文摘

抗血管新生治疗因子(vegf)是导致治疗视网膜静脉阻塞(RVO),间充质基质细胞(msc)介导治疗限制眼睛退化。本研究的目的是确定脂肪msc的影响(对asc)结合人们的抗vegf在RVO化合物诱导的动物模型。硫醇盐壳聚糖纳米粒子(NPs) (ThioCHI)与封装抗vegf抗体准备。对asc是孤立的和绿色荧光GFP转基因分泌。24新西兰兔分为I-IV等于后组:对asc,对asc + nanoThioCHI-anti-VEGF RVO,和控制。RVO感应,团体》获得intravitreal (iv)注射MEK激酶抑制剂,PD0325901。12天后,治疗兵团被管理在组织i ii组iii iv收到BSS。两周后,视网膜损伤评估通过详细的眼科检查,固定视网膜组织学分析部分,ELISA外周血或玻璃液的分泌细胞因子,和Q-PCR闭塞和炎症相关基因的表达。轻微的视网膜水肿和出血、视网膜脱离有限、和脉管系统衰减观察组I和II相比,第三组的病理症状呈现一个完全杂乱无章的视网膜结构,积极的免疫染色后对新血管形成和相关RVO标记。重要的减少炎性细胞因子的分泌水平高是量化一组I和II玻璃液,而RVO-related和炎症基因的表达明显减少特别是在第二组。 GFP+ ASCs, capable of being differentiated towards neural progenitors, detected in dissociated retina tissues of group II presenting their attachment to damaged area. Conclusively, a stem cell-based therapy for RVO is proposed, accompanied by sustained release of anti-VEGF, in order to combine the paracrine action of ASCs and the progressive reduction of neovascularization.

1。介绍

视网膜静脉阻塞(RVO)是第二大原因后视网膜血管疾病的糖尿病性视网膜病变(DR) (1]。RVO广泛接受有两种类型:视网膜中央静脉阻塞(CRVO),视网膜中央静脉时受到影响,和视网膜分支静脉阻塞(BRVO),当任何分支的视网膜中央静脉闭塞。BRVO报道比CRVO[三倍2]。RVO患者视力丧失的潜在机制包括视网膜缺血和黄斑水肿(3]。眼科视网膜血管疾病构成的一个主要医疗保健问题由于毁灭性影响的视觉性能受影响的个人,从而排除他们执行他们的日常活动,导致严重降低他们的生活质量(QoL) (4- - - - - -6]。

早期诊断视网膜异常相关RVO基本临床结果的影响。微血管变化在表面和深视网膜毛细血管网络,如视网膜中央凹parafoveal血管密度,减少毛细血管充血和毛细管扩张,微动脉瘤nonperfusion区域,形成抵押船舶可以检测到在视网膜静脉遮挡使用光学相干血管造影术(八面体)7]。Swept-source光学相干断层扫描血管造影(SS-OCTA)找到了更精确的定义领域的最大缺血性损伤后RVO眼底荧光素血管造影(FFA)相比,因此代表了一个重要的诊断设备在预测可视化的结果(8]。

关于当前的治疗方法RVO, intravitreal注射antivascular内皮生长因子(vegf)代理RVO患者常用的改善临床结果(9]。也有越来越多的证据支持使用intravitreal地塞米松植入视网膜血管疾病患者,尤其是在那些有黄斑水肿,以牺牲海拔在眼压和白内障进展甚至形成副作用通常与类固醇(3,10- - - - - -14]。此外,严重的副作用的抗vegf intravitreal注射包括眼内炎和视网膜脱离和重复注射后观察到一些眼睛成为耐火材料是强大的缺点使这种类型的治疗部分有效(15]。

能够连续的输送系统和长期释放抗vegf可能克服上述限制。

纳米粒子已被广泛用于药物输送系统由于能够有效地交付注册物质与病人减少副作用。大多数研究聚合物在多个应用程序之一是壳聚糖,由于它的属性,如生物相容性,生物降解性、低毒性(16- - - - - -18]。mucoadhesiveness的增加与修改后的结构可以实现添加的巯基共同充当细胞受体能够促进细胞粘附、增殖和分化19- - - - - -21]。抗体从壳聚糖纳米粒子构成的交付新领域的使用使聚合物的作用更加重要。考虑所有的前面所提到的,我们最近开发出一种新颖的nanocarrier,硫醇盐壳聚糖的构造,能够逐渐释放抗vegf在细胞培养(至少一个星期22]。

间充质基质细胞(msc)和相关组件由另一个前景看好的方法几个眼睛疾病,特别是RVO治疗特别是由于他们的旁分泌作用使神经节细胞的保护限制进一步退化的眼睛23- - - - - -27]。msc目前神经退化影响视网膜细胞,这可能是与延缓甚至阻止不受控制的细胞死亡(28,29日]。

脂肪间充质基质细胞(对asc)可以很容易地分离后的在抽脂手术。大多数的干细胞,对asc高增殖能力,他们能够对从其他生殖细胞分化层,如神经和视网膜细胞(30.,31日]。此外,对asc可以执行他们的旁分泌作用分泌许多细胞因子和生长因子直接或在外来体释放为了执行受损组织的再生32]。上述所有,使对asc适当的几个视网膜病变的细胞治疗产品。几个临床试验的结果表明,一些病人对asc intravitreal移植的人类经验的密集的玻璃体出血和增生性玻璃体视网膜脱落后的后续发展(PVR)。这些也与手术相关的并发症,对asc的潜在机制的行动注入后,移植的时候,或接种细胞的数量和常数研究仍然是一个重要的问题33,34]。这些细胞易于获取和准备使临床医生和研究人员他们的应用程序非常有吸引力。

抑制剂MEK 1/2 PD0325901或N - [(2 r) 2, 3-dihydroxypropoxy] 3 4-difluoro-2 - ((2-fluoro-4-iodophenyl)氨基)苯甲酰胺)已经广泛应用于固体肿瘤的治疗。然而,一个主要的消极结果报告的所有注册临床试验使用PD0325901 RVO的生产所有的外观的主要临床症状的疾病。利用这种副作用,研究人员已经开发出一种体内模型,通过应用intravitreal RVO注射的抑制剂Dutch-Belted兔子35]。尽管存在一些动物模型,容易诱发动物模型的发展RVO仍需要改善当前RVO的发病机制的理解,以及识别更多的临床有效和具有成本效益的治疗选择(36]。

基于上述,本研究的目的是确定的影响对asc intravitreal管理结合封装vegf在硫醇盐壳聚糖人们(nanoThioCHI) polyparametrically特征PD0325901-mediated RVO诱导动物模型。

2。方法

2.1。研究批准

所有程序都是经当地伦理委员会批准亚里士多德大学的塞萨洛尼基(4.296 4/26.1.2021),以及委员会的兽医部门塞萨洛尼基(661411(2802)/ 3.12.2020)和符合下午声明使用动物眼科和视觉研究和欧洲社区理事会指令(86/609 / EEC)。

2.2。隔离、扩张和特征对asc的兔子

6个月大的新西兰兔3.5 - 4公斤与0.08 - -0.1毫克/公斤b.w. dexmedetomidine麻醉(Dexdomitor,海勒斯Zoetis)和15毫克/公斤b.w.氯胺酮(Imalgene 1000,梅里亚,法国)肌内。Τ他获得了腹股沟脂肪垫,清洗和磷酸盐(PBS;擤鼻涕),剁碎和0.5毫克/毫升胶原酶消化1型(σ)1 h在37°C与不断的颤抖。PBS是补充说,30分钟后,不同的中间层含有msc是吸气和600×g离心10分钟。细胞颗粒在杜尔贝科修改鹰的介质(resuspended DMEM;擤鼻涕)补充5%胎牛血清(的边后卫;擤鼻涕)和1% penicillin-streptomycin (pen-strep;σ),细胞培养至80% confluency 75厘米²组织培养瓶在孵化器37°C和5%二氧化碳37]。章节2和3之间,通过流式细胞仪对细胞特征与单克隆抗体染色CD105 / CD73-phycoerythrin (PE)和CD90 / CD44-fluorescein (FITC) (EXBIO)。,正欲BD FACSCalibur (BD)流式细胞分析仪和CellQuest Pro6软件被用于结果分析。

测试对asc的分化能力,适当的介质(Gibco)诱导分化向骨细胞,脂肪细胞,软骨细胞在文化添加了25 - 30天伴随着媒体改变每2 - 3天。成功的分化与茜素红,估计石油红色,和阿尔新蓝染色,分别根据每个分化培养基制造商的指示。

2.3。对asc的基因改造

在通道4日1.510⁵细胞暴露在10μ克质粒DNA-SB100X转座酶和pT2-Venus-neo转座子表达质粒(1:10比例),electroporated根据制造商的指示(Lonza)。细胞被镀在6-well板的一个良好的DMEM完全confluency中直到达到90%,而100毫克/毫升G418 (InvivoGen)添加对asc转基因的选择。细胞被孵化37°C的5%二氧化碳和受到媒体改变每2 - 3天。成功修改与荧光显微镜评估HBO 50水银灯以及反射荧光滤光片(激发488海里,发射509 nm)和荧光Lite AxioVision勒(卡尔蔡司)的软件模块。流式细胞术进行确定的比例对asc遗传改良。

2.4。硫醇盐的制备壳聚糖(ThioCHI) NPs含有抗vegf和表征

ThioCHI含有抗vegf纳米颗粒是由离子凝胶技术就像先前描述(21,22]。200毫克的ThioCHI溶解在25毫升的醋酸溶液和1% 在浓度。TPP水溶液2毫克/毫升的浓度、体积和25毫升ThioCHI溶液中添加一滴一滴地连续下磁力搅拌,最后比ThioCHI / TPP 4/1。50μ克抗vegf是分散在水和添加到解决方案之前加入TPP的解决方案,当pH值立即调整 后正确的解决方案。总解决方案离开在磁搅拌4小时和纳米颗粒形成,由于TPP和ThioCHI之间发生相互作用,被冻干孤立。纳米粒子准备通过SEM形貌和表面由DLS的大小和潜力。

扫描电子显微镜(SEM)图像得到JEOL 2011电子显微镜(日本东京JEOL有限公司)。准备的纳米颗粒被涂上一层碳,和图片收集通过应用加速电压20 kV,调查当前45 nA, 60年代和计算时间。EDX分析也执行。

2.5。估计NanoThioCHI-anti-VEGF细胞毒性的影响

为了评估对asc nanoThioCHI-anti-VEGF的细胞毒性的影响,在增强NPs浓度对asc coculture后48 h,细胞上清液,和MTT反应物(3 - (4 5-dimethylthiazol-2-yl) 2、溴化5-diphenyltetrazolium)(σ)是在一个比1:10在培养基4 h孵化37°C C的5%Ο2。删除MTT, 200μ介绍了l / DMSO溶液的一个额外的小时的孵化条件相同。麻省理工的减少计算Victor3TM板读者(PerkinElmer,麻萨诸塞州,美国)在570 - 630海里。

2.6。RVO感应和ASC / NP移植动物模型

24新西兰兔被包括在研究( )。所有兔子重量大约4公斤,6个月大。兔子被保存在一个房间,一个标准的12小时光暗周期,有免费的食物和水。所有动物都适应设施7天前进入实验课程。之前的研究中,一个完整和全面的眼科检查被执行在所有兔子以确保他们没有任何眼部病理条件。

兔子被后随机分为四组:我对asc组( ),集团对asc II + nanoThioCHI-anti-VEGF ( ),第三组RVO ( ),和第四组控制( )。

所有的动物麻醉了dexmedetomidine (Dexdomitor Zoetis海勒斯)0.080 - -0.1毫克/公斤合著。、肌内和氯胺酮(Imalgene 1000,梅里亚,法国)15毫克/公斤合著。,肌内。另外,1 - 2滴局部麻醉(丙美卡因盐酸盐,Alcaine,爱尔康海勒斯实验室)被安装。眼部表面和结膜穹窿接受无菌准备intravitreal注射;他们温和清洗和消毒杀菌的解决方案包含聚乙烯吡咯酮碘水0.5%。眼睛的无菌净化后,27-gauge针插入到midvitreous ~ 3毫米后的异色边缘优越/颞象限。

RVO感应,MEK激酶抑制剂,PD0325901(开曼),是用于浓度计算根据我们cellular-induced RVO模型(细胞毒性试验结果8]。组》intravitreal (iv),注入溶解在BSS(1毫克/眼)PD0325901在100年最后一卷μl /眼了,而在第四组,只有100μl BSS注射。

所有的动物都收到了妥布霉素(Tobrex滴眼剂解决方案,爱尔康海勒斯实验室)术后第一天每6小时,和meloxicam (Metacam、勃林格殷格翰集团、德国)给出3天(0.2毫克/公斤合著。皮下注射,SID)。

12天后,动物收到如下:我, 对asc在0.1μl BSS;第二组, 对asc + 5毫克/毫升vegf nanoThio-CHI NPs;和组iii iv, BSS。donor-derived ASC准备细胞系是脱离塑料表面机械地运用上面轻微抓挠的使用任何酶在政府可能有毒。动物们牺牲了2周后注射。对于安乐死,dexmedetomidine的混合物(0.1毫克/公斤合著。、肌肉)和氯胺酮(15毫克/公斤合著。,intramuscularly) followed by a high dose of iv propofol and potassium chloride was used. Enucleation was performed, and the eye globes were fixed for histopathological analysis or washed in PBS before RNA isolation for molecular analysis.

上述所有之前,飞行员实验目标进行测试的能力PD0325901引起视网膜损伤并确定适当的时间进行干细胞移植。新西兰八兔子被包含在这个初步研究( )这也是委员会批准的兽医部门塞萨洛尼基(632937 (3368),28450 (102)/ 16.01.2019)。四个动物分成两组,在提到的相同条件下麻醉和接收如下:对照组100人μl BSS和组RVO 1毫克/眼PD0325901在100年最后一卷μl。12天后,所有的动物都被牺牲,他们的眼睛地球仪被移除,然后沉浸在10%甲醛进行组织学分析。玻璃液收集分泌因素的量化如下所述。

2.7。临床评价

全面眼科检查是在所有兔子RVO两天后进行归纳,然后每周的随访期间。眼睛的动物在那里进行评估使用便携式裂隙灯生物显微镜(Kowa优化Inc .托兰斯,CA)不透明,intraretinal出血,视网膜脱落、和常见的预期结果,有望揭示组织学检查。

IOP评价,一滴0.5% ALCA快乐(盐酸proparacaine 0.5%)被灌输的眼睛,和电子压平式眼压计(Tonopen兽医)使用。检眼镜检查进行了使用展示全景的检眼镜评价出血,视网膜脱落,瓦解。

2.8。分泌因子量化

外周血收集在抗凝CPD天0,12日和26和离心机16000克,为等离子体隔离5分钟。玻璃液选择穿刺后组织和胰岛素注射器和16 g针后组织删除(图1(一))。在上面的生物样本,促炎细胞因子的分泌水平(白介素6和tnf)、血管内皮生长因子(VEGF)和可溶性内皮细胞蛋白C受体(sEPCR),一个共同的RVO-related标记,测量使用sEPCR ELISA试剂盒(CUSABIO)。

2.9。组织学分析和免疫组织化学

在最后的随访检查,兔子被安乐死。摘出术了,眼睛地球仪沉浸在16 - 24小时10%甲醛37%解决方案然后在一系列梯度酒精脱水方案在接下来的24到48小时之前,石蜡包埋。阻止了穿过整个面向全球的垂直于髓的翅膀。部分5μ米厚切片机是获得的苏木精和伊红染色())和马森的三色的染色,光学显微镜检查。光学显微镜图像拍摄和内在的核层的厚度(INL)和外核层(筒)是测量每500μ从视神经头,只在区域没有全部紊乱视网膜结构。

免疫组织化学的石蜡包埋部分(3μm)进行神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP), 1: 200;σ),ki - 67 (MIB1、克隆TEC-3 1: 20;DAKO)和第八因子(FVIII 1: 800;Abcam)抗体。结合抗体被Dako真正想象可视化检测系统过氧化物酶/轻拍+,并通过光学显微镜幻灯片被研究。均值计算阳性细胞的平均测量五个独立的字段(400 x)。

2.10。实时聚合酶链反应分析

总RNA与眼组织中收集NucleoProtect RNA溶液(MACHEREY-NAGEL)使用RNA隔离Nucleospin RNeasy迷你包(MACHEREY-NAGEL),根据制造商的指示。RNA浓度和纯度分析使用nanodropnd - 1000紫外可见分光光度计。表达式与闭塞(VEGF、组织Apelin Aqp4),炎症(il - 6, Icam IL-1b)和分子途径负责RVO (PROCR Pax6)和再生(GFAP)基因。50 ng的总RNA逆转录和qPCR使用KAPA SYBR®快一步qPCR大师混合(2 x)工具包。使用PCR反应进行循环(转子基因6000)。相对量化确定使用比较C (t)方法和规范化的看家基因GAPDH(3 -磷酸甘油醛脱氢酶)。寡核苷酸序列设计的引物(LabSupplies科学)表中列出1。每个分析点进行了一式三份。

2.11。Transwell制度文化分析

调查的分化能力对asc注入视网膜细胞体外, 对asc被放置在较低的钱伯斯transwell文化系统和附件后通过渗透膜分离(孔隙大小0.4μm;康宁合演)视网膜匀浆(20毫克)来源于RVO和对照组,分别放置在上部腔体。8个小时后coincubation (37°C, 5%二氧化碳),这些细胞被收集,RNA提取,和实时PCR进行为了量化神经标记巢蛋白和GFAP的表达与定制设计引物(表如前所述1)。

2.12。视网膜隔离和Dissociation-Detection与流式细胞术对asc荧光进行有区别的

在显微镜下,肌肉和结缔组织的兔子的眼睛从眼球中删除;眼睛的前部分包括角膜、虹膜,镜头被小心地删除。然后,眼杯从边缘切成4块到视神经头。每一块是认真分析分为三部分:巩膜、视网膜色素上皮(RPE),布鲁赫membrane-choriocapillaris复杂(RBCC),和感觉神经的视网膜用于进一步处理(图1(一))[38]。

单一的视网膜被剁碎,孵化1毫升的消化解决方案(胶原酶类型II-Sigma-8毫克/ gr视网膜)30分钟的37°C。机械磨碎是由吸量30倍每10分钟。在600 g细胞离心,5分钟在4°C,和消化解决办法是删除。这些细胞被轻轻resuspended在700年μl看看包括10%的边后卫,经过70年μm细胞过滤器(39),并分析了立即用流式细胞术与单克隆抗体染色后GFAP-phycoerythrin (PE) (EXBIO)与金星coexpression信号的检测。

2.13。统计分析

学生 - - - - - -测试(未配对,双尾)用于群包括数据的比较 (SD)。时被认为是具有统计学意义的差异 或 。

3所示。结果

3.1。描述对asc和成功的基因改造

对asc在文化扩张后提出一个典型的呈形态(图2(一个)证实了),而他们的典型的间充质immunophenotype流式细胞术高表达的表面标记CD105, CD90, CD44, CD73(图2 (b))。向脂肪细胞分化的能力对asc,骨细胞和软骨细胞被证实与适当的阳性染色后染料(图2 (c))。基因修改对asc表达绿色荧光染料特别是1月后选择GFP +细胞,G418(图2 (d)当转基因细胞的比例大约是97%(图2 (e))。

3.2。NanoThioCHI-anti-VEGF表征和决心的集中管理

SEM照片显示在图2 (f)。可以看出,纳米粒子在表面光滑,但观察集聚应该中和过程中形成。更仔细的观察(图2 (f),右)表明,纳米粒子形成的球形形状大小不同的300至400纳米,而集聚也明显在这张照片。EDX分析显示硫原子的存在(S)主要应该ThioCHI比抗vegf在纳米颗粒由于其低浓度促进其time-controlled释放在注入(图2 (g))。中等浓度的5毫克/毫升准备纳米颗粒被选为政府为了避免高集聚同时低细胞毒性影响对asc coadministered(图2 (h))。

3.3。评价RVO感应

12天后PD0325901 intravitreal注射,代表图像的H&E-stained视网膜出现视网膜感光细胞层的无序和超然,强烈的出血,形成新的血管RVO组与正常视网膜组织相比,没有混乱的迹象(补充图1)。同时,与病理新血管形成相关的分泌水平的量化因子(VEGF)和RVO发展(EPCR)玻璃液显示显著增加确认的成功发展疾病(补充图1 b)。相似的转录水平的变化也验证RVO模型安装(数据未显示)。

3.4。临床评价

该研究的实验设计是呈现在图3(一个)。实验的最后,没有动物严重问题提出操纵的结果,而所有程序发生在完全无菌的条件下(图3 (b))。

第二天,组I, II, III呈现多病灶的或广泛的视网膜出血而温和的和弥漫性视网膜脱落被观察到,在某些情况下,液化的玻璃体。类似的图像观察10天后ASC政府前(12天)。

ASC或ASC + NP注射后10天(22天),第三组还广泛的视网膜出血和脱落,视网膜变性,视网膜血管衰减随着液化的玻璃体。在一个动物,白内障也发达。组I和II没有液化的玻璃体和mild-focal出血。过去临床评估(36天),第三组有几乎相同的外观,而在我几局灶性出血组和第二组没有注意到(图出血3 (c))。兔子眼睛的眼科评估显示在所有组略有IOP升高后第一天注射,但在正常范围内的响应intravitreal注射。然而,无论是PD0325901还是对asc NPs(组合)导致显著增加(图3 (d))。

3.5。在玻璃液分泌因子量化显示成功RVO感应和ASC结合NanoThioCHI-Anti-VEGF有益的影响

成功产生RVO模型确认的检测统计上显著的高水平的分泌VEGF RVO组( )(图4(一))也伴随着增加水平的可溶性EPCR ( )(图4 (b)),在玻璃液。2周后治疗团政府提出,上述因素的分泌水平降低,尤其是对asc + NPs ( VEGF和 EPCR)。VEGF和EPCR水平仍几乎稳定在动物外周血没有显著变化。促炎细胞因子il - 6和TNF -的水平α在玻璃液提出了类似的图像显著增大,损伤反应( il - 6和 肿瘤坏死因子-α)和随后的减少ASC或ASC + NP注射后(数字4 (c)和4 (d))。il - 6分泌水平波动也出现在外周血的增加在RVO感应( )还原后治疗组。

3.6。平动的视网膜组织证实了强烈反应注射

通过qPCR平移概要的分析证实了炎症由于RVO感应与观察了高表达水平的il - 6 ( ),Icam-1 ( ),和IL-1b基因(数据5(一个)和5 (c))。同时,基因RVO VEGF等发展,组织Apelin, PROCR显示,Aqp4表达升高RVO组( , , ,和 ,)(图5 (d)- - - - - -5 (g))。

目标的确定ASC或ASC + NP PD032901-treated动物移植效果,前面提到的所有基因的mRNA水平进行量化(数字5 (d)- - - - - -5 (g))。虽然促炎细胞因子表达是有限的在某些情况下具有统计学意义(il - 6, ASC + NP组;IL-1b, ASC组),所有相关RVO基因显著减少特别是在ASC + NP组(VEGF, ;Aqp4, ;组织Apelin, ;PROCR, )。视网膜修复的启动,涉及细胞再生修复,确认水平高得惊人平移的Pax6和GFAP ASC和ASC + NP组,分别与相应RVO相比水平( , )。

3.7。组织学评估

代表图像H&E-stained视网膜显示视网膜瓦解和超然RVO组相比,绝对正常结构观察对照组尽管BSS注入。multifocal-to-diffuse无序的变性为特征的视网膜层失去细胞核从外部和内部核层和崩溃的感光层(图6(一))。虽然出血性灌注,细胞内水肿,部分神经节细胞层变性仍留在ASC和ASC + NP组,INL厚度,以网站没有显著的超然,是惊人的下降与RVO集团几乎达到正常水平(数字6 (b)和6 (c))。

马森三色的染色还显示视网膜变性和紊乱脉络膜粘附在RVO组和ASC组有限分离观察(图7(一))。折叠视网膜褶皱的形成只有在ASC-administered组可能存在穆勒对asc和小胶质细胞迁移能力的intravitreal注射部位(图7 (b))。

3.8。免疫组织化学观察

GFAP在控制局部视网膜星形胶质细胞和神经节细胞的一些Muller细胞纤维和内网状层几乎呈现负GFAP染色。RVO后在视网膜部分获得感应,Muller细胞纤维染色阳性,因为他们穿透整个视网膜而ASC组GFAP阳性染色也观察到,尤其是在ASC + NP组,显著限制GCL展示层次结构模式的细胞再生干细胞移植(图作为响应8(一个))。增广mRNA GFAP的水平,从qPCR描述,结合免疫组织化学结果对asc的+ NPs可能意味着存在视网膜祖细胞组织再生。这种细胞增殖也证实INL ki - 67阳性染色的ASC和ASC + NP组结合病理限制新血管形成了受伤血管减少血小板浓度(数字8 (b)和8 (c))。所有上述提出的量化为每个抗原阳性细胞的平均和证实组织描述(图的迹象8 (d))。

3.9。管理对asc GFP +在接触中发现视网膜组织能够Transdifferentiated

转基因对asc GFP +成功分离视网膜组织中发现(数字1 (b)和1 (c))表明其与视网膜在政府闭触点,东西也证实的视网膜褶皱形成我们前面描述的特征(图7 (b))。所有视网膜细胞悬浊液表达GFP + 2.4%的平均信号统计上显著的方式( )而对asc并不在玻璃液中发现。同时,与GFAP染色,并且只有在ASC + NP组,证明对ASC的族群(GFP +)同时能够在神经祖细胞分化(GFAP +)可能由于闭触点受伤组织的干细胞可以分泌因素刺激分化(图1 (d))。对asc的体外模拟接触受损组织也导致主要增加GFAP和更少的巢蛋白转化水平和形态变化数据1 (e)和1 (g))。GFAP表达的缺失在ASC组体内表明time-controlled释放抗vegf能促进ASC分化可能由于新血管形成机制,使他们的行动限制。

4所示。讨论

RVO是第五个失明的主要原因与精确的潜在的病理生理学机制和病因需要进一步说明40- - - - - -42]。最近的研究表明,RVO患者生活质量下降相比,提出控制(4];因此,新的诊断设备的正确使用可以导致更好的视觉效果和影响个体的生命质量。光学相干血管造影术(八面体)是一种非侵入性诊断技术,介绍了由于自身的优点,近年来广泛应用在过去的黄金标准荧光素血管造影(FA)。八面体为临床医生提供了depth-resolved图像的视网膜和脉络膜的船只,更好地描述视网膜中央凹无血管区和染料独立性。另一方面,缺乏规范化的病人数据,出土文物投影问题出现,低流量病变或病理条件无法轻易发现这种技术。新八面体平台以适当的算法已经发展为了检测视网膜微脉管系统运行在两个spectral-domain (SD)和swept-source (SS) 10月机7]。Swept-source光学相干断层扫描血管造影(SS-OCTA)也更精确探测的位置和程度最大缺血性侮辱后RVO FFA[相比8]。

抗vegf药物intravitreally注入创新的治疗方法(43],而最近的研究支持使用intravitreal地塞米松植入视网膜血管疾病患者,尤其是在那些有黄斑水肿(3,10- - - - - -14]。小说细胞疗法如msc”应用程序也可能是有用的有利影响这些细胞的旁分泌作用[44,45]。

对asc可以很容易地分离后的程序组织集合,和他们的使用似乎是有前途的。然而,几项研究已经报道重大并发症对asc注入后,离开期间这种治疗方法。Kuriyan等人报道了一系列案件的三个病人intravitreal注射自体对asc的年龄相关性黄斑变性(AMD)不是由美国食品和药物管理局(33]。类似intravitreal干细胞注射在不同的情况下,独立的干细胞诊所用炫目的并发症,包括双边视网膜脱落严重,最近报道(34)而另一个报告文件后视网膜脱离intravitreal脂肪tissue-derived干细胞与手运动视觉(20/50视力丧失46- - - - - -48]。

可能是认为对asc intravitreally注射可能包括自体成纤维细胞或细胞分化成自体成纤维细胞(49]。Intravitreal注入自体成纤维细胞是玻璃体和视网膜脱离的经典动物模型50),可以解释大量的视网膜脱落后intravitreal注入。除了视力与眼内压和视网膜脱离,视力丧失可能开发由于多种因素,包括对视网膜的毒性或视神经造成的注射材料,这可能包括使用的酶制剂(48]。

我们这里管理一个几乎纯化,完全对asc immunophenotypically人口特征,在类似于前面提到的每个眼睛的干细胞数量,准备移植没有酶治疗,以避免消极的结果与前面提到的所有关于手机产品。只有在对ASC + NPs我们惊人的礼物ASC表达能力体内神经标记作为响应与受损组织密切接触。结合这与观察到的明显降低VEGF的含量和EPCR玻璃液转化的il - 6水平有限,VEGF, Aqp4,组织Apelin PROCR基因,我们这里显示的有益影响VEGF首次连续释放对asc的行动。

许多研究已报告使用RVO动物模型。然而,这些之前报道的动物模型有重要的限制,尽管缺乏重要的临床症状展览及激光辐照区域的炎症还包括立即自发(36]。特别是在ASC-mediated治疗的情况下,上述限制是至关重要的考虑到这些细胞的再生潜能所需时间。

黄等人提出了intravitreal PD0325901 Dutch-Belted兔子管理局作为一个可靠的疾病的临床前实验模型(35]。主要临床特征如视网膜血管闭塞和血管出血和泄漏后兔模型中观察PD0325901治疗。在我们的初步研究中,我们表明,12天后PD0325901注入动物呈现典型的视网膜组织学无序特征感光视和显著的出血,其次是提高玻璃液RVO分泌水平的相关因素。成功诱导疾病的进一步研究是至关重要的目标来确定ASC影响安装的损害。本研究的结果表明,转录,平移,组织学水平PD0325901感应可以令人满意地促进该病的发展使得大多数的组织学和分子特征后36天制药感应。这个过程背后的机制还有待阐明。此外,考虑到已经描述的临床研究结果,包括血管渗漏、毛细管损失,视网膜脱离,水肿,视网膜血管衰减在短短8天在PD0325901注入(35],ASC早期治疗方法可以评估。在这项工作中,我们试图评估的影响对asc的早期政府或其结合人们在动物模型适合这一目的。

称,纳米粒子能够成功实现抗血管新生药物持续和靶向型药物控释随后显著增强他们的生物利用度51,52]。聚合物纳米粒子目前有前途的候选人为眼部给药,因为他们是完全可降解的,无毒,容易携带各种类型的药物(53),而壳聚糖已被用作载体抗体交付(54,55]。

基于上述,我们在这里的第一次尝试在活的有机体内,我们的小说vegf nanocarrier壳聚糖改性与硫醇团体目标的增加粘性为本地管理环境有针对性的药物释放。最近描述,nanoThioCHI-anti-VEGF礼物没有细胞毒性影响除了在细胞培养中即使在高浓度时各自的抗vegf nanocarrier能够time-controlled和持续释放药物连续8天(22]。这在体外时间可能会对应一个在活的有机体内时间大于已经称为存在文献[51]。根据这些证据,这项研究表明在活的有机体内结合这个长期释放人们的vegf,限制伴随anti-VEGF-approved药物管理的缺点,由于频繁发生所需的注入,与目标对ASC limited-neovascularization微环境的准备,使ASC有益的效果。

最终,我们在这里提出的结合增加粘性vegf与纯化扩大人们对asc和充分的人口作为一个潜在的治疗方案对RVO和其他相关视网膜变性疾病通过使用一个容易医学induced-RVO动物模型。这个机制必须进一步研究结合积极的结果。

数据可用性

使用的数据来支持本研究的发现可以从相应的作者。

的利益冲突

作者宣称没有利益冲突。

确认

作者感谢Biohellenika S.A.生物科技公司提供设备和耗材,使本研究的完成。这项研究是由希腊和欧盟共同筹资(欧洲社会基金(养)通过操作计划“人力资源开发、教育和终身学习”项目的上下文中“加强人力资源研究潜在的通过博士学位研究”(mis - 5000432),实现由国家奖学金基金会(ΙΚY)。

补充材料

补充图1:(A)代表H&E-stained视网膜呈现的图像:正常视网膜组织没有混乱的迹象对照组()和视网膜感光层的无序和超然,强烈的出血,形成新的血管RVO组(下跌)。(B)与病理新血管形成相关的分泌水平的量化因子(VEGF)和RVO发展(EPCR)玻璃液后12天PD0325901管理。数据表示为 ( ; )。(补充材料)