMP4或BMP4-optimized协议在25天(数字5 (b)- - - - - -5 (d))。
(一)
(b)
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为了进一步验证这一结果,我们在肝细胞的功能进行分析。BMP4-optimized组,脂滴和糖原合成能力比BMP4组。协调小组染色结果还显示肝细胞培养在BMP4-optimized媒介组织吸收和释放能力高于BMP4组。这一结果表明,肝细胞表现出更好的接受了BMP4-optimized治疗肝细胞功能相比BMP4组(数字5 (e)和5 (f)并补充图4 e)。相位对比染色画面显示更少β加+优化组的细胞比原来BMP4组肝细胞在分化(数字5 (g)和5 (h))。这些结果进一步证实了亮视场图像和TUNEL染色(补充图5)。肝细胞诱导优化中仍有脂类的代谢能力65天(图5(我))。免疫荧光试验表明,肝细胞在这个时候仍然表示铝青铜和CYP3A4(图5 (j))。描述肝细胞的功能在不同的文化条件下,铝青铜和AAT分泌肝细胞,ELISA检测的能力。结果表明,铝青铜和AAT的肝细胞分泌能力BMP4优化组显著高于BMP4组(图5 (k))。
w ?结论>,我们优化肝细胞分化培养基,使实现mesoendodermal细胞codifferentiation,也可以促进肝细胞功能的成熟和延长存活时间在体外。
4所示。讨论
的肝细胞来源于hiPSCs开辟了新途径在再生医学领域,包括自体的细胞疗法,并为药物开发提供机会和疾病机制的研究8]。hiPSC-derived肝细胞的一个主要缺点是他们减少表型成熟度较低的肝脏特异性酶活性与人类原发性肝细胞(24]。这有限的成熟度已经限制他们的效用在药物开发和研究疾病的机制。为了弥补这些不足,许多种类的在体外文化用于肝细胞分化已报告的协议。
Takebe等人报道,在2013年第一个3 d肝脏芽瀑样通过混合iPSC-derived肝细胞,与人类脐cord-derived脐静脉内皮细胞和msc 5: 4: 1比率[25]。3 d肝脏芽瀑样由三种类型的细胞自组装和连接到主机血管系统形成功能性血管化后移植到主机。歌等人cocultured人类脂肪微血管内皮细胞与hiPSC 1: 3比例,最终获得较高的肝细胞特定的基因表达和更好的肝功能在体外,移植到小鼠长白蛋白分泌(17]。这些报告证明了细胞间相互作用的重要作用和肝脏分化信号,同时强调模仿肝脏的生理微环境的重要性在胚胎发育期间。值得注意的是,尽管多细胞codifferentiation对肝细胞有一个有前途的贡献,引入外源细胞在这一过程中可能导致的免疫排斥反应。此外,某些细胞类型用于多细胞codifferentiation更困难的文化,如肝星状细胞。还有另一个最近的研究工程广泛Gata6多能细胞群表达水平,通过引导其分化成非均匀组织和检测肝脏开花如结构包含基质细胞、血管的管状结构和haematopoiesis-like过程(26,27]。过表达Gata6所产生的组织在本质上是胚胎,而进一步成熟在或体外将需要实现的全部功能成人器官(26]。然而,这些研究人为组合来自多个个人和转基因的细胞分离脉搏的蛋白质表达,暗示严重限制移植应用程序根据这些策略。
实现与长期或永久性功能和移植肝细胞,更需要改进的协议,可以完全摆脱异物反应或成为血管功能。最近,根据公布的单层肝细胞分化协议(16),我们调查的影响两个肝细胞培养基(HZM和HCM)在肝细胞的成熟阶段。结果表明,HCM中提高hiPSC-derived肝细胞的成熟和功能特性。众所周知,BMP4的生成需要多能干细胞中胚层祖人口从人类的ESCs [28]。因此,BMP4广泛应用于肝nonparenchymal细胞的分化(19,20.,29日]。为了模拟肝脏的胚胎发育,我们使用BMP4的早期分化的协议。这导致codifferentiation endodermal-derived肝细胞与mesodermal-derived nonparenchymal细胞,如肝星状细胞和血管内皮细胞。不幸的是,这种方法得到的肝细胞太成熟有更长的寿命。随后,我们进一步优化codifferentiation协议为每个阶段和调整刺激的持续时间。因此,肝细胞有显著改善他们的成熟度和延长他们的寿命,从而维持肝功能至少65天。
总之,我们已经成功地开发了与肝细胞和mesodermal-nonparenchymal细胞对葡萄糖codifferentiation系统,这可能会提高肝细胞的成熟。协调行动,共同分泌的信号可能会加强分化肝细胞的成熟和功能性质。然而,肝细胞功能增强的机制仍然是未知的,需要进一步的研究。
数据可用性
使用的数据来支持本研究的结果包括在本文中。
的利益冲突
作者宣称没有利益冲突。
作者的贡献
Anlong徐、吴Fenfang构思研究设计项目,修订后的手稿。应施和秦文君邓小平进行了实验,分析数据,并写了手稿。Xiaopu唱歌和王Yihang q-PCR参与讨论和分析数据。范他和陈Xiaoni很多工作在语言编辑和修改手稿。所有作者阅读和批准最终的手稿。Fenfang吴邦国委员长和Anlong徐获得资金和研究监督。
确认
这项研究得到了国家自然科学基金(82172107)、广东省自然科学基金(2020年2020 a1515011314 2021 a1515011927, b121206003),自然科学基金(JCYJ20190807101401682和JCYJ20210324135014040)深圳城市,该地区重点实验室基金的深圳市龙岗区(LGKCZSYS2019000051)和北京中医药大学基础肝病,深圳医院(2020 - bucmszylrc04)。
补充材料
补充1。补充图1:我们分析了hiPSCs的多能性(hiPSC-UC和hiPSC-WD),发现几乎所有的细胞碱性磷酸酶染色阳性(补充图1)。我们还研究了两种类型的多能性hiPSCs在第0天通过流式细胞术和细胞发现,超过90% coexpressed SSEA4和交易——1 - 81(补充图1 b, C)。这一结果证实了免疫荧光(补充图1 d)。奥罗的统计,私人助理,协调小组表明,在HCM培养基培养肝细胞的功能更强比HZM介质(补充图1 e)。和观测数据表明,HCM组显著减慢衰老的肝细胞(补充图1 f)。补充图2。来验证我们的发现,我们使用hiPSC-WD进行额外的实验研究。肝细胞诱导和顺序形态学变化的示意图是补充图2中列出。肝细胞的基因表达水平标记(法新社,铝青铜,CK18,AAT,HNF4α,CYP3A4)hiPSC-WD derived-hepatocytes相比明显增加了使用HCM HZM(补充图2 b)。免疫荧光结果显示coexpression型号蛋白质(法新社、铝青铜和CYP3A4)在25天(补充图2 c)。提出Sebsquently,我们还利用hiPSC-WD密封环HCM的培养肝细胞功能或HZM媒体通过周期性acid-Schiff (PAS),油红O(奥罗)和吲哚菁绿(ICG)染色在天25(补充图2 d)。ELISA显示的分泌量铝青铜和AAT更强烈HCM组(补充图2 e)。这些结果也表明,HCM可能更适合维护hiPSC-derived肝细胞。补充图3:我们BMP4感应协议生成hiPSC-WD-derived肝细胞和顺序图3中补充一个形态学变化。我们还发现通过q-RCR mesodermal-derived细胞是否伴随着肝细胞分化和免疫荧光分析。q-RCR结果表明,内皮细胞标记物的表达(ALCAM,肌间线蛋白,HGF,CD34,CD31)和肝细胞制造商(法新社,铝青铜,AAT,HNF4α,CK18)逐渐增加,他们的表达水平更高Wnt3a-treated组在肝细胞分化(补充图3 b, C)。免疫荧光显示,内皮细胞(Desmin-positive细胞)出现在两个Wnt3a——在肝细胞阶段和BMP4-induced条件(补充图3 d)。比较的生活功能two-differentiation协议,协调小组,不是,奥罗染色进行30天的肝细胞。我们的研究结果表明,协调小组,不是,奥罗染色BMP4组显著高于Wnt3a集团(补充图3 e)。补充图4:我们BMP4-optimized感应协议生成hiPSC-WD-derived肝细胞和顺序形态学变化是补充图4中列出。我们还发现通过q-RCR mesodermal-derived细胞是否伴随着肝细胞分化和免疫荧光分析。q-RCR结果表明,内皮细胞标记物的表达(ALCAM,肌间线蛋白,HGF,CD34,CD31)和肝细胞制造商(法新社,铝青铜,AAT,HNF4α,CK18)逐渐增加,他们的表达水平更高BMP4-optimized组在肝细胞分化(补充图4 b, C)。免疫荧光显示,内皮细胞(Desmin-positive细胞)在场BMP4和BMP4-optimized诱导肝细胞阶段的条件(补充图4 d)。比较的生活功能two-differentiation协议,协调小组,不是,奥罗染色进行30天的肝细胞。我们的研究结果表明,协调小组,不是和奥罗染色BMP4-optimized组明显强于BMP4组。补充图5:亮视场图像表明,BMP4协议引起的肝细胞逐渐失去它的多边形形态在40 - 60天(补充图5 a)。代表TUNEL染色图像显示更少的染色细胞相对于BMP4 BMP4-optimized组50天(补充图5 b)。
补充2。补充材料。使用的初级和二级抗体的完整列表中提供了补充材料(表S1)。引物列出用于补充材料(表S2)。